材料和试剂

以下列表提供了我们在实验室中日常使用的材料和设备的示例。但是，具有类似规格的试剂和设备也可以使用。

蜂星细胞培养的多孔板（6-24孔）（格雷纳生物一个，Ç atalog数小号：657 160 [6-孔; 665 180 [12孔]; 662 160 [24孔] ）
康宁60毫米超低附着培养皿（Corning，目录号：3261）
锅铲（TPP ，目录号99010）
血清移液管（格雷纳生物ø NE，目录号小号：76018 0 [ 2毫升]; 606180 [ 5毫升]; 607180 [ 10毫升]; 760107 [ 25毫升] ; 768160 [ 50毫升] ）
Bemis TM Curwood Parafilm TM M实验胶片（Fisher Scientific，产品代码HS234526C，目录号：10018130）
Greiner离心管（50 ml和15 ml）（Sigma - Aldrich，制造商：Greiner； 15 ml的目录号：T1818，50 ml的目录号：T2318）
液氮
康宁®基质胶®生长因子降低（GFR）基底膜基质，酚红-自由，自由LDEV-（康宁，C AS号：356231，格式10 ml的，储存在-20 ℃下，并按照供应商从用于制备说明）
CHIR 99021（开曼化工，CAS号：252917-06-9，Ç atalog号码：13122;产品形式：2.5毫克/毫升的在DMSO中;存储在-20 ℃下为6毫米的库存;稳定性：≥2年）
SB431542在溶液（MACS Miltenyi公司，CAS号：130-106-543，Ç atalog号：130-106-543;产品格式：10 mM的在DMSO中;存储在-20 ℃下为10 mM的库存，避光;稳定性：6个月小号）
Dorsomorphin （干细胞; CAS号：866405-64-3，Ç atalog号码：72102;产品格式10毫克固体;存储在-20 ℃下为5 mM的库存在DMSO（热施加）或乙醇;稳定性：12个月小号）
Purmorphamin （MAC小号Miltenyi公司，CAS号：483367-10-8; Ç atalog号：130-104-465的产品形式：5毫克固体;存储在-20℃下在DMSO中的10mM股票，避光）
（+） - L-抗坏血酸钠（维生素C）（默克，Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号：A4034;产品格式固体粉末;存储作为在水中200μM库存在-20℃下）
N-2补充（100 × ）（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：17502-048; p RODUCT格式：5 ml的液体;储存在-20 ℃下，避光;稳定性：18个月小号）
B27无维生素A（50 × ）（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：12587010; p RODUCT格式10 ml的液体;储存在-20 ℃下避光）
的Neurobasal ®培养基（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：21103049; p RODUCT格式：500 ml的液体;储存在2-8 ℃下，避光;保质期：12个月S）
DMEM / F12 ，HEPES（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：31330038;产品格式：500 ml的液体;储存于2-8 ℃，避光;保质期：12个月）
淘汰赛DMEM（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：10829018;产品格式：500 ml的液体;储存于2-8 ℃下避光
淘汰赛血清替代（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：10828010;产品格式：500 ml的液体;储存在-20 ℃下避光
StemMACS TM iPS- Brew XF，人类（MACS Miltenyi Biotec ，目录号：130-104-368）
mTeSR TM 1（STEMCELL Technologies，500毫升试剂盒的目录号：85850）
青霉素-链霉素（P / S; 10 ，000 U / ml的青霉素，10 ，000微克/毫升链霉素）（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号15140122;产品格式：100毫升液体;储存在-20 ℃;保质期：12个月）
L-谷氨酰胺（200 mM ）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：25030081;产品格式：100 ml液体;储存在-20 °C ，避光;保质期：24个月）
非必需氨基酸（NEAA，100 × ）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：11140035 ，产品形式：100毫升，储存于2-8 °C;货架寿命：12个月）
丙酮酸钠（100 mM ）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：11360070;产品格式：100 ml ;避光保存在2-8 °C;保质期：12个月）
MycoZap Plus-CL（L onza ，产品目录号VZA-2012;产品格式：20毫升液体;储存在-20 °C ，避光）
的StemPro TM的Accutase TM细胞解离试剂（热Fisher Scientific公司，Gibco公司/的StemPro ，目录号：A1110501;产品格式：100 ml的液体，储存在-20 ℃下，避光）
DPBS（不含钙和镁）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：14190250;产品格式：500毫升液体;储存于15-30 °C ;货架寿命：36个月）
ROCK抑制剂（RI），Y-27632 ，二盐酸盐（Enzo，CAS号：129830-38-2;目录号：ALX-270-333-M005;产品形式5 mg粉末;储存在-20 °C;可溶于DMSO浓度为25 mg / ml ；稳定性：原液在-20 °C稳定1个月）
UltraPure TM 0.5 M EDTA（Invitrogen，目录号：15575020）
Bambanker （NIPPON Genetics，目录号：BB03）
Shandon TM Immu-Mount TM （Thermo Scientific TM ，目录号：77-86-1；参考号9990402；正式产品：20 ml ）
抗巢蛋白抗体，克隆10C2（Millipore公司，目录编号：MAB5326;品牌系列：Chemicon公司® ）
抗Pax-6抗体（Covance，目录号：901301）
SOX2抗体（R＆D Systems，目录号：AF2018）
DACH1抗体（武汉三鹰，目录号：10914-1-AP）
抗β-管蛋白III（TUJ-1）（Sigma-Aldrich，目录号：T8578）
MAP2（突触系统，目录号：188004）
Hoechst 33342（Hoechst）（Invitrogen TM ，目录号：H3570）
16％多聚甲醛水溶液（PFA）（电子显微镜科学；目录号：50-980-487）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
Triton TM -X100（Sigma-Aldrich，目录号：T8532）
的Alexa氟TM 488驴抗兔IgG（H + L）二抗（热Fisher Scientific公司，目录号：A-21206）
的Alexa氟TM 647驴抗小鼠IgG（H + L）二抗（热Fisher Scientific公司，目录号：A-31571）
驴抗山羊Cy 3（Sigma - Aldrich，目录号：AP180C）
驴抗豚鼠Cy 3（Sigma - Aldrich，目录号：AP193C）
SYBR TM Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，目录号：4309155）
M- ML V逆转录酶（Invitrogen，货号：28025013）
RNeasy Mini Kit（50）（Qiagen ，目录号：74104）
RNA酶-免费DNA酶组（50）（Qiagen公司，目录号：79254）
寡（dT）12-18引物（Invitrogen公司，CATAL OG号：18418012）
的dNTP混合（10毫摩尔）（Invitrogen公司，CATAL OG号：18427088）
带条形码的MicroAmp TM Optical 348孔反应板（Thermo Fisher Scientific，目录号4438814）
基本介质1（BM1）（请参阅配方，表1）
BM2（sm- ）培养基（请参见配方，表1）
M1介质（请参见配方，表2）
M2介质（请参见配方，表2）
M3（sm +）培养基（请参见配方，表2）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5810R）
水浴（赛飞世尔科技，FISHERBRAND TM ISOTEMP TM数控恒温水浴：中号奥德尔220）
用于细胞培养的CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus BBD 6220）
用于iPSC培养的缺氧培养箱（Binder GmbH，型号：Binder BCB 160）
qPCR机（Thermo Fisher Scientific，型号：ViiA 7）
共焦显微镜系统（Zeiss，型号：Axio Imager Z1）
冷冻容器（Nalgene，型号：Frosty先生； Corning CoolCell TM ）
-80°C冰柜（新不伦瑞克省，型号：Innova 4725）
层流罩（BDK，Luft und Reinraumtechnik GMBH）
无菌剪刀（例如：锋利的手术剪刀，Sigma - Aldrich，目录号：Z265977）
摇床（洛克菲特，LTF劳工技术公司）

程序

一般来说：

在无菌条件下（例如，层流罩）工作。
在引擎盖下传送之前，请对试剂和消耗品进行消毒。
所有介质应准备新鲜，并在一周之内使用。
不要在水浴中解冻N-2 S补充剂和B-27补充剂。而是将它们在室温（RT，20-22 °C）下解冻2-4小时，或在冰箱（4°C）中过夜解冻。
在将所有介质应用于细胞之前，应预热所有介质。不要长时间将介质保持在37°C下，而应在室温下预热。
在37°C和5％CO 2的受控环境中培养NPC和iPSC 。
可选：我F可体，培养iPSC的低氧条件下（37℃，5％CO 2 ，5％氧气2 ），其更接近地模拟体内条件。
我们在StemMACS TM iPS- Brew XF或mTeSR TM 1上于无饲养层的条件下，在Matrigel包被的6孔板上培养iPSC 。
我们使用0.5 mM EDTA / PBS以1：4 -1：12的比率传代iPSC 。为了增加细胞存活率，我们建议每次分裂后以10 µM的浓度添加ROCK抑制剂（RI）。

NPC生成的分步协议
第0天（星期一）：ħ arvesting所述的iPSC的上和转印康宁超低吸附60毫米/ 15mm宽的菜肴。

准备基本介质1（BM1 ）（表1）。
准备M1培养基（表2）。
选择一到两口iPSC （约80％汇合）。
除去培养基，并用DPBS冲洗孔两次，以除去死细胞和碎片。
使用Accutase （1 mg / ml）从板上分离细胞。添加0.5 - 1毫升/孔孵育2-5分钟，在37℃，在之间目视检查。
当菌落主要从板中分离时，继续进行。
添加4 - 10毫升PBS或培养基以降低的Accutase活性。
可选：中号echanically分离细胞用细胞刮刀，如果细胞不能完全分离的Accutase活动。
将细胞悬浮液转移至15 ml F alcon管（将两个孔合并），在水浴中使细胞沉降至底部（10-15分钟）。
可选：Ç在120 entrifuge ×克5分钟（潜在地更损坏但在一个更加固体丸粒更快的结果）。
通过移液（例如用5 ml血清移液管）从沉淀细胞中去除尽可能多的培养基。确保不以驱散或大吃细胞。
向细胞中加入5 ml M1，将细胞转移至未经处理的康宁超低附着60毫米/ 15毫米培养皿中（1：1 ：1；或者在高汇合的情况下增加X孔）。
在37°C，5％CO 2下孵育2天。
与M1一起孵育将形成漂浮在培养基中的胚状体（EBs）。如果他们在第1天附接至康宁超低附件60毫米/15毫米培养皿的底部，其分离由gentl ÿ使用1ml移液管吹吸（切断了用无菌剪刀尖！）。确保不给一丝一毫的浮动日圆。或者，使用细胞刮铲。将培养基保存在孔中，并使用细胞刮刀将EB轻轻刮出整个孔。

第2天（星期三）：50％的媒体交换到M2

准备BM2（sm- ）培养基（表1）。
准备M2培养基（表2）。
使用无菌剪刀剪掉1毫升移液器吸头的吸头。
转移的EB至15ml ˚F爱尔康使用1ml移液管末端管（切断的尖！）。
可选：如果已连接一些EB，请使用细胞刮铲分离EB。
让EB在37°C的水浴中静置15分钟。
删除50％的M1，然后添加50％的M2 。
可选：- [R EMOVE所有M1，并添加100％M2（但可能更具破坏性的细胞）。

8.转移将EB回到同一康宁ù LTRA-低附着使用1ml移液管末端60毫米/ 15 mm皿（切断的使用无菌剪刀尖端！）。

第3天（星期四）：100％的媒体交换到M2

准备M2培养基（表2）。
使用无菌剪刀剪掉1毫升移液器吸头的吸头。
转移的EB至15ml ˚F爱尔康使用1ml移液管末端管（切断的尖！）。
可选：我˚F必要，分离的EB使用细胞刮刀如前所述。
让EB在37°C的水浴中静置15分钟。
将培养基完全交换为100％的M2培养基（最终体积5-6 ml）。
转移的EB回到同一康宁超低附件使用1ml移液管末端60毫米/ 15 mm皿（切断的使用无菌剪刀尖端！）。

第4天（周五）：100％培养基交换至M3（sm +）并制备Matrigel包被的板

准备M3（sm +）培养基（表2）。
使用无菌剪刀剪掉1毫升移液器吸头的吸头。
转移的EB至15ml ˚F爱尔康使用1ml移液管末端管（切断的尖！）。
可选：我˚F必要，分离的EB使用细胞刮刀如前所述。
让EB在37°C的水浴中静置15分钟。
完全交换培养基到100％的M3（sm +）培养基（最终体积5-6 ml）。
转移的EB回到同一康宁超低附件使用1ml移液管末端60毫米/ 15 mm皿（切断的使用无菌剪刀尖端！）。
为第7天的准备工作涂上6孔板的Matrigel （步骤另行说明）。

第7天（星期一）：将细胞转移至基质胶包被的板中

准备M3 （sm +）培养基（表2）。
将EBs从康宁超低附件60 mm / 15 mm皿中转移到15 ml F alcon管中。使用1个毫升尖端（切断的尖！）。
我˚F必要，分离神经管样使用细胞刮刀作为EB中描述的地层。

让EB在37°C（10-15分钟）的水浴中沉淀下来。
删除旧媒体。
添加新的sm +介质。
使用普通的1 ml吸头将5-10次移液以切碎细胞。
将整个悬浮液转移到Matrigel涂层的6孔板中，根据EB的数量平均分配到2-X孔中。
最多填充2 ml sm +每6孔一次。
加入ROCK抑制剂（RI）（终浓度10 µM）。
注意：为增加细胞存活率，我们建议在前1-2次分裂中将RI添加到细胞中。之后，不需要RI！

检查第二天，类似NPC的细胞应该已经可见（请参见图1A）–右图，以及图1E）。
尝试将细胞保留在第一个孔中1周。
如有必要，请按照维护协议中的说明拆分电池。
注：筹备应该出现4-均匀后5代，表达巢蛋白，PAX6，和SOX2。NPC通常还表达未成熟的泛神经标记TUJ1。可以发生自发分化，并且某些细胞可以表达神经元标记MAP2。细胞不一定需要在6孔板中培养。

图1.人类iPSC衍生的NPC的生成和特征化。A.代表性图像的神经球，神经上皮细胞和神经祖细胞（NPC）。B.基质胶涂层良好的图像。比例尺：200 µm。C.从对照iPSC品系XM001 （Wang等人，2018）获得的NPC的免疫细胞化学染色后，对神经祖细胞标记物NESTIN，DACH1，PAX6和SOX2进行了染色。可以存在表达TUJ1或MAP2的细胞的自发分化。比例尺：100µm。D. Q的定量的实时逆转录PCR（定量RT -PCR）神经祖细胞标记SOX1的，巢蛋白，PAX6，和SOX2，和多能性相关标记OCT4，NANOG，DNMT3B，和DPPA4。转录水平在的NPC用GAPDH标准化housekeep ER基因（平均值= SD +/-; n = 3个的技术重复）并且相对于报告到所述转录的各控制iPSC系XM001的水平。E.来自第3代（p3）和第7代（p7）的神经祖细胞（NPC）的代表性图像，显示了形态向同质NPC培养的变化。比例尺：100 µm。

基质胶制备
在+4°C的冰上解冻冷冻的Matrigel （储存在-20°C）过夜（开）。
如批次数据表中所述，检查基质胶的蛋白质浓度（原液浓度）。
计算：将特定体积（= x）的冷KnockOut -DMEM添加到小瓶中10 ml解冻的Matrigel中，以将其稀释至5 mg / ml最终浓度。小瓶的库存浓度（= y）应写在批次数据表上。使用以下公式计算所需的体积：x = y * 2-10 ml。
在引擎盖下和冰上执行下一步！
准备一个预冷的50 ml F alcon管，其中装有一定体积的冷KnockOut -DMEM。
在标有1 M的冰上准备预冷的15 ml F alcon管。
快速将Matrigel转移至KnockOut -DMEM并仔细混合。
在每个预冷的15 ml F alcon管中分装1 ml稀释的Matrigel 。
将等分试样立即储存在-20°C下。
6/12孔板中的终浓度：200 µg / ml。

基质胶涂层板
将30 ml冷的KnockOut -DMEM转移到50 ml F alcon管中。
在冷的KnockOut -DMEM中按1:30的比例稀释1毫升等分试样。
重悬1毫升基质胶等份（15毫升˚F爱尔康管，-20℃）用5ml 30毫升冷淘汰赛-DMEM在15毫升˚F爱尔康管直到沉淀物解决了！（它中号AY需要一段时间）。
如C 2中所述，将1 ml Matrigel等分试样重新悬浮在30 ml冷KnockOut -DMEM中足以用于4个板。
6孔：1.25毫升。
12孔：500 µl 。
24孔：300 µl 。
将Matrigel -medium添加到孔中（请参见第4点）。
聚合：
存放在4 °C的冰箱中（优先！）。
在37°C下2 h是可能的。
使用前，请检查相衬中的聚合反应！细胞外基质的均匀分布形成应该是可见的（图1B）。涂层板可保存1-2周（4°C）。为了存储，用Parafilm密封板。
使用前，请在室温或37°C下预热板。

维护人大文化
媒体需要被改变每2次一天。
应用于细胞之前，应预热培养基。不要将介质长时间保持在37°C下，而应在室温下预热。
通常，根据细胞密度，每隔4-5天使用Accutase将细胞以1：3至1:10的比例分裂。

分裂NPC
1.吸出生长培养基。

2.加入500微升的Accutase和孵化在室温下2-5分钟或37℃，如果细胞不容易脱离。

3.稀的Accutase通过加入2毫升活性SM - （无任何补充）或PBS。

4.通过移液轻轻地分离细胞。

5.将细胞转移到15 ml F alcon管中，在室温以200 × g离心3分钟。

6.同时，准备Matrigel涂层板以铺板细胞。

吸基质胶-mix。
加入1 ml sm +，并保存在培养箱中直至进一步使用。
用2 ml DPBS填充空白孔。
注意：Matrigel涂层不应变干。

7.吸出上清液。

8.将沉淀重悬于sm +培养基中。

9.将细胞分配到Matrigel包被的6孔板中。

10.装满2 ml sm +的介质。

注意：为增加细胞存活率，我们建议在前1-2次分裂中向细胞中添加RI（10 µM）。之后，不需要RI！

冻结NPC
1.按照拆分步骤分离NPC。

2.重悬的NPC于0.5 ml的的SM + 。加入冷冻培养基（2 × sm +冷冻：sm + ，1：1）。

注10毫升的2 × SM +冻结通过混合2制备毫升的SM + 6毫升的淘汰赛-SR，和2毫升DMSO中。

3.或者，根据制造商的协议使用商业冷冻介质。

注意：例如F ，例如Bambanker （Nippon Genetics，目录号：BB03）。

4.转让再悬浮的NPC到冷冻管并放置小瓶在-80 ℃的低温-freezing容器。

注意：请使用诸如Frosty TM （Nalgene）先生之类的冷冻容器冷冻细胞，以使其以-1 °C /分钟的速度缓慢冷冻。

5.将NPC存放在-80 °C或液氮罐中，以长期存储（1-3年）。

解冻NPC
1.在37 °C的预热水浴中快速但轻轻地解冻含有NPC的冷冻管。

2.转移的NPC到15 ml的˚F爱尔康管组用1 ml的的SM +和高达10 ml的预温热的PBS中。

3.将细胞以200 × g离心3分钟。

4.除去上清液，将NPC重悬于sm +培养基中。

5.将NPC接种在先前准备的Matrigel包被的1：1平板上（请参阅使用Matrigel包被的平板）。注：一解冻，以支持细胞存活后DD 10μMRI。

NPC的免疫荧光表征
经过4-6次传代后，将NPC接种在含有12 mm盖玻片的Matrigel包被的24孔板上。当达到约80％的汇合度时，用PBS冲洗NPC，并在室温下用4％多聚甲醛（PFA）/ PBS溶液固定细胞15分钟。
除去PFA，并用不含钙/镁的PBS（PBS-/-）冲洗NPC 3次，每次5分钟。
在室温下将封闭溶液添加到细胞中1小时。
注意：封闭溶液是用10％驴血清和1％Triton X-100的PBS-/-和0.1％Tween - 20制备的。

孵育具有特定初级抗体的细胞过夜，在4℃在定轨振荡器（60 - 80转）。
注意：在封闭溶液中稀释一抗。本实验室常用的抗体如下：NESTIN（Millipore，1：200），PAX6（Covance，1：200），SOX2（Santa Cruz，1：100），DACH1（ProteinTech ，1：100），TUJ-1（ Sigma-Aldrich公司，1：1 ，000），MAP2（突触系统，1：1 ，000）。

用PBS-/-漂洗细胞3次，每次5分钟。
用特定的二抗和Hoechst染色（1：2500）将细胞孵育以在RT进行细胞核可视化至少1 h 。
注意：使用封闭液稀释二抗1：300。我们的实验室通常使用以下二抗：Alexa Fluor TM 488驴抗兔IgG（H + L）（Thermo Fisher Scientific），Alexa Fluor TM 647驴抗小鼠IgG（H + L）（Thermo Fisher Scientific），驴抗山羊Cy 3（Sigma-Aldrich）和驴抗豚鼠Cy 3（Sigma-Aldrich）。

用PBS-/-漂洗细胞3次，每次5分钟。
倒置盖玻片，并使用固定介质（IMMU-MOUNT TM或类似介质）将其固定在载玻片上。固定介质干燥后，可以通过共聚焦成像分析样品。

通过定量实时逆转录PCR（qRT -PCR ）鉴定NPC
根据制造商的说明准备SYBR Green PCR Master Mix。
将PCR主混合物和cDNA样品移液到384孔光学反应板（Applied Biosystems）中。
注意：根据制造商的协议，使用Qiagen的RNeasy Mini Kit（50）从细胞沉淀中提取RNA 。根据生产商协议，使用Thermo Fisher Scientific的莫洛尼鼠白血病病毒（M- ML V）反转录酶试剂盒生成cDNA 。对于每个靶基因，应一式三份测量cDNA样品和阴性对照。

如下设置PCR循环条件：1个循环50°C 2分钟，1个循环95°C 10分钟，40个循环95°C 15 s60 °C 30 s72 °C 30 s，1个循环72°C 10分钟
使用的引物是：
F或OCT4

F：GTGGAGGAAGCTGACAACAA和R：ATTCTCCAGGTTGCCTCTCA

F或NANOG

F：CCTGTGATTTGTGGGCCTG和R：GACAGTCTCCGTGTGAGGCAT

F或SOX2

F：GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG和R：TCCTAGTCTTAAAGAGGCAGCAAAC

F或DNMT3B

F：GCTCACAGGGCCCGATACTT和R：GCAGTCCTGCAGCTCGAGTTTA

F或DPP4

F：TGGTGTCAGGTGGTGTGTGTGG和R：CCAGGCTTGACCAGCATGAA

F或VIM

F：GGAGCTGCAGGAGCTGAATG和R：GACTTGCCTTGGCCCTTGAG

F或NESTIN

F：TTCCCTCAGCTTTCAGGAC和R：GAGCAAAGATCCAAGACGC

F或PAX6

F：GAATTCTGCAGACCCATGC和R TCTCGTAATACCTGCCCAG

F或SOX1

F：TTGGCATCTAGGTCTTGGCTCA和R：CGGGCGCACTAACTCAGCTT

F或SOX2

F：GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG和R：TCCTAGTCTTAAAGAGGCAGCAAAC

F或GAPDH

F：CTGGTAAAGTGGATATTGTTGCCAT和R：TGGAATCATATTGGAACATGTAAACC

数据分析

使用Zeiss Axio Imager Z1共焦显微镜结合AxioVision V4.6.3.0软件可以可视化荧光图像。可以在使用AxioVision V4.6.3.0软件进行图像采集期间直接合并图像，或者之后使用Adobe Photoshop CS6（美国加利福尼亚州的Adobe）合并图像。

使用SYBR Green PCR Master Mix和ViiA TM 7 Real-Time PCR System（Applied Biosystems，California，USA ）通过qRT -PCR进行基因表达分析。再各基因的lative转录物水平来计算基于所述2 - ΔΔCT方法。将数据标准化为管家基因GAPDH，并表示为与对照iPSC有关的平均LOG2比。

菜谱

媒体FORMUL通货膨胀（表1和表2）：

1.所有介质应准备新鲜，并在一周内使用。

2.请勿在水浴中解冻N - 2补充剂和B - 27补充剂。而是将它们在室温下融化2-4小时，或在冰箱（4 °C）中过夜解冻。

3.在将所有介质应用于细胞之前，应预热所有介质。不要将介质长时间保持在37 °C下，而应在室温下对其进行预热。

表1.基本培养基配方

表2.培养基配方

致谢

我们承认，从支持的德意志研究联合会（DFG）（PR1527 / 5-1 AP），健康（BIH验证资金AP），国家科学中心的火花柏林研究所，波兰（第22分之2016/ M / NZ 2 / 00548 ;第二十七分之二千零十七/ B / NZ1 / 02401至PL），美国线粒体疾病基金会（UMDF到AP），以及对教育的德国联邦与研究部（BMBF）（AZ.031A318 ＆031L0211到AP）。最初的研究论文是：Lorenz等。（2017年）。

利益争夺

作者宣称没有相互竞争的金融和非金融相互竞争的利益。

伦理

这项研究得到了海因里希·海涅大学医学院的伦理委员会的批准（研究编号2019/681）。

参考

Beckervordersandforth ，R.（2017年）。线粒体代谢介导的成人神经发生调控。Brain Plast 3（1）：73-87。
Bénit ，P.，Schiff，M.，Cwerman -Thibault，H.，Corral- Debrinski ，M.和Rustin，P.（2016）。线粒体疾病的药物开发：最新进展，当前挑战和未来前景。专家OPIN孤儿药4 ：83 - 92。
腔室，SM，法萨诺，CA，Papapetrou ，EP，Tomishima ，M.，Sadelain ，M。和Studer的，L。（2009）。通过双重抑制SMAD信号传导对人类ES和iPS细胞进行高效的神经转化。Nat Biotechnol 27（3）：275-280。
Cunnane ，SC，Trushina ，E.，Morland ，C.，Prigione ，A.，Casadesus ，G.，Andrews，ZB，Beal，MF，Bergersen ，LH，Brinton，RD，de la Monte，S.，Eckert，A 。，Harvey，J.，Jeggo ，R.，Jhamandas ，JH，Kann ，O.，la Cour ，CM，Martin，WF，Mithieux ，G.，Moreira，PI，Murphy，MP，Nave，KA，Nuriel ，T 。，Oliet ，SHR，Saudou ，F.，Mattson，MP，Swerdlow ，RH和Millan，MJ（2020）。脑能量抢救：衰老的神经退行性疾病的新兴治疗概念。Nat Rev Drug Discov 19（9）：609-633。
Elkabetz ，Y.，Panagiotakos ，G.，铝Shamy ，G.，索奇，ND，塔巴尔，五和Studer的，L.（2008）。人类胚胎干细胞来源的神经花环揭示了功能上独特的早期神经干细胞阶段。基因开发22（2）：152-165。
Inak ，G.，Lorenz，C.，Lisowski ，P.，Zink，A.，Mlody ，B. and Prigione ，A.（2017年）。简要评论：诱导多能干细胞为基础的线粒体疾病药物发现。干细胞35（7）：1655-1662。
Khurana ，V.，Tardiff ，DF，Chung，CY和Lindquist，S.（2015）。迈向基于干细胞的神经退行性疾病表型筛选。Nat Rev Neurol 11（6）：339-350。
Kim，DS，Lee，JS，Leem，JW，Huh，YJ，Kim，JY，Kim，HS，Park，IH，Daley，GQ，Hwang，DY和Kim，DW（2010）。无论人类ES和iPS细胞先天的分化倾向如何，神经分化的鲁棒性增强。干细胞研究报告6（2）：270-281。
马萨诸塞州兰开斯特市，伦纳州M.市，马丁州CA，温泽尔市D.，比克内尔市LS，Hurles市，ME市，Homfray市，T。市，彭宁格市，JM，杰克逊市，AP和诺布利希市（JA）。脑类器官模拟人脑发育和小头畸形。自然501（7467）：373-379。
李威，孙威，张瑜，魏威，Ambassudhan ，R，夏萍，塔兰托娃，M。，林婷，金洁，王新。 Kim，WR，Lipton，SA，Zhang K. and Ding，S.（2011年）。小分子抑制剂可快速诱导人类胚胎干细胞中的原始神经前体并对其进行长期自我更新。PROC国家科科学院科学美国阿108（20）：8299-8304。
洛伦茨，C.，Lesimple ，P.，Bukowiecki ，R.，锌化，A.，INAK ，G.，Mlody ，B.，辛格，M.，Semtner ，M.，马，N.，艾于勒，K.， Leong，M.，Zabiegalov ，O.，Lyras ，EM，Pfiffer ，V.，Fauler ，B.，Eichhorst ，J.，Wiesner ，B.，Huebner，N.，Priller ，J.，Mielke ，T.，Meierhofer ，D.，Izsvak ，Z.，Meier，JC，Bouillaud ，F.，Adjaye ，J.，Schuelke ，M.，Wanker，EE，Lombes ，A. and Prigione ，A.（2017年）。人类iPSC衍生的神经祖细胞是一种有效的药物发现模型，可用于治疗神经性mtDNA疾病。细胞干细胞20（5）：659-674 e659。
Lorenz，C.和Prigione ，A.（2017年）。早期神经命运中的线粒体代谢及其与神经元疾病建模的相关性。Curr Opin Cell Biol 49：71-76。
保罗，SM，迈特尔卡，DS，邓维迪，CT，佩辛格，CC，穆诺斯，BH，林堡，SR和沙赫特，阿拉巴马州（2010）。如何提高研发生产率：制药业的巨大挑战。Nat Rev Drug Discov 9：203-214。
莱德黑德，B。，哈特利，BJ，伊斯特伍德，BJ，科利尔，DA，埃文斯，D。，法里亚斯，R.，He，C。，霍夫曼，G。，斯科拉，P。，达德利，JT，沙特，EE，Savic ，R.和Brennand ，KJ（2018）。精神分裂症患者神经祖细胞的基于表达的药物筛选。Nat Commun 9（1）：4412。
Reinhardt，P.，Glatza，M.，Hemmer，K.，Tsytsyura，Y.，Thiel，CS，Hoing，S.，Moritz，S.，Parga，JA，Wagner，L.，Bruder，JM，Wu，G 。，Schmid，B.，Ropke，A.，Klingauf，J.，Schwamborn，JC，Gasser，T.，Scholer，HR and Sterneckert，J.（2013）。仅使用小分子人类神经祖细胞进行神经退行性疾病建模的推导和扩展。PLoS One 8（3）：e59252。
Takahashi，K.，Tanabe，K.，Ohnuki ，M.，Narita，M.，Ichisaka ，T.，Tomoda ，K.和Yamanaka，S.（2007）。诱导成年人成纤维细胞多能干细胞的确定因素。细胞131（5）：861-872。
Vierbuchen，T.，Ostermeier，A.，Pang，ZP，Kokubu，Y.，Sudhof，TC和Wernig，M.（2010）。通过定义的因素将成纤维细胞直接转化为功能性神经元。自然463（7284）：1035-1041。
Walter，J.，Bolognin ，S.，安东尼，PMA，镍，SL，Poovathingal ，SK，萨拉曼卡，L.，Magni ，S.，Perfeito ，R.，Hoel ，F.，Qing，X.，Jarazo ，J 。，Arias- Fuenzalida案，J.，Ignac ，T.，Monzel ，AS，冈萨雷斯卡诺，L.，Pereira的德阿尔梅达，L.，Skupin ，A.，Tronstad ，KJ，Schwamborn ，JC（2019）。帕金森氏病患者的神经干细胞表现出异常的线粒体形态和功能。干细胞报告12（5）：878-889。
Wang X，Sterr，M.，Burtscher，I.，Chen，S.，Hieronimus，A.，Machicao，F.，Staiger，H.，Haring，HU，Lederer，G.，Meitinger，T.，Cernilogar ，FM，Schotta，G.，Irmler，M.，Beckers，J.，Hrabe de Angelis，M.，Ray，M.Wright，CVE，Bakhti，M.和Lickert，H.（2018）。人类胰腺祖细胞中PDX1靶基因的全基因组分析。分子代谢9：57-68。
Zheng X.，Boyer，L.，Jin，M.，Mertens，J.，Kim，Y.，Ma，L.，Ma，L.，Hamm，M.，Gage，FH and Hunter，T.（2016））。从有氧糖酵解到神经元氧化磷酸化的神经元分化过程中的代谢重编程。网上生活5：e13374。