材料和试剂
27G × 1/2结核菌素syring E（BD，Ç atalog号：305620）
可重复使用的不锈钢点胶针，带鲁尔锁接头，钝头，18号。（麦克马斯特卡尔，Ç atalog号：6710A44）
Dremel旋转工具套件（Dremel，目录号：8220）
鲁尔旋锁注射器1毫升（BD，Ç atalog号：309628）
鲁尔旋锁注射器10毫升（BD，Ç atalog号：302995）
鲁尔旋锁注射器30毫升（BD，Ç atalog号：302832）
培养皿，PS，20分之145毫米（格雷纳生物ø NE，Ç atalog号：639102）
2-0 PERMA-HAND丝线缝合（Ethicon的，Ç atalog号：LA55G）
无菌纱布海绵（Covidien公司，Ç atalog号：2187）
PVDF转移膜（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：88518），存储：RT
Sprague Dawley大鼠（100 - 250克）（Charles River实验室，应变代码：400）
的N- azidoacetylgalactosamine-tetraacylated（AC 4 GalNAz）（点击化学工具，Ç atalog编号：1086），存储：-20℃
二甲亚砜（DMSO）（Fisher Scientific公司，Ç atalog号：BP231-100），存储：室温（RT）
Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS），1 ×不含钙和镁（康宁，Ç atalog号：21-031-CV ），存储：RT
Eagle氏M的Dulbecco改良的edium（DMEM）中（Corning，Ç atalog号：10-013-CV），存储：2-8℃
FetalClone我血清（Cytiva，Ç atalog号：SH30080.03），存储：-20℃
抗生素-抗真菌（100 × ）（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：15240062），存储：-5℃至-20℃
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号：74255），存储：2-8℃
的Triton X-100（Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号码：T8787），存储：RT
磷酸盐缓冲盐水（PBS），20 × （波士顿生物产品，Ç atalog号：BM-220），存储：RT
多聚甲醛（Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号：P6148），存储：2-8℃
点击-IT细胞反应缓冲液试剂盒（Invitrogen，Ç atalog号：C10269），存储：2-6℃下
生物素PEG4-炔（点击化学工具，Ç atalog号：TA105），存储：-20℃
牛血清白蛋白（BSA）（Fisher Scientific公司，Ç atalog号：BP9706100），存储：2-8℃
兔多克隆抗体层粘连蛋白（Novus公司，Ç atalog号：NB300-144），存储：-20℃
链亲和素，Alexa氟647缀合物（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：S21374），存储：-5℃至-30℃，并从光保护
驴抗兔IgG（H + L）二抗，Alexa氟加上488（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：A32790），存储：4℃和避光
DAPI Fluoromount-G（SouthernBiotech，Ç atalog号：0100-20），存储：RT
尿素，超纯，99％（阿法埃莎，Ç atalog号：J65769），存储：RT
HEPES（1 M）（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：15630-080），存储：2-8℃
蛋白酶抑制剂混合物（100 × ）（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：87786），存储：4℃
BCA蛋白测定试剂盒（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：23225），存储：RT
4-15％的Mini-PROTEAN TGX预制蛋白凝胶（Bio-Rad实验室，Ç atalog号：4561085），存储：4℃
的Tris缓冲盐水-吐温（TBST，10 × ，用0.5％Tween-20的，pH为7.4）（波士顿生物产品，Ç atalog号：IBB-181）存储：RT
高灵敏度的链霉亲和素-HRP（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：21130），存储：4℃
的SuperSignal西微微PLUS化学发光底物（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：34580），存储：RT
SYPRO Ruby的蛋白凝胶染色（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：S12000 ），存储：RT
Ac 4 GalNAz注射液（请参阅配方）
控制注射液（请参见配方）
离体培养基（请参阅食谱）
Decell解决方案（请参阅食谱）
2 × Decell解决方案（请参阅食谱）
1 × PBS（pH 7.4）（请参阅食谱）
固定解决方案（请参阅食谱）
生物素-PEG4-炔烃单击反应混合物（请参见食谱）
尿素提取缓冲液（请参见配方）
1 × TBST（pH 7.4）（请参阅食谱）
阻塞缓冲区（请参见配方）
HRP成像混合物（请参阅食谱）

设备

虹膜剪刀，11.5厘米，直（World Precision Instruments，目录号503708-12）
肺动脉（PA）套管（图1）

图1.定制的PA套管。一。图表。套管由顶部鲁尔接头（1/8'，用于与生物反应器连接），中间透明管段（1/8'，用于检测潜在的气泡）和底部弯曲的金属针（18号，用于与PA连接）。使用带打磨盘的Dremel旋转工具在金属针的末端产生一个小侧孔，以避免在插入PA时潜在的灌注阻塞。使用钢丝钳在金属针的尖端周围创建一系列凹槽，以帮助稳定缝合线。乙。套管的实际图像。

斜角肌挤压钳，直，锯齿（世界精密仪器，Ç atalog号：503719-12）
SILASTIC薄壁硅实验室管（道康宁，Ç atalog编号：508-009）
易装泵头2通道的精密泵管（科尔帕默，Ç atalog号：EW-77202-60）
的Masterflex L / S数字精密模块化驱动器与远程I / O和台式控制器（科尔帕默，Ç atalog号：UX-07557-00）
耐高压加热的三通阀（科尔帕默，Ç atalog号：EW-31200-80）
器官培养生物反应器（图2）

图2。器官培养生物反应器。A.在蠕动泵的驱动下，从器官腔中抽出培养基，并通过一系列薄壁硅胶管（用于充氧）将其灌注到插管中，通向培养中的肺PA 。器官腔上的过滤器用于压力平衡。乙。灌注生物反应器的实际图像。

脱细胞室（图3）

图3.去细胞室。A.系统中有两个腔室：储存腔室，其中包含用于脱胶的新鲜溶液；收集腔包含要脱细胞的肺。储液腔应放置在比收集腔高约50厘米的位置，这会产生重力，以驱动流体从储液腔通过PA套管流入肺部。两个腔室上的过滤器均用于压力平衡。乙。脱细胞室的实际图像。

半自动轮转式切片机（Leica Biosystems公司，Ç atalog号：RM2245）
EVOS FL自动2成像系统（赛默飞世尔科技，Ç atalog号：AMAFD2000）
微量仪（Eppendorf，Ç atalog号：5415R）
BeadBug微管混合机（基准科学，Ç atalog号：D1030）
预填充2.0毫升管，用酸洗过的二氧化硅（玻璃）珠，1.0毫米（基准科学，Ç atalog号：D1031-10）
迷你PROTEAN利垂直电泳细胞为小型预制胶，与迷你反式印迹模块（生物- [R广告实验室Ç atalog号：1658036）
ChemiDoc凝胶和Western印迹成像系统（Bio-Rad实验室，Ç atalog号：12003153）
到达式IR CO 2培养箱（Caron，目录号：7400-25-1）

程序

天然器官ECM和肺收获的体内代谢标记
注意：所有动物程序均应按照机构动物护理和使用委员会批准的协议进行。兽医或研究人员应进行咨询和/或培训，他们应具有大鼠腹膜内注射，安乐死，解剖和血管插管的经验。

第一天：

称重大鼠并相应地计算注射量（每克体重0.3毫克Ac 4 GalNAz）。使用以70 mg / ml配制的Ac 4 GalNAz注射溶液，注射量为4.29μl /克体重。对于对照大鼠，每克体重施用4.29μl的对照注射溶液。
通过使用带有27号针头的1 ml注射器腹膜内注射来管理适当体积的Ac 4 GalNAz或对照注射液。
将每个注射的大鼠单独安置在笼子上，并标有注射溶液的类型和注射日期。

第2天，第3天：

再重复两天，重复步骤s A1至A3。

第四天：

通过吸入CO 2牺牲大鼠。使用消毒的外科工具打开胸腔，以暴露心脏和肺部而不会损坏它们。
注：钍是可以用跳动或不跳动的心脏进行的过程。

在靠近肺动脉（PA）的右心室做一个小切口（2-3 mm）作为输液入口，并切开左心耳作为引流出口（图4）。

图4.肺收获过程中的手术程序。PA（蓝色）连接到右心室。在紧邻PA的右心室做一个小切口，以允许将平头针（用于冲洗）或套管插入PA中。在初次冲洗之前，应将左心耳切开作为引流口。

准备一个带有10毫升DPBS的注射器，该注射器连接到18号钝端针上。通过右心室的小切口将平头针轻轻插入PA中，并用镊子将针轻轻地固定在PA中。在大约10秒钟内注入10 ml DPBS，以将剩余的血液冲洗出肺血管。左心耳最初流出的血液是彩色的液体，表示冲洗成功，在整个输注过程中逐渐失去了血液的颜色，整个肺部都变了白色。
注意：对动物实施安乐死后，应尽快执行DPBS冲洗步骤，以避免在肺血管系统中形成血块。

隔离心肺组织，使其与周围组织隔离，然后将其放在用冰冷的DPBS预湿的纱布上的培养皿中。
要插管PA，将定制的插管（图1）连接到预先填充有DPBS的10 ml注射器中，并在有DPBS的情况下通过右心室的小切口将插管插入PA （图4）。通过温和的注射器注射缓慢地从套管中滴出。这是为了避免将气泡意外引入肺血管，以免引起空气栓塞和不均匀的灌注。插入PA的深度应约为5 mm，以确保稳定的缝合。将套管插入PA后，使用2-0丝线将套管固定在凹槽中。为了测试通过所述PA套管的插管，INFUSE DPBS通过gentl ý推动注射器。低灌注阻力和灌注后PA的扩张表明成功插管。

肺ECM的离体标记
向器官培养生物反应器中添加100 ml的预热d Ex Vivo培养基（图2），并使用30 ml注射器通过三通阀将整个灌注管用该培养基预填充，以去除气泡。用于代谢ECM标签，所述离体培养基中补充用Ac 4 GalNAz（DMSO 50μM在0.1％）。对于对照组，培养基中添加了0.1％DMSO。
在没有事先进行代谢标记的情况下，从大鼠中收获心肺组织，并按照步骤A5至A9插管PA 。
注意：离体肺培养应在器官收获后1小时内开始，以确保要标记器官的最佳代谢活性。

在层流罩中，抬起器官培养生物反应器的盖子，以允许进入内部鲁尔接头（图2）。将肺部套管连接到内部鲁尔接头上，同时使介质缓慢地从鲁尔接头上滴落（通过使用注射器通过三通阀缓慢地注入介质）（图2）。这是为了避免将气泡引入灌注管线。强烈建议在此步骤中使用一次性无菌手套，以确保无菌。
注意：此过程需要两个人的配合。一个应轻推介质填充的注射器，而另一个应将肺套管连接到鲁尔接头。

将器官培养生物反应器的泵管连接至蠕动泵，并验证灌注方向（图2）。在加有5％CO 2的加湿培养箱中以恒定速率灌流培养肺24小时（对于100克大鼠采集的肺为5 ml / min，对于200克大鼠采集的肺为10 ml / min）。

全肺脱细胞
向储液室中预填充1 L脱细胞溶液，并将其放置在收集室上方约50 cm处（图3）。用Decell Solution预填充两个腔室之间的连接管。
将肺（在体内或体外代谢标记后）连接到收集室内的鲁尔接头上，同时让Decell溶液缓慢地从鲁尔接头上滴落。这是为了避免将气泡引入灌注管线。
让Decell溶液在重力（由储液室和收集室之间的高度差决定）的驱动下通过肺部灌注。
注意：在脱细胞过程中，肺部应逐渐扩大大小，并在最初的5-10分钟内变为半透明。否则，可能表明插管或灌注线的其他部分被阻塞。整个1 L脱细胞溶液应在1-2小时内通过肺灌注。如果花费的时间少得多（例如少于30分钟），则可能表明肺部受损或管路连接泄漏。如果花费更长的时间（超过2小时），则可能表示灌注线或肺血管被组织碎屑或气泡阻塞，或者可能是由于插管在PA中的位置不正确所致。

在储液器用完之前，通过转动灌注管路中的三通阀之一来暂停灌注。丢弃收集室中的废液，并用200 ml H 2 O代替储液室，并灌注肺15分钟。
暂停灌注，用200 ml H 2 O中的1％Triton X-100代替储液腔，然后再灌注肺15分钟。
用1 L的1 × PBS代替储液腔，并通过肺完全灌注以洗去洗涤剂。
再重复两次步骤C6。

代谢ECM标记的组织学表征
为了固定脱细胞肺，注入5米升次的使用连接到10ml的注射器的钝头针头Ê固定溶液进气管，并结扎用2-0丝线缝合气管。这是为了优化组织学评估而开放的牙槽结构。浸泡在锥形管中的肺用另外的15毫升固定溶液并孵育在4℃下过夜温和搅拌。
处理固定的肺组织以进行石蜡包埋，并使用切片机将嵌入的组织块切成5μm的厚度。
按照标准的脱石蜡和补水步骤，用1 × PBS冲洗切片3次，每次5分钟。
要检测脱细胞肺ECM中潜在的叠氮化物标记，请通过向组织学切片中加入Biotin-PEG4-Alkyne Click反应混合物（每节100-200μl）进行生物素偶联，并在湿润的染色室中于室温孵育1 h 。
用1 × PBS清洗切片3次，每次5分钟。
在1 × PBS中用1％BSA封闭切片20分钟。
将切片与兔抗层粘连蛋白一抗（在1 x PBS中的1％BSA中以1：500的稀释度，在1 × PBS中）于4 °C在潮湿的染色室内孵育过夜。
用1 × PBS清洗切片3次，每次5分钟。
在室温下用链霉亲和素（Alexa Fluor 647偶联物，在1％BSA在1 × PBS中以1：500稀释）和驴抗兔488（1：500稀释）孵育切片45分钟。
用1 × PBS洗涤3次，每次5分钟。
使用Fluoromount安装玻片，使其风干。
使用EVOS FL Auto 2成像系统（图5）执行荧光成像。
注意：标准免疫荧光染色可与点击反应检测叠氮化物标记一起进行。在这种双重染色中，建议先进行生物素-PEG4-炔烃的点击偶联，然后再进行标准抗体染色。例如，我们进行了层粘连蛋白的染色。

代谢ECM标记的生化表征
切下一块未脱细胞的肺组织（通过体内或体外代谢标记），然后用细剪刀将其切碎。
注意：对于ECM中叠氮化物标记的生化检测，通常50-100 mg肺组织就足够了。

将切碎的肺组织转移到预装有玻璃珠的2.0 ml管中，加入300μlH 2 O，并在微管均质器上以全速（4,000 rpm）均质3分钟。如果大的组织块仍然可见，请重复此均化步骤。
添加300μ升2 × DECELL解管，并搅拌在室温30分钟。该步骤将溶解均质化的肺组织中的所有细胞成分。
在室温下将试管以16,100 × g离心20分钟。丢弃上清液。
向试管中加入1 ml DPBS，通过颠倒彻底混合，在室温以16,100 × g离心10分钟。丢弃上清液。这是为了洗去所有剩余的细胞成分。
再重复两次步骤E5。
向试管中加入500μlBiotin-PEG4-Alkyne Click反应混合物，充分混合，并在室温搅拌下温育1小时。这是为了使生物素与脱细胞的肺ECM中潜在的叠氮化物配体缀合。
在室温下将试管以16,100 × g离心10分钟。丢弃上清液。
向试管中加入1 ml DPBS并充分混合。这是要洗净任何剩余的生物素-PEG4-炔烃和其他点击反应试剂。
在室温下将试管以16,100 × g离心10分钟。丢弃上清液。
再重复两次E9和E10。
向试管中加入500μl尿素提取缓冲液，在室温下轻轻搅拌2小时。
在室温下将试管以16,100 × g离心10分钟。
收集上清液作为ECM蛋白样品。
使用BSA作为蛋白质标准品，按照制造商的规程，使用BCA分析定量ECM蛋白质浓度。
进行SDS-PAGE电泳，使每个样品的蛋白质负载相等，例如从肺中提取的带有或不带有代谢叠氮化物标记的ECM蛋白样品，然后将蛋白质从凝胶上转移到一块PVDF膜印迹上。使用封闭缓冲液封闭印迹20分钟，将印迹在10 ml的链霉亲和素-HRP（封闭缓冲液中以1：10,000稀释）中孵育，在室温下搅拌1小时，然后用TBST彻底清洗印迹3次，每次10次每分钟。
在HRP成像混合物中孵育印迹3分钟，然后使用ChemiDoc Gel和Western Blot成像系统成像（图6A）。
为了验证所有样品中蛋白质的负载均等，请执行SDS-PAGE电泳，并按照制造商的规程使用Sypro Ruby Protein Gel Stain对凝胶中的总蛋白质进行染色。使用ChemiDoc凝胶和Western Blot成像系统对Sypro Ruby染色的凝胶进行成像（图6B）。

数据分析

代谢叠氮化物标记的组织学表征：在脱细胞肺组织的组织学切片上，使用点击化学将潜在的叠氮化物配体与生物素偶联。使用两种不同的荧光团对生物素的链霉亲和素染色和ECM的层粘连蛋白染色进行成像。层粘连蛋白染色用作对照，以验证在有和没有代谢叠氮化物标记的情况下，肺ECM中存在相似的ECM含量。应注意确保所比较的所有样品的成像参数一致。根据荧光信号最强的样品调整曝光时间。与对照组相比，源自接受Ac 4 GalNAz代谢标记的大鼠的肺ECM有望显示出更强大的叠氮化物标记和生物素结合（图5）。

图5.肺ECM的代谢叠氮化物标记的组织学表征。代表性的结果显示，在用Ac 4 GalNAz或DMSO进行三天体内标记后，从大鼠肺中获得了两个ECM样品。将ECM中潜在的叠氮化物配体与生物素偶联，然后使用荧光团偶联的链霉亲和素（红色）进行检测。层粘连蛋白抗体染色指示肺ECM（绿色）。比例尺s ：200μm。

代谢叠氮化物标记的生化表征。使用点击化学方法，将提取的肺ECM蛋白中潜在的叠氮化物配体与生物素偶联，然后进行凝胶电泳。使用标准的蛋白质印迹程序，使用结合了HRP的链霉亲和素和化学发光法检测生物素。与对照组相比，从接受Ac 4 GalNAz代谢标记的肺中提取的ECM蛋白样品有望显示出更强大的叠氮化物标记和生物素结合（图6）。

图6.肺ECM中叠氮化物标记的生化特征。代表性结果显示，在用Ac 4 GalNAz或DMSO进行离体一天的体外标记后，从大鼠肺部得到了两个ECM样品。一。通过共轭生物素的蛋白质印迹分析检测叠氮化物配体。乙。通过用Sypro Ruby对总蛋白进行凝胶内染色来验证蛋白负载量。

菜谱

Ac 4 GalNAz注射液
含70％DMSO的DPBS中的70 mg / m l Ac 4 GalNAz

控制注射液
DPBS中70％的DMSO

离体培养基
DMEM补充了10％FetalClone I血清

1％抗生素/抗真菌药

德赛尔解决方案
高压灭菌去离子水中的0.1％SDS

2 × Decell解决方案
高压灭菌去离子水中的0.2％SDS

1 × PBS（pH 7.4）
用去离子水稀释20 × PBS（pH 7.4），用高压灭菌器灭菌

固定解决方案
1 × PBS（pH 7.4）中的4％多聚甲醛（PFA ）

生物素-PEG4-炔烃点击反应混合物
注意：来自Click-iT细胞反应缓冲液试剂盒的组分（表1）。

表1 。生物素-PEG4-炔烃点击反应混合物的配方

尿素提取缓冲液
600万尿素

10毫米HEPES

1 ×蛋白酶抑制剂

调节pH至8.0

1 × TBST（pH 7.4）
用去离子水稀释10 × TBST（pH 7.4）

阻塞缓冲
TBST中5％的BSA

HRP成像混合物
SuperSignal West Pico PLUS Luminol / Enhancer解决方案和SuperSignal West Pico PLUS Peroxide解决方案，1：1（新鲜配制）

致谢

这项工作得到卡内基梅隆大学生物医学工程系的支持。ZL和YX得到了中国奖学金委员会的奖学金支持。该协议最初是从Ren等人改编的。（2018年）。我们感谢匹兹堡生物标本中心（匹兹堡大学）的组织学处理。我们还要感谢卡耐基梅隆大学的畜牧业。最后，我们感谢Piyumi Wijesekara和吴惠和在收集有关材料和试剂的信息方面所提供的帮助。

利益争夺

XR拥有与此工作相关的专利申请（US20170362266A1）。

伦理

所有动物程序均根据卡内基梅隆大学机构动物护理和使用委员会批准的协议（批准ID ＃TR202000006 ，有效期至20-2022 ）进行。

参考

1. Chang，PV，Prescher，JA，Sletten，EM，Baskin，JM，Miller，IA，Agard，NJ，Lo，A.和Bertozzi，CR（2010）。活体动物的无铜点击化学。美国国家科学院院刊107（5）：1821-1826。
2. Chiu，LL和Radisic，M.（2010）。具有共价固定的VEGF和Angiopoietin-1的支架，用于工程组织的血管形成。生物材料31（2）：226-241。
3. Davidenko，N.，Schuster，CF，Bax，DV，Raynal，N.，Farndale，RW，Best，SM和Cameron，RE（2015）。控制交联以定制基于胶原的支架的稳定性和力学性能。生物物理学报25：131-142。
4. CN。格罗弗，Gwynne，JH，Pugh，N.，Hamaia，S.，Farndale，RW，Best，SM和Cameron，RE（2012）。交联和组成影响胶原基薄膜的表面性能，机械刚度和细胞反应性。生物学报8（8）：3080-3090。
5. ST Laughlin和CR Bertozzi（2007）。用叠氮基糖对聚糖进行代谢标记，随后通过Staudinger结扎进行聚糖谱分析和可视化。Nat Protoc 2（11）：2930-2944。
6. Ott，HC，Clippinger，B.，Conrad，C.，Schuetz，C.，Pomerantseva，I.，Ikonomou，L.，Kotton，D.和Vacanti，JP（2010）。生物人工肺的再生和原位移植。Nat Med 16（8）：927-933。
7.奥特，HC，马蒂森，TS，吴，SK，布莱克，LD，克伦，SM，Netoff，TI和泰勒（2008）。灌注脱细胞基质：利用大自然的平台改造生物人工心脏。Nat Med 14（2）：213-221。
8. Petersen，TH，Calle，EA，Zhao，L.，Lee，EJ，Gui，L.，Raredon，MB，Gavrilov，K.，Yi，T.，Zhuang，ZW，Breuer，C.，Herzog，E 。and Niklason，LE（2010）。用于体内植入的组织工程化肺。科学329（5991）：538-541。
9. Reing，JE，Brown，BN，Daly，KA，Freund，JM，Gilbert，TW，Hsiong，SX，Huber，A.，Kullas，KE，Tottey，S.，Wolf，MT和Badylak，SF（2010）。加工方法对猪真皮细胞外基质支架的力学和生物学特性的影响。生物材料31（33）：8626-8633。
10. Ren，X.，Evangelista-Leite，D.，Wu，T.，Rajab，TK，Moser，PT，Kitano，K.，Economopoulos，KP，Gorman，DE，Bloom，JP，Tan，JJ，Gilpin， SE，Zhou，H.，Mathisen，DJ和Ott，HC（2018）。天然生物材料的代谢聚糖标记和化学选择性功能化。生物材料182：127-134。
11. EM的Sletten和CR的Bertozzi（2011）。从机制到小鼠：两个生物正交反应的故事。Acc Chem Res 44（9）：666-676。
12.特奥哈里斯（AD），斯坎达利斯（Skandalis），党卫军（Sial），加里亚利（Cial），纳尔逊（Karamanos），NK（2016）。细胞外基质结构。Adv Drug Deliv Rev 97：4-27。
13. Uhl，FE，Zhang，F.，Pouliot，RA，Uriarte，JJ，Rolandsson Enes，S.，Han，X.，Ouyang，Y.，Xia，K.，Westergren-Thorsson，G.，Malmstrom，A 。，Hallgren，O.，Linhardt，RJ和Weiss，DJ（2020）。糖胺聚糖在去细胞肺细胞外基质中的功能作用。生物物理学报102：231-246。
14.瓦格纳（Wagner，DE），波南芬特（Borenfant），自然保护区（NR），帕森斯（Parsons），CS，索科切维奇（Sokocevic），D。，布鲁克斯（Brooks），EM，博格（Borg），ZD，拉思罗普（MJ），沃利斯（Willis），京东（JD），戴利（Daly），AB，林恩（YW），邓小平（D. MJ，Ashikaga，T.，Loi，R.和Weiss，DJ（2014）。正常与肺气肿的人肺的脱细胞和再细胞比较。生物材料35（10）：3281-3297。
15. Wissink，MJ，Beernink，R.，Pieper，JS，Poot，AA，Engbers，GH，Beugeling，T.，van Aken，WG和Feijen，J.（2001）。将肝素固定在EDC / NHS交联的胶原蛋白上。表征和体外评估。生物材料22（2）：151-163。