材料和试剂
1.5 ml微量离心管（Genaxy，目录号：GEN-MT-150-CS）
屏障提示
0.5-10 µl吸头（Axygen Scientific，目录号：TF-300-LRS）
1-20 µl吸头（Axygen Scientific，目录号：TF-20-LRS）
1-200 µl吸头（Axygen Scientific，目录号：TF-200-LRS）
100-1,000 µl吸头（Axygen Scientific，目录号：TF-1000-LRS）
玻璃小瓶和瓶子
SYLGARD 184硅弹性体（DOW ，目录号：1673921）
微量移液器吸头（2、20、200、1,000 µl）
0.5-10 µl吸头（Axygen Scientific，目录号：T-300-LRS）
1-200 µl吸头（Axygen Scientific，目录号：TR-222-CLRS）
100-1,000 µl吸头（Axygen Scientific，目录号：T-1000-CLRS）
3厘米皿（Eppendorf，货号：0030700112）
食品瓶
CO 2垫
棉塞
玉米粉
蔗糖
酵母提取物（HiMedia，目录号：RM027）
琼脂（Merck，目录号：A5306）
葡萄糖（HiMedia，目录号：GRM077）
4-羟基苯甲酸甲酯（Sigma-Aldrich，目录号：H5501）
正磷酸（默克，目录号：100573）
丙酸（HiMedia，目录号：GRM3658）
乙醇（常熟市宏盛精细化工CHN01）
液氮
RNA分离试剂盒（Favorgen，目录号：FATRK001）
RNaseZAP（Thermo Scientific，目录号：AM9780）
DNase（Thermo Scientific，目录号：EN0523）
焦碳酸二乙酯（HiMedia，目录号：MB076）
乙醇（MP Biomedicals，目录号：180077）
甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F7503）
6×DNA加载染料紫色（新英格兰生物实验室，目录号：B7024S）
cDNA合成试剂盒（iScript，Bio-Rad ，目录号：1708891）
琼脂糖（Invitrogen，货号：16500500）
溴化乙锭（EtBr）（MP Biomedicals，目录号：193993）
定制引物（整合DNA技术）
G9-Taq DNA聚合酶（GCC Biotech，目录号：G7115A）
dNTPs解决方案组合（新英格兰生物实验室，目录号：N0447L）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
七水合磷酸氢二钠（Merck，目录号：1065751000）
磷酸二氢钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
Tris-base（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
冰醋酸（Merck EMPLURA，目录号：1.93402.2521）
碳导电胶带（TED PELLLA Inc.目录号：16073-1）
铝制短管（TED PELLLA Inc.目录号：16111-9）
戊二醛（Sigma-Aldrich，目录号：G5882）
金靶（Quorum Technology inc，目录号：SC502-314A）
EDTA（Merck EMPARTA，货号：1.93312.1021）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
海卫一X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
载玻片（Borosil，目录号：9100P02）
盖玻片（Borosil，目录号：9115S01）
牛血清白蛋白（默克，目录号：621650500501730）
带有DAPI的氟防护板（Sigma-Aldrich，目录号：F6057）
mAb414（Biolegend 902901）-mAb414识别富含FG的核孔的四个不同核孔蛋白
甲nti- d ELYS（梅塔等人，2020）
Alexa Fluor-488（Invitrogen，目录号：A-11029）
Alexa Fluor-568（Invitrogen，目录号：A-11036）
Coverslip密封胶（透明指甲油）
乙醚（Merck，目录号：107026）
磷酸盐缓冲盐水（1×）（请参阅食谱）
PBS-T（请参阅食谱）
飞食品成分（请参阅食谱）
RNA加载染料（请参见食谱）
经DEPC处理的水（请参阅配方）
TAE缓冲液（50×）（请参阅配方）
4％多聚甲醛（请参阅食谱）

飞股票

控制野生型（w 1118 ）

驱动线（内部生成的组合）

+ / +; 肌动蛋白5C-GAL4 / CyO-GFP; UAS-Dicer / UAS-Dicer
+ / +; wingless -GAL4 / wingless -GAL4; UAS-Dicer / UAS-Dicer
+ / +; 眼睛-GAL4 /眼睛-GAL4; UAS-Dicer / UAS-Dicer
RNAi系

+ / +; v103547 / v103547；UAS-Dicer / UAS-Dicer（内部生成的dElys RNAi KK系列与UAS-Dicer结合使用）
dElys RNAi KK系列（VDRC，VDRC ID：103547）
Nup160 RNAi GD系列（VDRC，VDRC ID：21937）
Sec13 RNAi KK系列（VDRC，VDRC ID：110428）
Nup107 RNAi GD系列（VDRC，VDRC ID：22407）

设备

微量移液器（Nichiriyo，Gilson，康宁）
BOD孵化器
密理博净水器
Genova Nanodrop（Bibby Scientific，型号：737501）
镊子Dumont 5（精细科学工具，目录号：11295-10）
镊子Dumont 55（精细科学工具，目录号：11295-51）
剪刀（精细科学工具，目录号：91500-09）
徕卡DM2500
荧光立体显微镜（Leica，型号：M205 FA）
共焦激光扫描显微镜（蔡司，型号：LSM780）
体视显微镜（徕卡，型号：S6E）
扫描电子显微镜（蔡司，型号：Gemini II Ultra plus）
台式离心机（Eppendorf，型号：5424，Thermo Scientific MicroCL 21R）
PCR机（Applied Biosystems，型号：2720热循环仪）
水浴（Grant- B io，型号：PSU-10i）
凝胶电泳仪（CBS小号系统求解，型号：GCMGU-202T）
电源组（CBS小号系统求解，型号：EPS 300）
UVP MultiDoc-It数字成像系统（UVP，目录号：97-0192-02）

软件

ZEN 3.2蓝色版（Zeiss）
ImageJ /斐济（免费，NIH）

程序

果蝇中UAS-GAL4依赖性和RNAi介导的基因敲低需要几个步骤。它包括以下步骤：饲养生物，建立遗传杂交，收获所需遗传组合的幼虫，RNA分离和敲除评估，解剖，免疫染色和表型分析。下面提到的是组织制备和处理的一般方案（图2）。

图2.包含协议细节的流程图

RNAi介导的基因敲除的遗传杂交
成长+ / +; 肌动蛋白5C-GAL4 / CyO-GFP; UAS-Dicer / UAS-Dicer在装有飞行培养基的小瓶中大量飞行。
将具有GAL4驱动程序的原始雌性收集在单独的培养基瓶中。
生长RNAi和野生型（w 1118 ）在不同的培养基小瓶中飞行，以获得足够的雄性苍蝇。
将6-7个原始年龄的雌性雌性和2-3个相同年龄（3-4天大）的UAS-RNAi雄性放入一个新鲜的培养基小瓶中，以建立交配杂交。
对于对照杂交，使用w 1118雄性代替UAS-RNAi雄性，并按照步骤A4的要求将原生雌性杂交。
将小瓶与蝇一起在室温下孵育24小时，以进行遗传杂交。
根据实验设计，将其移至28°C，25°C或18°C。
注意：在较高温度下温育可使GAL4活性更高，从而诱导RNAi表达增加。

将杂交物放在设定温度的培养箱中，直到看到第三龄幼虫。
取出成年苍蝇，放入2-3 ml水或2％蔗糖溶液，从培养基的顶层收获幼虫。
注意：步骤A8至A13在图3中。

使用画笔将食物和水的上层混合，然后将其收集在干净的塑料皿中。
在干净的装有蒸馏水/磷酸盐缓冲液的平板中分离第三龄幼虫。
用水清洗收集的幼虫2-3次以清洁它们。
从GFP（+ / +; RNAi / CyoGFP; UAS-Dicer / +）幼虫中分离出非GFP幼虫（+ / +;肌动蛋白5C / RNAi; UAS-Dicer / +，表明所需的驱动基因和RNAi遗传组合）后续处理。
对于对照，按照步骤A5所述，使用来自对照杂交的非GFP幼虫。
从PBS中非GFP第三龄幼虫的唾液腺或肌动蛋白5C-GAL4驱动的RNAi的头部复合物中分离出来。
注意：有关唾液腺解剖的详细信息，请参见下面的图3和C部分中提到的步骤1-5。

图3.从果蝇三龄幼虫中分离唾液腺的步骤。上面板（af），幼虫分离和清洁步骤；（a）食物小瓶中的幼虫和P，（b）喷水，并用刷子将食物和幼虫的顶层悬浮，（c）将培养皿中的悬浮液倾析，（d）将食物和三龄幼虫悬浮，（e）用蒸馏水收集的清洁幼虫，（f）第三龄幼虫。下面板（gl）幼虫解剖和唾液腺分离的步骤（g）第三龄幼虫，（h）用镊子握住第三龄幼虫，（i）拔出唾液腺和第三龄幼虫的腹部，（j ）头部复合体，具有大脑，椎间盘和唾液腺（k）带有相关脂肪体的唾液腺，（l）解剖并清理了一对附有口钩的唾液腺。

RNA分离
该方法最关键的步骤是RNA分离。RNAi介导的敲低降低了特定的RNA水平，从而影响基因功能。RNA消化酶，RNaseA是一种非常稳定和活跃的蛋白质。因此，必须采取适当的预防措施并使用RNaseZAP之类的RNase灭活溶液。

准备使用DEPC处理过的水（请参阅配方）。
确保使用隔离针尖，无RNase的微量离心管（MCT）和玻璃器皿。
将幼虫放入干净的无RNase的MCT中，快速冷冻，并保存以进行RNA分离。
从幼虫解剖足够的唾液腺，并在液氮中快速冷冻。
使用不含RNase的杵粉碎唾液腺/幼虫，并按照试剂盒中提供的RNA提取方法进行操作。
使用杵直接粉碎速冻组织，或先添加RNA分离试剂盒中的裂解液，然后将溶液中的组织或幼虫粉碎。
如果在压碎前添加裂解液，则添加一半的裂解缓冲液最终体积，并适当压碎组织/幼虫。随后，添加剩余的裂解缓冲液。
使用UV-VIS分光光度计/ nanodrop检查RNA的纯度。甲260/280和甲230分之260比等于2.0-2.2表明纯的RNA。这些比率的较低值表示存在蛋白质，碳水化合物或苯酚等污染物。
在MCT中，将纯化的RNA样品在含有25％甲酰胺的RNA负载染料中于65°C加热10分钟。
将RNA样品管在冰上放置2分钟，然后立即加载到Tris-醋酸EDTA（TAE）缓冲液中制成的含1％琼脂糖凝胶的EtBr中，然后运行凝胶以检查分离的RNA的完整性。
按照BioRad cDNA合成试剂盒中的说明制备cDNA，并保存在-20°C下直至进一步使用。
最终体积为20 µl的典型cDNA合成反应包含1 µg纯化的RNA，1x iScript反应混合物，1 µl iScript逆转录酶。
反应步骤包括在25°C进行5分钟的引发，在46°C进行20分钟的逆转录和在95°C进行1分钟的灭活。
在准备的cDNA上使用基因特异性引物（200 nM）并进行典型的PCR反应（引物序列请参见表1）。
注意：对于所有半定量PCR，我们使用的标准退火温度（Ta）为55°C。

在PCR反应中使用RpL49引物作为内部控制基因（引物序列请参见表1 ）。

表1.用于评估组合水平的引物列表

Sl＃

底漆名称

顺序（5' → 3'）

1个

Nup107F

CTGGGAGCACAAGGTTAAGG

2

Nup107R

GATCTCAGGAATGCAGATGGAG

3

Nup160F

CCAGTGGCTGATAAACTCCTAC

4

Nup160R

AGAGCTGTGGGTTTGCTATG

5

Sec13F

TCACATTGTGGAAGGAGAACAC

6

Sec13R

GTTGGACAGGTTCGAGCTATG

7

RpL49F

CGTTTACTGCGGCGAGAT

8

RpL49R

GTGTATTCCGACCACGTTACA

在含1％琼脂糖凝胶的EtBr上加载50％PCR产物以评估敲除程度（图4）。

图4.基于半定量PCR的击倒评估。由对照和核孔蛋白敲低制备的cDNA用于PCR反应。上图显示了来自对照和基因敲除组织的Nup160 （A），Nup107 （B）和Sec13 （C）的水平。RpL49用作对照样品和组合样品之间的内部装载对照。

唾液腺的解剖和染色
唾液腺是有丝分裂后的组织，带有大核。它具有多聚体染色体，在许多细胞学研究和基因表达分析中可作为优秀的模型组织。可以使用免疫染色研究核孔蛋白的损失以及随之而来的核孔装配和功能的扰动。dElys使用RNAi在唾液腺中被击倒。免疫染色中唾液腺解剖的后续步骤如下。

在20只三龄幼虫的硅酮弹性体板上的PBS中解剖唾液腺。
注意：每隔2-3个解剖后更换PBS溶液。

使用镊子将幼虫大约抓住其大小的中间部分。
使用Dumont 5镊子抓住口钩并拔出头部。
同时使用Dumont 55镊子去除肠道区域和其他car体组织。
在这段时间内，使用尖头的Dumont 5镊子通过嘴钩抓住头部。
去除大脑，假体椎间盘和脂肪组织，以清洁解剖的唾液腺，并确保口钩保持附着状态。
解剖每个唾液腺后，立即将其转移至含有1 ml 4％多聚甲醛的MCT中。
解剖并收集所有唾液腺后，将MCT放在室温摇动的摇床上振动40分钟。
注意：固定时间不得超过1小时；否则，组织将变得脆弱，并影响染色。

去除多聚甲醛并用PBS-T清洗组织3次，每次10分钟。
注意：仔细进行所有清洗步骤，以免流涎腺丢失。它适用于所有后续步骤。

用连接的钩子解剖唾液腺还有一个额外的优点，就是我们可以很容易地看到唾液腺，因此可以减少唾液腺的损失。
在含PBS-T的3％正常山羊血清或PBS-T中的3％牛血清白蛋白（BSA）中阻断唾液腺。
在轨道振动器上以110转/分钟（rpm）在室温下保持1小时。
注意：在设定为110 rpm的定轨振荡器上进行所有孵育/洗涤。

加入200 µl含溶液的抗d Elys和mAb414一抗（在PBS-T中制备的两种抗体中的每一种的1：800稀释度）。
在振荡器上于4°C孵育过夜。
在室温（25°C）下，用200 µl PBS-T洗涤样品3次，每次10分钟。
加入200 µl Alexa Fluor-488或Alexa Fluor-568缀合的二抗稀释液（在PBS-T中以1：800稀释液稀释），然后在室温（25°C）下孵育1.5-2.0 h。
用200 µl PBS-T洗涤样品3次，在室温（25°C）下每次10分钟。
放入含DAPI安装介质的15 µl Fluoroshield。
使用切好的200 µl移液器吸头挑选所有唾液腺。
注意：切下200 µl细吸管吸头的样品入口端，以避免任何组织损伤。

将唾液腺放在先前清洁过的载玻片上，并用Dumont 55镊子轻轻地铺开组织。
注意：散布时请勿损坏组织。仅在需要时，使用口钩抓住组织。

将清洁的盖玻片小心地放在薄纸上。
避免在载玻片和盖玻片之间夹带气泡。
用薄纸轻轻去除多余的安装介质，并用透明指甲油密封盖玻片的边缘。
在荧光徕卡显微镜下观察处理过的组织。
在Zeiss LSM780上，使用控制滑块调整设置并聚焦在具有清晰单元格视图的字段中。
用共聚焦激光扫描显微镜LSM780在63 ×物镜下扫描具有唾液腺核的视野。
从控制幻灯片的不同视野捕获图像（图5）。
还可以对击倒样本重新使用相同的设置。

图5. RNAi介导的唾液腺核中的dElys击倒耗尽的d Elys信号。唾液腺从对照RNAi（上图）和dElys RNAi（下图）第三龄幼虫中解剖，并用d Elys（红色，第一图），mAb414（绿色，第二图），DAPI（蓝色，第三图）染色。第四个面板代表合并的图像。比例尺= 10μm。

机翼和眼睛特定的组合
在nup160 RNAi和+ / +之间建立杂交；Ey -GAL4 / Ey -GAL4; UAS-Dicer / UAS-Dicer（用于眼睛特异性敲除）或nup160 RNAi和+ / +；wg -GAL4 / Wg -GAL4; UAS-Dicer / UAS-Dicer（用于机翼特定的组合）。
转移至较低温度（18°C）。较低的温度降低了GAL4的活性。
GAL4活性在18°C时降低，导致击倒水平降低，并允许成年苍蝇出现。

解剖和可视化眼睛和翅膀
眼睛的可视化
果蝇复眼是复杂但相关的组织，可观察到RNAi介导的敲低后的生长缺陷。确定的转录范例在发育过程中调节复眼中每个邻眼的排列。由于RNAi介导的敲除，小孔排列中的任何扰动，其平滑的形态以及每个小孔均存在刷毛的现象表明了基因功能的重要性。使用RNAi敲除Nup160后，以以下方式处理机翼。如果目的基因诱导了幼虫的致死性，那么眼睛特异性的敲低有助于评估基因的功能。使用RNAi敲除Nup160后，按以下方式处理复眼。

将成年苍蝇收集在一个空的小瓶中。
在棉花上涂抹100-200 µl乙醚，然后塞上装有小瓶的果蝇以麻醉它们。
在立体显微镜Leica S6E下正确对准它们（复眼朝上）。
使用碳导电带固定蝇的位置，以稳定观察眼睛。
使用Leica荧光立体显微镜M205 FA以123倍的放大倍率观察眼睛的形态（图6A的左图）。
眼表型的SEM分析
用乙醚麻醉果蝇。闪光灯会冻结它们，并使头部与身体分开。
在4°C下用2.5％戊二醛的PBS固定头部组织2 h。
用PBS和4％蔗糖溶液洗涤。
在室温下，使用一系列分级的乙醇洗涤液（分别用25％，50％，75％乙醇洗涤一次，并用100％乙醇洗涤两次）使组织脱水。
保留在实验室干燥器中以进行临界点干燥。
用碳带将干燥的纸巾固定在铝制的短管上。
在溅射镀膜设备中用金颗粒覆盖苍蝇。
使用带In镜头检测器的Zeiss Gemini II FESEM拍摄的图像（图6A中的中间和右侧面板）。
机翼的可视化
果蝇的成年翅是观察基因功能微扰引起的发育缺陷的优良组织。刚毛，翼状静脉和有缺口的翼的变化是基因敲除后所见的独特表型。机翼想象中的盘存在于三龄幼虫中。如果感兴趣的基因引起幼虫后致死，则常规分析机翼假想盘。使用RNAi敲除Nup160后，以以下方式处理翅膀以进行可视化。

遵循眼睛可视化过程的步骤E1a和E1b。
用剪刀剪掉机翼，然后将它们放在干净的幻灯片上。
将盖玻片放在机翼组织的顶部并密封。
在直立的光学显微镜Leica DM2500下以10倍的放大倍率观察（图6B中的面板）。

图6.击倒眼睛和翅膀中的Nup160会导致发育缺陷。（A）使用Ey- GAL4对Nup160的眼睛特异性敲除，并在明场光学显微镜和SEM下可视化复眼。（B）使用Wg- GAL4对Nup160进行机翼特异性敲低并在明场光学显微镜下观察机翼。控件组合键用于比较。比例尺（A）在左侧面板中为200μm，在中间面板中为20μm，在右侧面板中为2μm。（B）中的比例尺为200μm。

数据分析

我们利用RNA干扰介导击倒的dElys在果蝇和已经探索的功能意义d ELYS在果蝇的发展。关于dElys功能的观察结果表明，d Elys对于胚胎发育，核孔装配，发育调控分子Dorsal的核质穿梭非常重要。携带针对dElys ，Nup160 ，Nup107和Sec13的RNAi的果蝇之间的遗传杂交，以及启动子特异的GAL4序列产生了所需的后代，其中同一蝇中同时存在RNAi和UAS-GAL4。根据缺少GFP表达的昆虫（非GFP幼虫），在第三龄幼虫阶段选择后代。在唾液腺特异性分析中，我们从非GFP幼虫中解剖了成对的唾液腺（图3）。使用肌动蛋白5C-GAL4敲低感兴趣的基因Nup160 ，Nup107和Sec13可以成功实现显着的基因表达敲低。半定量RT-PCR分析确定这些基因被有效地消耗掉了（图4）。
使用不同基因的RNAi，我们获得了50-80％的敲低。通过PCR确定RpL49基因水平有助于进行这些精确的计算。在普遍存在的击倒表现为致命或有害的情况下，我们探索了组织特异性击倒的选择。另外，当基因的功能仅限于特定组织时，可以利用组织特异性启动子介导的敲低的能力。还必须对利用的RNAi的任何潜在脱靶基因进行分析，以建立基因与表型之间的相关性。Mehta等。，2020年报道，dElys RNAi的两个脱靶点并未受到明显干扰。同时，剂量敏感性蛋白的RNA转录物温和降低也可产生可观察到的表型。
在敲除dElys的条件下，dElys水平会大大降低（肌动蛋白5C> dElys ）。dElys普遍存在的敲低和唾液腺核的后续分析表明，d Elys耗竭会影响核孔的组装。在相似条件下，对照敲低中的dElys水平不受干扰（肌动蛋白5C>对照）（图5）。mAb414抗体识别四种不同的FG重复富核孔蛋白。在dElys RNAi上，mAb414核孔染色也明显减少。根据这些观察结果，我们建议d Elys在果蝇的核孔装配中起重要作用。

我们进一步利用UAS-GAL4系统的电源的RNAi介导的击倒的Nup160在果蝇眼睛和翅膀。眼睛特异性Ey -GAL4和翅膀特异性wg -GAL4启动子耗尽了Nup160，从而在这两个组织的发育中产生了明显的干扰。在Nup160组合式动物中，整个复眼都缩小了，似乎没有了。与特定于眼球的对照击倒相比，击倒眼的SEM图像显示出急剧的变化（图6，图A）。类似地，Nup160的特定于机翼的击倒导致机翼叶片尺寸减小，并且静脉完全缺失（图6，B板）。
RNAi介导的核孔蛋白基因dElys和Nup160的敲除的观察结果确定了该基因敲除范例的鲁棒性。此外，唾液腺，眼睛和翅膀的组织特异性敲除和分析突出了核孔蛋白在果蝇发育中的功能意义。

菜谱

磷酸盐缓冲盐水（1×）
氯化钠137 mM

氯化钾2.7 mM

七水合磷酸氢二钠10 mM

磷酸二氢钾1.8 mM

PBS-T
温热含有1x PBS的猎鹰管，并用切好的移液器吸头将Triton X-100（100％）加入至终浓度为0.2％。

飞食品成分
成分量/升
玉米粉80克
糖40克
葡萄糖20克
酵母提取物15克
琼脂10克
4-羟基苯甲酸甲酯1 g
丙酸4毫升
正磷酸0.6毫升
乙醇绝对10毫升
分别称量玉米粉，糖，葡萄糖，酵母提取物，琼脂，然后加到烧瓶中。
注意：请遵循上表中提到的不同组件的比例。

在121°C下高压灭菌20分钟，使其冷却一段时间，直到温度达到〜50-55°C。
同时，称量1克-4-羟基苯甲酸甲酯并溶于10毫升乙醇。
一旦培养基冷却至〜50-55°C（用温度计检查），就向培养基中加入4-羟基苯甲酸甲酯溶液，丙酸和正磷酸。
充分混合，然后将8-10毫升倒入每个玻璃小瓶中。
注意：避免混入气泡。不要让其冷却至〜50°C以下；否则，琼脂将开始凝固。

介质在小瓶中固化后，将紧密的棉塞放在每个小瓶上，并根据需要使用。
注意：将小瓶放在笼中进行冷却。笼子有助于避免室内杂散蝇污染小瓶。

RNA加载染料
50 µl甲酰胺

35 µl 6×DNA加载染料

15 µl超纯水（补足最终体积）

经DEPC处理的水
1毫升DEPC添加到1 ，000毫升超纯水（0.1％）的。
充分混合，盖好瓶子，在室温下放置过夜。
高压灭菌两次，使其冷却至室温。
制作等分试样并将其储存在-20°C以便使用。
TAE缓冲液（50×）
将242克Tris碱加到700毫升双蒸馏水中。
小心添加57.1毫升冰醋酸。
混合100 ml pH值为8.0的0.5 M EDTA。
调整体积至1 ，000毫升。
注意：pH值应在8.5左右，无需调整。

使用20 ml的50×TAE储备液制成1升的1×TAE缓冲液。
1×TAE缓冲液的终浓度如下：40 mM Tris碱，20 mM乙酸和1 mM EDTA
4％多聚甲醛
将50 ml 1×PBS放入干净的玻璃瓶中。
加入4 g多聚甲醛，同时将瓶子放在〜60°C的加热板上
注意：由于多聚甲醛有危险，因此请确保在通风橱内工作。

缓慢滴加1 N NaOH以溶解所有多聚甲醛。
当所有低聚甲醛都溶解在PBS中时，使用1 N HCl将pH调节至7.2-7.4。
使用1x PBS将最终体积调整为100 ml。
过滤并以10 ml等分试样的形式在0-4°C下储存低聚甲醛。
注意：多聚甲醛溶液请勿存放超过一个月。

致谢

该协议最初发表在Mehta等人的研究手稿中。（2020），并得到了科学与工程研究委员会（SERB，EMR / 2016/001819）的支持。感谢Jyotsna Kawadkar女士对果蝇中UAS-GAL4系统的准确描述。我们还要感谢IISER Bhopal的Fly设施IISER Bhopal，以及IISER的DST-FIST活细胞成像和SEM设施。

利益争夺

没有竞争利益可宣布。

伦理

研究中未使用人类受试者或小鼠模型。
对于果蝇的饲养，维护和试验，要遵循宿主研究所的动物道德规范的适用部分。

参考

布兰德，AH和佩里蒙，N。（1993）。靶向基因表达是改变细胞命运和产生显性表型的一种手段。发展118（2）：401-415。
Mehta，SJK，Kumar，V.和Mishra，RK（2020）。果蝇ELYS调节发育过程中的背动态。生物化学杂志295（8）：2421至2437年。
Ni，J.-Q.，Zhou，R.，Czech，B.，Liu，L.-P.，Holderbaum，L.，Yang-Zhou，D.，Shim，H.-S.，Tao，R. ，Handler，D.，Karpowicz，P.Binari，R.，Booker，M.，Brennecke，J.，Perkins，LA，Hannon，GJ和Perrimon，N。（2011）。果蝇转基因RNAi的基因组规模shRNA资源。Nat Methods 8（5）：405-407。