材料和试剂
1. 1.5 ml Eppendorf管（Axygen，目录号：MCT-150-C）
2. 1.0毫米陶瓷珠（Nalgene ，目录号：150010C）
3. 2 ml微型管（Sarstedt，目录号：72.609）
4.移液管头（爱思进，目录号小号：T-300，T-200-Y，T-1000-B）
5.玻璃离心管（VWR International，目录号：734-4240）
6.氮气（> 99％纯度）（任何品牌都足够）
7.异丙醇（Sangon Biotech，目录号：A503069）
8.乙酸乙酯（Sangon Biotech，目录号：A507048）
9.液体nitrog恩（一个纽约的品牌就足够了）
10. HPLC级甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34806）
11.甲酸（Sangon Biotech，目录号：A503066）
12. MilliQ Water （Millipore，目录号：Direct-Q3）
13.标准品（见表1）
注意：所有神经酰胺标准品清单如表1所示。

14.溶剂萃取溶液A（请参阅配方s ）
15.溶剂萃取溶液B（请参见配方s ）
16.流动相甲（见配方小号）
17.流动相B（见配方小号）
18.内标（阿凡提公司）（见配方小号）

表1的实施例Ç eramides标准列表

标准：标准；IS：内标

设备

氮气蒸发器N-EVAP（组织，型号：HGC-24A）
离心机（Eppendorf，型号：5430R）
高压灭菌器（三洋，型号：MLS-3780）
UHPLC-Q-TOF-MS / MS系统（AB SCIEX，美国马萨诸塞州弗雷明汉）
UHPLC色谱柱（Z orbax sb-C8，2.1×150 mm，3.5μm; Agilent，帕洛阿尔托，美国）
象牙PTFE /红色硅橡胶隔垫（Agilent Technologies，目录号：5182-0731）
2毫升琥珀色带刻度USP 1扩展瓶的小瓶（HAMAG Technologies，目录号：HM-0716H）
蓝色开顶聚丙烯帽和白色PTFE /红色Scilicone隔垫（HAMAG Technologies，目录号：HM-0722）
250 μ升透明玻璃拉锥形底部（HAMAG技术，货号：HM-2085）
分析天平（梅特勒-托利多，型号：XS105 ）
组织匀浆器（MP Biomedicals，美国，FastPrep-24）
烤箱（Bluepard，型号：BPG-9040A ）
Vortexer（德国，IKA ，型号：vortex 2）
-80°C冷冻室

软件

峰V IEW（AB Sciex的）
Excel软件（Microsoft Office 2010）
数据处理软件（DPS）

程序

我NSECT样品采集
实验室株褐飞虱（棕色planthop p ER）在本研究中使用起源于浙江大学，杭州，中国的华家池校区现场人群。所述BPHS （棕色planthop p ER）在27±1℃，相对湿度70％饲养易感稻苗cv.Taichung本机1（TN1），16：8小时光照：黑暗光周期。

约2昆虫克鲜重被确定，并且在不同的发育阶段收集（É 。克。，蛋，第一方第五龄在标签若虫，雌，雄成虫）编2个毫升组织GRI Ñ丁管。然后将样品在液氮中快速冷冻后保存在-80°C 。将样品设置为三个生物学重复。

总鞘脂提取（图1）
鞘脂是为Extrac根据Bielaws从昆虫泰德ķ我的方法（Bielaws ķ我等人。，2010）。详细情况如下：

注意：除非另有说明，以下所有步骤均在室温下进行。

将样品取出，从-80℃冰箱和渐隐ð的熔融在1毫升溶剂萃取溶液A（见配方样品1），到10 μ升内标已加入（见配方5）。
然后将样品在带有研磨珠的组织均质器中两次接地，每次20 s 。
注意：在的情况下的植物材料，清洁和预冷却迫击炮和研杵都用于研磨样品I Ñ液氮，和POW d ER然后转移到15毫升玻璃管中。Ť他的样品被均匀成细粉末，以及粉末是在每一个同质化冷冻保存的一步。网格珠的目的是促进昆虫组织的研磨，因此可以覆盖每层样品的质量和总体积的网格珠的数量即可。

粉末状组织涡旋剧烈5分钟，并离心d在1000 5分钟×克。
离心后，将来自上层脂质相的溶剂转移至15 ml无菌玻璃瓶中。
注意：小瓶标签用透明胶带保护，以免被溶液擦去。

提取通过加入重复1毫升溶剂萃取溶液A（见配方1）到剩余的水相，和合并，并在氮气流下浓缩有机层。
Ť他干燥的脂质级分重新悬浮到500 μ升溶剂提取液B（见配方2），并立即足够的液体被转移到玻璃小瓶中并帽编紧密。
Ť他溶剂转移到标记的1.5毫升microcentrifu克ë管，离心将样品在12000 ×g下在室温下5分钟。
注意：将管盖紧，以免离心过程中液体泄漏。

重构溶液最后转移至质谱仪烧瓶的内部插管并储存在-20℃下机试验。

图1的工作流程ö ˚F小号phingolipids萃取FR OM昆虫样品

鞘脂的检测与鉴定
鞘脂上进行分析的AB Seriex 5600 +四极时间的飞行（Q-TOF）总理质谱仪与水的Acquity超高效液相色谱组合。

HPLC程序
溶剂A （请参见配方3）
溶剂B （请参见配方4）
在Waters UPLC（美国马萨诸塞州米尔福德，沃特世公司）和AB Triple TOF 5600 plus系统（AB SCIEX，美国麻萨诸塞州弗雷明汉）结合使用的情况下，溶剂A规定的恒定流量为0.3 m l / min。。
梯度的变化包括：溶剂B（甲醇）在20分钟内从80％增加到99％，然后在15分钟内从99％增加到100％，然后在1分钟内减少到80％。然后在最后9分钟内将溶剂B的百分比保持在80％。
反相分析柱（ZORBAX SB-C8，2.1×150毫米3.5微米;安捷伦，帕洛阿尔托，CA，USA）中的溶液用d来分离神经酰胺。
10 μ样品的升被加到柱上。
该柱被保持在35在整个过程中为°C。
质谱是通过电喷雾电离（ESI）离子源获取的正电离模式和以下设置（表2）。

牛逼能2.将仪器设定š对于SP hingolipids分析

鞘脂分析参数用于检测
C18柱用作Aligent 6460+三重四极杆液体质谱仪上的分离柱，以探索每种标准样品的最佳检测条件。仿形参数包括前体离子/靶向离子，保留时间，˚F ragmentor ，和碰撞能量。Cer （d18：0/12：0）被用作内标。表3列出了每种脂质类别的扫描参数。

表3 。扫描参数为SP hingolipids检测

方法优化说明：对于含有大量低的样品volatilit ÿ化合物中，HPLC-程序可以通过增加提出了更严格速率流动并通过增加采样时间。可以通过更改保留时间来针对特定的分析物和色谱柱适当地调整HPLC程序。对于在高温下降低几个分析物时，可能期望减少离子源加热器温度小号至550-580 ℃。的定时MS参数可以被用于减少或从非常丰富的峰或污染物消除信号。那些具有不同链长，分支或不饱和键的鞘脂将碎裂以产生不同m / z的离子。因此，需要不同的前驱体离子扫描来确定相应的分子种类。此外，扫描范围和碰撞能量将根据各种亚种的大小和替代而变化。所有此类方法的调整应仅在有经验的MS用户的帮助下进行。

数据分析

生成了标准曲线，标准曲线为0.5 ng / ml至200 ng / ml ，用于定量分析。曲线在由一个空白样品和五个校准点的一式三份的一个浓度范围为0.5毫微克/毫升至200毫微克/毫升（表4）。每个脂质种类的量根据下式计算的相比较样品峰面积的归一化的内标峰面积。我们使用Ð拟合曲线，显示之间的关系concen登记领峰面积，其次是该拟合曲线方程。三个或更多个生物重复进行推荐的（图2）。

表4 。神经酰胺标准曲线的数据点

图2.神经酰胺标准曲线的例子。使用以下神经酰胺量：0 ng / ml，0.5 ng / ml，5 ng / ml，10 ng / ml，100 ng / ml，200 ng / ml。x坐标是浓度，y坐标是分析物/ IS峰面积。对于标准曲线的产生，我们转换编的掘宗塔尔和垂直于对数形式。

C18鞘氨醇碱基是哺乳动物中大多数鞘脂的主要骨架（Jarne等人，2018）。因此，我们选择C1 8-0作为代表来描述标准曲线（图2）。对于校准线测量，将等量的100 ng Cer（d18：0/12：0）作为内标物添加到不同的校准点中。从0.5校准线纳克/ ml至200ng / ml的人转换编到拟合曲线，其中r值始终大于验证期间0.9999 （表5）。使用DPS（数据处理）软件中的逻辑曲线拟合方程。

表5 。神经酰胺标准曲线的拟合值

用于采集，多反应监测（MRM）模式和软件P EAK V IEW被使用。质量转变为482.00 m / z- > 264.40 m / z的内标，内标的保留时间为13.19分钟。的神经酰胺（D18：1/16：0）与质量标准过渡538.91 M / Z - > 264.40米/ Z，保留时间的神经酰胺（D18：1/16：0）的标准是16.45分钟。由于R etention时间和化合物的具体电离和分裂值是高度依赖于使用的仪器，该给定的值列表中Ť能够2可被用作参考，但应被单独用于不同的仪器设置确定（图3 ;图4 ）。

图3.在正模式与ESI离子源获取的内标质谱的实施例从褐升ugens。内标代表信号神经酰胺（D18：0/12：0）被绘制。内标物的保留时间是从表2列出稍有不同（13.19分钟VS 。13.28分钟）。

图4 。È的CER xample（D18：1/16：0）以正模式与ESI离子源获取的标准质谱从褐升ugens 。的代表信号神经酰胺（D18：1/16：0）被绘制。内标物的保留时间是从表2列出稍微不同的（1 6 。45分钟VS 。16.55分钟）。

通过使用软件P eak V iew （http://scie.com.cn/）将分析人员的MS / MS离子与ChemSpider碱（http://www.chemspider.com/）中的鞘脂标准物的MS / MS离子进行比较，鉴定出了不同的神经酰胺。产品/软件/ peakview-software）。可靠性的最大允许误差设置为±10 ppm。

菜谱

溶剂萃取液A
乙酸乙酯：异丙醇：水，60:30:10（vol / vol / vol）

溶剂萃取液B
甲醇：0.1％甲酸，9：1（体积/体积）

解决方案A
MQ水Ç ontaining 0.1％甲酸

解决方案B
100％甲醇

内部标准
100 μ微克/毫升神经酰胺（D18：0/12：0）溶解在HPLC级甲醇

致谢

这项工作由国家自然科学基金（31871962）和浙江省重点研发计划（2018C04G2011264）共同完成。感谢浙江大学农业生物与环境科学分析中心的毛丽娟在化学分析方面的帮助。Ť他协议是从所拍摄的出版物Bielawski等。2010年进行了小幅修改（Bielaws k i等人，2010年）。

利益争夺

作者宣称没有竞争的经济利益。

参考

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