材料和试剂
1. P ipette提示

2.收集管（QIAGEN，目录号：19201，在室温下保存）

3. Qubit分析管（ThermoFisher Scientific，Invitrogen，目录号：Q32856，在室温下保存）

4. SuperScript III一步式RT-PCR系统（ThermoFisher Scientific，Invitrogen，目录号：12574026，存储在-20 °C ）

5.在-20 °C下保存的Tris-HCl缓冲液中100 µM的引物ID引物（Integrated DNA Technologies）

6. SuperScript III逆转录酶（ThermoFisher Scientific，Invitrogen，目录号：18080085，存储在-20 °C ）

7. RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂（ThermoFisher Scientific，Invitrogen，目录号：10777019，在-20 °C储存）

8.核糖核酸酶H （ThermoFisher Scientific，Invitrogen，目录号：18021071，在-20 °C下储存）

9. KAPA2G耐用的PCR试剂盒（带有dNTP的Hotstart PCR试剂盒）（Roche，目录号：KK5516，存储在-20 °C ）

10. KAPA2G HiFi HotStart （带有dNTP ）（Roche，目录号：KK2502，存储在-20 °C ）

11. RNAClean X P（Beckman Coulter，目录号：A63987，在4 °C下储存）

12. AMPure XP（贝克曼库尔特，目录号：A63881，在4 °C下储存）

13.乙醇200证明（Decon实验室，目录号：2716）

14.不含DNase / RNase的水

15. MinElute凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28606，用于MinElute色谱柱，在4 °C下储存，在室温下用于其他试剂）

16. Qubit dsDNA BR检测试剂盒（ThermoFisher Scientific，Invitrogen，目录号：Q32853，标准品1和标准品2在4 °C下储存，其他试剂在室温下保存）

17. Experion DNA 12K分析试剂盒（Bio- R ad，目录号：7007108，芯片在室温下保存，其他试剂在4 °C下保存）

18. MiSeq试剂盒v3（600个循环）（Illumina ，目录号：MS-102-3003，对于第1盒，在-20 °C下存储；对于第2盒，在4 °C下存储）

19.氢氧化钠（西格玛奥德里奇，目录号：221465，在室温下保存）

20.盐酸Tris （Sigma-Aldrich，目录号：10812846001，在室温下保存）

21. PhiX Control V3（Illumina ，目录号：FC-110-3001，存储在-20 °C ）

22. 10 mM Tris-HCl，含0.1％TWEEN 20（Teknova ，目录号：T7724，在室温下保存）

设备

皮pettes
磁力架
热循环仪（ThermoFisher Scientific ，Applied Biosystems ，目录号：4384638 ）
离心机（Eppendorf ，型号：5424）
DynaMag-2磁铁（ThermoFisher Scientific，Invitrogen，目录号：12321D）
Qubit 2.0荧光计（ThermoFisher Scientific，Invitrogen，目录号：Q32866）
Experion电泳站（Bio- R ad，目录号：7007010）
MiSeq系统（Illumina ，目录号：SY-410-1003）

软件

Primer-BLAST（NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）（Ye et al。，2012）
bcl2fastq管道（v.2.20.0）（Illumina ，https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software.html）
TCS Web应用程序（UNC，https://tcs-dr-dept-tcs.cloudapps.unc.edu/）
TCS管道（v.1.3.8）（UNC，https://github.com/SwanstromLab/PID）
RUBY软件包viral_seq （v.1.0.8）（UNC，https://github.com/ViralSeq/viral_seq）

程序

我们首先设计用于多重引物ID文库制备的引物。从组织培养上清液中提取病毒RNA或从肺组织中提取总RNA后，我们使用来自每个标本的多重引物ID库制备方案构建MiSeq测序库。多重引物ID协议使我们可以在一个反应中构建病毒RNA多个区域的测序文库。每次测序我们最多收集24个条形码文库（来自24个不同的标本）。我们使用Illumina MiSeq V3试剂盒（600个循环）进行测序。我们选择配对末端测序，以具有更长的读取长度，并且比单末端测序具有更好的重叠区域纠错能力。

引物ID cDNA引物和PCR引物设计
使用NCBI Primer-BLAST设计引物序列。
使用参考基因组MERS- CoV NC_019843的ORF1b区作为Primer-BLAST界面中的“ PCR模板”来设计MERS- CoV的引物。使用具有四三肽重复序列2（Ifit2，参考号：NM_008332）的小鼠干扰素诱导的蛋白质，具有四三肽重复序列3（Ifit3，参考号：NM_010501），ISG15泛素样修饰剂（Isg15，参考号：NM_015783），干扰素诱导的蛋白具有四三肽重复序列1（Ifit1，参考号：NM_008331）和趋化因子（CXC基序）配体10（Cxcl10，参考号：NM_021274）基因组的蛋白质作为模板来设计小鼠mRNA的引物。
将PCR产物大小设置为最小值：400 bp ，最大值：600 bp。
将底漆熔化温度设置为最低：52，选择：55，最高：58。
为每个模板区域选择3-4对引物。
使用SuperScript III单步RT-PCR系统以每个区域的最佳扩增效率测试引物。
使用上述组织培养物中的MERS- CoV病毒RNA进行MERS- CoV引物测试。使用提取的小鼠总肺RNA作为小鼠mRNA引物测试的模板。在无DNase / RNase的水中，以1:10的滴度对模板RNA进行连续滴定，作为RT-PCR模板。稀释至10 -6 。
使用以下配方在PCR试管中制备一个单步RT-PCR混合物（总体积为10 µl ）。
5 µl 2 ×缓冲液

1.8 µl不含DNase / RNase的水

0.4 µl正向引物（20 µM）

0.4 µl反向R（20 µM）

0.4 µl酶混合物

2 µl模板RNA

将以下热循环仪条件用于RT-PCR。
50 °C 30分钟
94 °C 2分钟
40个周期的：
94 °C持续15 s

55 °C持续30 s

68 °C持续30 s

68 °C 5分钟
使用1％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，检查PCR产物。
图3显示了来自测试的MERS- CoV引物的扩增子的示例凝胶图像。

图3.用于引物设计的示例性一步RT-PCR凝胶图像。测试了针对相同的MERS- CoV基因组的三组引物。将MERS- CoV RNA的连续稀释液稀释至10 -6稀释液来测试引物。使用SSIII一步PCR系统进行扩增。通过用1％琼脂糖凝胶的凝胶电泳检查PCR产物。引物组2具有最佳扩增效率，因此被选作下游引物ID引物设计。NC，无反应控制。

设计MiSeq文库制备用引物ID cDNA引物和其他引物。
通过将引物ID（11个碱基长的序列的简并片段）和衔接子序列连接到反向引物上，设计cDNA引物。
前进1的引物第一轮PCR是由在3'与在步骤所设计的正向引物测序端）在5'接合的共同序列“GCCTCCCTCGCGCCATCAGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNN”设计。连接的引物序列中的Ns是随机序列，以提高测序质量。
的1的反向引物ST轮PCR被设计抵抗引物ID的衔接子序列部分的cDNA的引物，并且是不管通用区域（表1）。
2个第二轮PCR引物被设计成包括MiSeq与条形码测序衔接。
为了引物上设计上述小号TEP小号甲1A- A1 d从集成DNA技术（IDT）。要求手工混合前体以降低cDNA引物序列的变性区，以使碱基在每个位置上均匀分布。
表1显示了此方案中使用的引物的完整列表，包括用于Primer ID MiSeq文库制备的引物和定制的MiSeq测序引物。表2显示了索引引物的序列。
笔记：

引物-BLAST不是设计引物所必需的。引物可以基于已知的参考基因组进行手动设计。
在引物ID cDNA引物合成之前，先手动混合核苷酸前体对于确保简并序列在简并区块每个位置上碱基（A，C，G，T ）的分布均很重要。

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说明：logonew

表1.用于MiSeq文库制备和测序的引物。具有基因特异性区域的引物序列以蓝色突出显示。在设计其他病毒的引物时，可以将它们替换为其他基因特异性引物序列。

底漆

5'-3'序列

评论

41R_PID11 *

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNCAGT ATGACCTTCCTGTTGCTTCT

cDNA引物。在参考基因组上靶向20331-20350。

nsp10_PID11 *

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNCAGT CCTAAAGACGACATCAGTGG

cDNA引物。在参考基因组上靶向13488-13507。

nsp12_PID11 *

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNCAGT ATAGCCAAAGACACAAACCG

cDNA引物。在参考基因组上靶向15983-16002。

nsp14_PID11 *

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNCAGT GAACATCGACAAAGAAAGGG

cDNA引物。在参考基因组上靶向18715-18734。

ifit3_PID11 *

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNCAGT TTCAGCCACTCCTTTATCCC

cDNA引物。靶向小鼠IFIT3 mRNA。

isg15_PID11 *

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNCAGT GGGGCTTTAGGCCATACTC

cDNA引物。靶向小鼠ISG15 mRNA。

41F_AD

GCCTCCCTCGCGCGCCATCAGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNN GCTACAAGTTCGTCCTTTGG

1第一轮PCR的正向引物。在参考基因组上靶向19812-19831

nsp10_AD

GCCTCCCTCGCGCGCCATCAGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNN TGCTCAGGTGCTAAGCGAAT

1第一轮PCR的正向引物。在参考基因组上靶向12983-13002

nsp12_AD

GCCTCCCTCGCGCGCCACAGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNN ATAGGCTTCGATGTTGAGGG

1第一轮PCR的正向引物。在参考基因组上靶向15388-15407

nsp14_AD

GCCTCCCTCGCGCGCCATCAGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNN ATTGCAAGCTGGTTCTAACA

1第一轮PCR的正向引物。在参考基因组上靶向18260-18279

ifit3_AD

GCCTCCCTCGCGCGCCACAGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNN CGATCCACAGTGAACAACAG

1第一轮PCR的正向引物。靶向小鼠IFIT3 mRNA。

isg15_AD

GCCTCCCTCGCGCGCCACAGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNN TGGGACCTAAAGGTGAAGATG

1第一轮PCR的正向引物。靶向小鼠ISG15 mRNA。

表1.续

转接器R

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

1第一轮PCR反向引物

通用适配器

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTCCCTCGCGCGCCATCAGAGATGTG

2第二轮PCR使用正向引物的Illumina衔接子序列

索引适配器**

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT NNNNNN GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

2第二轮PCR与反向引物的Illumina衔接子序列和指标（NNNNNNN）

老Nextera

GCCTCCCTCGCGCGCCACAGAGATGTGTATAAGAGACAG

定制测序引物

* cDNA引物具有一个简并核苷酸（Ns）区块作为引物ID。

** Indexed Adapter引物中的Ns是一组24个预先设计的条形码，用于多路复用MiSeq运行的样品。请参阅表2中的索引序列和适配器序列。

表2.索引的适配器序列。请注意，索引序列是适配器序列中突出显示的（红色）区域的反向互补序列

索引适配器

指数

索引序列

顺序（5'-3'）

PCR引物，索引1

1个

ATCACGA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T CGTGAT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引2

2个

GA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T ACATCG GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引3

3

塔加卡

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T GCCTAA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引4

4

泰格卡

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA TT GGTCA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引5

5

ACAGTGA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T CACTGT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引6

6

卡卡塔

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T ATTGGC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引7

7

卡加塔卡

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T GATCTG GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引8

8

ACTTGAA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T TCAAGT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引9

9

GATCAGA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T CTGATC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引10

10

塔格塔

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T AAGCTA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引11

11

GGCTACA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T GTAGCC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引12

12

CTTGTAA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T TACAAG GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引13

13

TCCATAA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T TATGGA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引14

14

GTACTAA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T TAGTAC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引15

15

阿格塔阿

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T TACTGT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引16

16

卡塔加

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T CATGAG GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引17

17

阿加塔加

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T TATCGT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引18

18岁

TGCAGAA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T TCTGCA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引19

19

TTCATAA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T TATGAA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引20

20

TGCTGTA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T ACAGCA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引21

21岁

塔塔卡

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T GTGATA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物索引22

22

TGGATAA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T TATCCA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引23

23

CGCATTA

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T AATGCG GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

PCR引物，索引24

24

贸发会议

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA T TAAGGC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC

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说明：logonew

引物ID MiSeq库制备
cDNA合成
使用从感染细胞的细胞培养上清液中提取的病毒RNA或感染小鼠的肺组织总RNA作为扩增模板。cDNA合成步骤应在BSL2 +设施中进行，直到核糖核酸酶H步骤之后。
完全解冻，涡旋并旋转5 ×缓冲液，dNTP和DTT。
使基因从100μM引股票底漆工作组合。引物混合物中每种引物的终浓度为10 µM。
确定测序区域。
将10 µl的每种cDNA引物（最多5个不同的引物进行多重化）添加到Eppendorf微量离心管中，并添加无DNase / RNase的水至总体积为100 µl。
如果需要更大体积的引物混合物，请按比例增加引物和无DNase / RNase的水的量。
吸取以下成分到0.5 ml无RNase的PCR管中。
2 µl dNTP混合物（每个10 mM ）

1 µl引物ID cDNA引物混合物（每个10 µM）

23 µl RNA模板（vRNA或总肺RNA）

将PCR试管在热循环仪上于65°C加热5分钟，然后在盖关闭的情况下冷却至4 °C 2分钟（盖温度为105 °C ）。
将以下组件添加到管中。如果分批进行cDNA合成，则要进行预混，然后将14 µl的混合物加到每个试管中。
8 µl 5 ×缓冲液

2 µl DTT（100 mM ）

2微升RNaseOUT （40 U /微升）

2 µl SSIII逆转录酶（200 U / µl）

通过上下移液几次将其混合均匀。将试管转移到热循环仪上。使用以下热循环仪程序进行cDNA合成。
55 °C 1小时

50 °C 1小时

70 °C 15分钟

到每个管中，加入0.5微升（1U）Ribonucleas Ë H，孵育在37 ℃进行20分钟。此步骤后，可以在常规工作台（BSL1）上处理cDNA 。
净化的cDNA与RNAClean XP。
通过涡旋重悬珠并取出等分试样。使用前，请在室温下至少保存30分钟。
通过涡旋彻底重悬be be广告。向1.5 ml管中加入28 µl RNAClean XP珠。将所有的cD NA反应（40.5 µl）转移到每个有珠子的管中。
将RNAClean XP和移液器混合15次，充分混合样品。涡旋是不推荐使用。让试管在室温下孵育20分钟。如果样品接触到试管的上部，请短暂旋转。
将试管放在磁力试管架上5分钟，以将小珠从溶液中分离出来。
缓慢地从管中吸出已清除的溶液并丢弃。应在试管位于机架上时执行此步骤。请勿干扰已在管子侧面形成斑点的磁珠。
分配400微升70％乙醇到管在室温下孵育30秒。吸出乙醇并丢弃。重复进行总共3次洗涤。重要的是要使用位于磁力架上的管子执行这些步骤。请勿打扰分离的磁珠。确保从井底除去所有乙醇，因为其中可能含有残留的污染物。
打开盖子，让反应管在机架上风干10分钟。试管应风干，直到最后可见的乙醇痕迹蒸发。但是，样品过度干燥可能导致较低的回收率。
从磁力架上取下试管，然后上下吹打，将珠子重悬在24 µl不含DNase / RNase的水中。将试管放回机架上，静置3分钟。
当移液管位于磁性管架上时，从移液管中吸取洗脱液（23.5 µl）。
使用KAPA2G稳健PCR试剂盒进行第一轮PCR扩增。
在第一轮PCR中，我们使用针对基因组多个区域的正向引物混合物，扩增了从上一步获得的所有cDNA 。

用100 µM底漆储备液配制正向底漆。
根据cDNA引物放置的初始选择确定引物结合区域。
将每个正向引物（不超过5个引物）加10 µl到Eppendorf微量离心管中，并加入无DNase / RNase的水至100 µl的总体积。
如果需要更大体积的引物混合物，请按比例增加引物和无DNase / RNase的水的量。
使用前，将试剂（酶除外）完全融化，涡旋和旋转。
使用以下配方制作一个第一轮PCR混合物（总体积为50 µl）。
10 µl的5 ×缓冲液A

10 µl增强剂

1 µl dNTP

2.5 µl正向引物混合物

2.5 µl衔接子R引物

0.5 µl KAPA稳固聚合酶

23.5 µl模板cDNA

通过上下移液几次将其混合均匀。将试管转移到热循环仪上。将以下热循环仪程序用于第一轮PCR扩增。
95 °C 1分钟
25个周期：
95 °C持续15 s

58 °C持续60 s

72 °C持续30 s

72 °C 3分钟
使用AMPure XP清洁珠纯化PCR产品。
涡旋1毫升等分的AMPure XP清洁珠，并除去所需的体积。使用前，请在室温下至少保存30分钟。
将第一轮PCR反应转移到1.5 ml无DNase的试管中。
重悬珠子。在每个PCR反应中添加35 µl AMPure XP珠。
混合AMPure XP并涡旋彻底取样。让试管在室温下孵育5分钟，然后再进行下一步（在架子上孵育）。
将试管放在磁力试管架上5分钟，以将小珠从溶液中分离出来。
缓慢地从管中吸出已清除的溶液并丢弃。应在试管位于机架上时执行此步骤。请勿干扰已在管子侧面形成斑点的磁珠。
分配400微升的70％乙醇在室温下将试管孵育30秒。吸出乙醇并丢弃。重复两次，共洗涤一次。必须使用位于机架上的管子执行这些步骤。请勿打扰分离的磁珠。确保从井底除去所有乙醇，因为其中可能含有残留的污染物。
打开盖子，让反应管在机架上风干10分钟。试管应风干，直到最后可见的乙醇痕迹蒸发。样品过度干燥可能导致较低的回收率。
从架子上取下试管，然后上下吹打，将珠子重悬在50 µl不含DNase的水中。将试管放回机架上，静置3分钟。
当45 µl洗脱液位于磁性试管架上时，用移液管吸取。将洗脱液转移至新的1.5 ml微量离心管中。
使用KAPA2G HiFi PCR试剂盒进行第二轮PCR扩增。
使用前，请完成解冻，涡旋和旋转试剂（酶除外）的处理。
使用以下配方制作一轮第二轮PCR混合物（总体积为25 µl）。
10 µl的5 × KAPA HiFi缓冲液

1 µl dNTP

1 µl通用适配器

1 µl索引适配器

0.5 µl KAPA HiFi聚合酶

从第一轮PCR中提取2 µl纯化的DNA。

通过上下移液几次将其混合均匀。将试管转移到热循环仪上。使用以下热循环仪程序进行cDNA合成。
95 °C 2分钟
35个循环：
98 °C持续20 s

63 °C持续15 s

72 °C持续30 s

72 °C 3分钟
使用QIAGEN MinElute凝胶提取试剂盒对PCR产物进行凝胶纯化。
进行凝胶提取之前，请在1％琼脂糖凝胶上运行2 µl PCR产物，以检查文库的大小是否正确。
用溴化乙锭制成1.2％（w / v）琼脂糖凝胶（终浓度为0.2-0.5 µg / ml ）。
将所有第二轮PCR产物加载到1.2％琼脂糖凝胶上。根据凝胶大小调整电压。理想的电场强度为4 V / cm。运行凝胶30分钟。
在非紫外线蓝光透照仪上精确切割目标DNA片段（500 bp至1 kb）。
称量凝胶；将3体积的Buffer QG加到1体积的凝胶中。
在50 °C下孵育10分钟以完全溶解凝胶片段。每2-3分钟涡旋一次以帮助溶解。
检查凝胶溶液的颜色（应为黄色，否则应加入10 µl 3 M pH 5.0的乙酸钠）。
应用样品到的MinElute柱和离心机中以最大速度为1分钟。
将色谱柱转移到新的收集管中，弃去滤液，加入500 µl QG缓冲液并以最大速度离心1分钟。
将色谱柱转移到新的收集管中，弃去滤液，加入0.75 ml PE缓冲液，在室温下孵育5分钟，以最大速度离心1分钟。
将色谱柱转移到新的收集管中，弃去滤液，以最大速度离心3分钟。
将色谱柱放入新的1.5 ml试管中，加入10 µl EB缓冲液。静置4分钟，以最大速度离心2分钟。
量化，合并和QA / QC。
按照制造商的方案，使用Qubit dsDNA BR Assay试剂盒对每个凝胶纯化的文库进行定量。每次定量使用1 µl文库。
以等量合并量化的单个库。我们建议合并总共20-24个文库，每个文库具有100至150 ng DNA。如果计算出的容量超过实际容量，请使用库的最大可用容量。
按照上文“第一轮PCR”部分中的方案，使用AMPure XP珠子纯化文库。要使用的AMPure磁珠的体积等于合并库的体积乘以0.7。
按照制造商的规程，使用Qubit dsDNA BR Assay试剂盒定量纯化的合并文库。
按照制造商的规程，使用带有DNA 12k分析试剂盒的Experion自动电泳系统运行合并的文库。的凝胶图像的一个例子的Experion示于图URE 4。
检查Experion凝胶图像上DNA峰的大小。确保在100 bp附近（引物二聚体）没有可见的峰。如果存在，请再次用AMPure XP珠子纯化合并的文库，然后重复定量和Experion电泳。
使用以下公式，根据Experion摩尔浓度（nM ）和Experion浓度（ng / µl ）计算文库池的平均DNA大小（bp ）。不要使用Qubit浓度来计算平均DNA大小。

笔记：

重要的是将cDNA反应设置在单独的房间中，在该房间中进行PCR扩增，以避免潜在的PCR产物污染。
此协议中的病毒RNA量很少，可能无法测量。通常建议使用qRT -PCR在文库制备之前确认病毒RNA的拷贝数。对于每种文库制备，我们建议至少输入1,000份输入病毒RNA。但是，此协议可能仍可用于少于1,000个输入病毒RNA副本，且采样深度受到影响。
仅当对多重区域进行测序时才需要引物混合。仅对一个区域测序时，可以使用一组10 µM浓度的cDNA /正向引物。
复用区域通常不应重叠，因为这可能会抑制启动和/或扩增的效率。
每一批文库制备应包括一个阴性对照，可能还包括一个阳性对照。
建议将RNAclean XP珠子和AMPure XP珠子等份分成1 ml等分试样。使用前，将珠子在室温下加热30分钟非常重要。
珠粒与cDNA / DNA的体积比为0.7。它经过优化，可去除长的Primer ID cDNA引物或PCR引物。
我们建议对某些临床标本，尤其是血浆标本，进行第二轮cDNA纯化，以去除下游扩增的抑制剂。将cDNA用水洗脱后（在这种情况下，使用40 µl水），添加28 µl新的RNAclean XP珠并再次纯化cDNA 。
cDNA或PCR产物洗脱液中的残留珠子不会影响下游扩增。
第一轮和第二轮PCR扩增使用两种不同的KAPA PCR试剂盒。酶和缓冲液管看起来相似。对于PCR 1和PCR 2，使用正确的缓冲液和正确的酶非常重要。
如果需要重复PCR2，请将第一轮PCR产物保存在-20 °C的1.5 ml管中。
确保在凝胶提取过程中切除适当大小的片段。有时，较大的片段（1.5-3 kb）可以存在于凝胶上，不应提取。
库浓度通常应至少为20 ng / µl。丢弃浓度低于10 ng / µl的文库，因为它们不太可能具有高质量序列。
Qubit 2.0荧光计已停产。编写此协议时，可以使用Qubit 4.0荧光计。
不建议使用Qubit dsDNA HS Assay试剂盒定量文库。HS试剂盒的检测上限为100 ng / µl。在某些情况下，文库浓度可能高于100 ng / µl 。
该协议中使用了Bio- R ad Experion系统，但已过时了。更好的替代方法是安捷伦TapeStation系统（安捷伦，目录号：G2991AA）。该TapeStation系统可以直接测量文库池的平均DNA大小。

图4. Experion凝胶图像示例

MiSeq测序运行
所述MiSeq是一个集成的仪器，其执行克隆扩增，基于测序边合成，并用碱通话，对准，变体呼叫数据分析，并在单次运行报告DNA测序。在我们的方案中，我们使用MiSeq试剂盒V3（600个循环）进行测序。图URE 5示出了MiSeq试剂盒和内容通过公号码。该步骤基于MiSeq V3协议进行了修改。

图5. MiSeq试剂筒和孔数的内容

准备试剂盒。
从-20°C的存储中取出试剂盒。
将试剂盒放入仅包含足够室温的去离子水的水浴中，以浸没试剂盒的底部。请勿让水超过试剂盒上印制的最大水线。
让试剂盒在室温水浴中融化约60分钟或直至完全融化。
从水浴箱中取出滤筒，然后在工作台上轻轻拍打以将水从滤筒底部排出。如有必要，请干燥墨盒的底座。
翻转试剂盒十次以混合解冻的试剂，并目视检查所有位置是否解冻。
目视检查标记为IMT（掺入混合物）的物料，以确保其完全混合并且没有沉淀。
轻轻地在工作台上轻敲小柱以将水从小柱的底部排出，并减少试剂中的气泡。
注意：MiSeq吸管会移到每个板孔的底部，以吸出试剂，因此，重要的是，试剂池的底部必须没有气泡。

将试剂盒放在冰上或放在2°C至8°C的温度下，直到准备好将样品加载到试剂盒上并开始运行为止。
准备库。
变性DNA
在上样当天准备新鲜的0.2 N NaOH稀释液。为了使样品完全变性以在MiSeq上生成簇，这是必不可少的。始终从浓度为10 N或更高的NaOH浓溶液开始，否则您可能会降低簇密度。
根据Qubit浓度和平均DNA大小计算合并文库的摩尔浓度，将合并文库稀释至4 nM 。
在微量离心管中合并以下体积的样品DNA和0.2 N NaOH ：
4 nM样品DNA（5 µl）
0.2 N NaOH （5微升）
短暂涡旋混合样品溶液，然后短暂离心样品溶液。
在室温下孵育五分钟以使DNA变性成单链。
将以下体积的预冷HT1加入含有变性DNA的试管中，以产生20 pM变性文库：
变性的DNA（10μl ）
预冷的HT1（990μl ）（在MiSeq试剂盒盒中冷冻后发货）
将变性的DNA放在冰上，直到准备进行最终稀释为止。
稀释的变性DNA
使用以下体积将变性的DNA稀释至8 pM的浓度：
20 pM DNA（400微升）
预冷HT1（600 µl）
短暂涡旋以混合DNA溶液。
脉冲离心DNA溶液。
将变性和稀释后的DNA放在冰上，直到您准备直接或在添加PhiX控件后将样品加载到MiSeq试剂盒上。
变性和语UTE PhiX控制
PhiX用作Illumina提供的内部测序对照。使用以下说明变性10nM PhiX文库并将其稀释至8 pM 。这将导致簇密度为750-850 K / mm 2 。
合并以下卷以将PhiX库稀释到2 nM ：
10 nM PhiX库（2μl ）
10 mM Tris- H Cl ，pH 8.5，含0.1％Tween 20（8μl ）
将以下体积的2 nM PhiX文库和0.2 N NaOH在微量离心管中合并，得到1 nM PhiX文库：
2 nM PhiX库（10μl ）
0.2 N NaOH （10微升）
简短地涡旋混合1 nM PhiX库解决方案。
短暂离心模板溶液。
在室温下孵育五分钟以使PhiX文库变性为单链。
将以下体积的预冷HT1加入含有变性PhiX文库的试管中，得到20 pM PhiX文库。
变性PhiX库（20微升）
预冷HT1（980μl ）
如下将变性的20 pM PhiX文库稀释至8 pM ：
20 pM变性PhiX文库（400μl ）
预冷的HT1（600μl ）
混合样品库和PhiX控件
将以下体积的变性PhiX对照文库与变性样品库结合在一起，可得到15％的体积比：
8日下午PhiX控制库（105微升）
变性样品库（595微升）
将合并的样品库和PhiX控件放在冰上，直到准备好将其加载到MiSeq试剂盒上为止。
将样品库装载到试剂盒上
使用单独的，干净且空的1 ml移液器吸头，将箔封条刺穿试剂盒上标有“装载样品”的储液罐，位置17。
移液器700微升您的样本库到加载样本库。
将旧的Nextera底漆装载到墨盒上。
Old Nextera底漆是自定义的Read 1底漆，可加到试剂盒上的位置12。表1中列出了旧的Nextera引物序列。
在新的微量离心管中，加入3.8 µl 100 µM Old Nextera底漆，并置于冰上。
使用单独的，干净且空的1 ml移液器吸头，将箔封条刺穿试剂盒上容器位置12上的箔纸密封件。
吸管大约500微升的Read 1引物混合物的出使用1ml血清移液管的墨盒。
使用旧的Nextera底漆将Read 1底漆混合物添加到试管中。
短暂涡旋混合底漆溶液，然后短暂离心分离溶液。
用1 ml移液器吸头将整个引物溶液移液回试剂盒上的位置12。
注意：请勿刺破任何其他试剂位置，当将试剂盒装载到仪器上时，它们会被刺穿。

使用MiSeq控制软件（MCS）界面直接进入运行设置步骤。表2中列出了MCS所需的索引序列。

笔记：

在Illumina实验管理器（用于创建样本表的软件）中，有一个选项可以选择“ Read 1的自定义引物”。由于我们正在将自定义引物添加到位置12，因此我们不选择该选项。
仔细检查引物序列是否正确，并将其稀释至100 µM。重要的是，定制引物必须与位置12的其他引物充分混合。我们建议将3.8 µl引物吸移到新的Eppendorf管中。然后取出位置12的内容物并将其添加到Eppendorf管中。涡旋混合均匀。然后将所有内容物吸移回试剂盒的位置12。点击墨盒以确保液体落到试管底部。
千万不要加旧NEXTERA入门到位置18至20（定制测序引物）。
NaOH的储备溶液必须为10 N或更高，这一点非常重要。有些人尝试使用5 N或2 N的库存。由于某种原因，这些较低浓度的储备液不能很好地进行变性，因此必须在将样品装入MiSeq的当天进行0.2 N的稀释。
如果变性后的20 pM PhiX文库在-15°C至-25°C下保存，则最多可保存三周。三周后，簇数趋于减少。

数据分析

使用Illumina bcl2fastq管道（v.2.20.0）进行初始数据处理。该管道将根据其条形码对序列进行多路分解。在此实验设计中，每个带条形码的文库都是从RNA样本（处理组或对照组）构建的文库。在此步骤中，仅对库条形码进行多路分解。区域和Primer ID多路分解将在以下步骤中完成。
使用TCS管道（v.1.3.8）对每个目标区域进行多路分解并创建模板共有序列。有两种处理方法。
（推荐）使用TCS Web应用程序（https://tcs-dr-dept-tcs.cloudapps.unc.edu/）自动处理原始MiSeq序列。该Web应用程序询问每个测序区域的信息，包括名称，cDNA引物序列和第一轮PCR正向引物序列。选择直接上传，UNC Longleaf序列存储库或Dropbox来上传原始MiSeq序列。处理后的序列将返回到用户提供的电子邮件地址。根据每个提交批次的文件大小，处理时间为20分钟至2小时。
按照脚本中的说明，使用TCS管道脚本（https://github.com/SwanstromLab/PID/blob/master/TCS.rb）手动处理MiSeq原始序列数据。建议在运行TC后使用TCS管道' log_mutli.rb '（https://github.com/SwanstromLab/PID/blob/master/log_multi.rb）中的文件排序和日志记录脚本对文件进行排序S管道。该脚本可以在没有附加支持的情况下使用Terminal和Ruby在Linux / MacOS平台上运行，并在安装了Terminal和Ruby的Windows平台上运行。
在TCS管道中使用“ end_join.rb ”脚本（https://github.com/SwanstromLab/PID/blob/master/end_join.rb）连接成对的末端序列。
TCS的数量是一个重要的参数，它揭示了随着实际查询的初始模板的数量而增加了测序的采样深度。
使用RUBY包' viral_seq '（1.0.8）计算每个样本的突变率。可以在TCS管道（https://github.com/SwanstromLab/PID/blob/master/mut_table.rb）中找到可执行脚本。该脚本将每个单独的序列与样本共有序列进行比较，并生成一个表格，列出每种替换类型的频率。

笔记：

TCS管道的较新版本（版本≥2.0.0 ）作为可执行的命令行工具包含在RUBY软件包“ viral_seq ”（版本≥1.0.8 ）中。它具有几个主要更新，包括末端连接功能以及TCS的创建，因此建议将来使用。
作者致力于改善生物信息学分析流程。如有任何相关问题，欢迎用户与作者联系。

致谢

我们想感谢以下资金来源：授予TPS和RSB的美国国家过敏和传染病研究所R01 AI132178 。和NIAID 5R01 AI140970授予RS。我们感谢UNC高通量测序设施为开发此协议所提供的帮助。该协议已用于我们先前发布的工作中（Sheahan等，2020）。

利益争夺

北卡罗莱纳大学正在寻求对Primer ID的IP保护，RS已获得象征性的特许权使用费。

参考

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