材料和试剂

1. VST硅酮弹性体（低粘度的，半透明的硅树脂）（10 × 10 × 1 。5枚2mm片材）（聚合条件：5巴压力，45℃，90分钟）（颌面硅氧烷体系，Technovent有限公司，南英国威尔士，目录号：VST-50HD Shore A 38，固化时间为一整夜。

2.培养皿（90毫米× 1 7毫米）（Isolab，目录号：08102061）

3.锥形烧瓶（250毫升）（Isolab，目录号：027.01.250）

4. 6孔板（Biofil，目录号：TCP 011006）

5. 24孔板（Biofil，目录号：TCP 011024）

6. 50 ml离心管（Orange Scientific，目录号：4440100N）

7.念珠菌菌株（临床念珠菌分离物，先前表征为高度生物膜形成和使用18S rRNA基因序列分析鉴定;或生物膜阳性ATCC念珠菌菌株如白色念珠菌（罗宾）Berkhout（ATCC ® ，Ç atalog号：MYA -274 TM ）

8.柠檬草精油（默克，目录号：05521501）

9.羟丙甲纤维素软膏[羟丙甲纤维素4000 mPa.s 20％（w / w）；软石蜡白80％（w / w）] ，[ FNA（Formularium der Nederlandse Apothekers），荷兰药剂师配方，2013年] ，（Fagron，目录号：102064）

10.结晶紫粉末（默克，目录号：C0775-100G）

11.脑心脏输注（BHI）散剂（默克，目录号：M110493.0500）

12.琼脂（Merck，目录号：M101613.0500）

13. 96％乙醇（v / v）（Isolab，目录号：9200262500）

14. Extran MA 02（默克，目录号：107553）

15. K 2 HPO 4 （默克，目录号：7758-11-4）

16. KH 2 PO 4 （默克，目录号：7778-77-0）

17.蒸馏水

18.脑心脏灌注液（请参阅食谱）

19.脑心浸液琼脂（请参阅食谱）

20. 1％结晶紫溶液（请参阅食谱）

21. 10 mM磷酸钾缓冲液（请参见食谱）

设备

本生灯
瓷钵[外径10.5厘米，内径9.0厘米，内径4.5厘米。内容量100毫升。给打磨表面上釉，打磨表面不上釉，瓷杵（长度11厘米，打磨表面上不打磨，再上釉）] （Haldenwanger，柏林）
钳子
分光光度计（UV可见分光光度计;岛津制作所，型号：UV- 1700 ，Ç atalog号：206-98366A）
离心机（的Eppendorf，型号：5810R，用Eppendorf摇摆斗转子A-4-62，Ç atalog编号：5810000327）
pH计（康索特TM C3010台式多参数分析仪）（Fisher Scientific公司，Ç atalog号：11772009）
托马计数室（Neubauer，目录号：C964110）
高压灭菌器（Priorclave，货号：12758935）
光学显微镜（LEICA，型号：DM500）
培养箱（静态）（Dedeoglu，Ç atalog号：MMF-KM-068）

软件

MINITAB（版本18）
ImageJ（版本1.49）

程序

使用羟丙甲纤维素软膏制备精油涂层的硅橡胶表面（另请参见图1）
在无菌条件下，使用无菌瓷研钵和杵将羟丙甲纤维素软膏与特定精油（w / w）混合。
通过使用本生灯在无菌条件下，在无菌培养皿中放置一层精油/羟丙甲纤维素软膏混合物（50 mg）（w / w）。
用水冲洗2％Extran MA02，然后用自来水，70％乙醇溶液（v / v）和无菌软化水冲洗，以清洁硅橡胶表面片。
将无菌硅橡胶表面薄片（10 × 10 mm）放在一层精油/羟丙甲纤维素软膏混合物（w / w）的上面。
在硅橡胶表面上轻轻施加压力，以使精油/羟丙甲纤维素软膏混合物粘在材料上。
使用无菌镊子将精油涂层的硅橡胶表面薄片轻轻地从培养皿中取出，并将其放在无菌的6孔板的孔中进行进一步分析。
放置精油涂覆硅橡胶表面片材上的无菌垂直P ETRI盘，并把它们在光学显微镜（下× 10），以便捕获包含硅橡胶片和涂层两者的厚度的图像。
使用ImageJ Software将硅橡胶片的厚度设置为1.5 mm，并估计硅橡胶表面上的精油/羟丙甲纤维素软膏涂层的厚度。

图1.通过使用精油/羟丙甲纤维素软膏混合物制备精油包被的硅橡胶。A.将精油/羟丙甲纤维素软膏混合物置于无菌培养皿中。B.将无菌生物材料表面薄片放置在精油/羟丙甲纤维素软膏混合物层的顶部上，并在生物材料表面薄片上施加适度的压力以使精油/羟丙甲纤维素软膏混合物粘在材料上。C.轻轻地从培养皿中取出涂有精油的表面层。

测定在精油涂层表面上念珠菌生物膜的形成（另见图2）
通过条纹电镀技术将来自原种培养物中的念珠菌菌株（在BHI中用甘油培养）接种到脑心浸液（BHI）琼脂中，并在有氧条件下于37°C孵育24 h。
将念珠菌菌株的单个菌落接种到10 ml BHI肉汤中进行预培养，然后在37°C孵育过夜而不摇动。
在200 ml BHI肉汤中接种10 ml预培养物，使其在37°C下生长24 h，而无需摇动以获得主要培养物。
通过在5°C下以3,220 × g离心10分钟收获念珠菌细胞，并用30 ml 10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）洗涤3次。
计数念珠菌中存在的托马计数室的8米不同的介质的正方形在光学显微镜用40下细胞×物镜。计算单个培养基正方形的细胞平均值，并考虑Thoma计数室单个培养基正方形的体积，计算念珠菌细胞密度。在BHI肉汤中将细胞密度调整为3×10 6个细胞/ ml。
将精油涂层的硅橡胶表面，仅带有羟丙甲脂软膏的硅橡胶表面和不含任何涂层的硅橡胶表面（阳性对照）置于24孔板的孔中。
将2 ml念珠菌悬浮液添加到24孔板的孔中，其中包括不同的硅橡胶表面，并在有氧条件下于37°C孵育7天，不要摇晃。
孵育7天后，用10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7）轻轻洗涤三倍带有生物膜的材料，并在无菌蒸馏水中用1％（w / v）的结晶紫溶液在25°C下染色20分钟。 C。
随后，再次用10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）轻轻冲洗材料，直到洗涤液中没有结晶紫残留。
将与生物膜结合的结晶紫溶解在2 ml乙醇（96％； v / v）中的不同测试表面上20分钟（O'Toole，2011）。
使用分光光度计（O'Toole，2011）在560 nm下测量溶解的结晶紫的吸光度。

图2 。念珠菌的生物膜形成。A）硅橡胶表面的图像B）在8％柠檬草油涂层的硅橡胶表面上形成生物膜C）在0％柠檬草油涂层的硅橡胶表面上形成生物膜（仅羟丙基甲纤维素软膏）D）在没有涂层的硅橡胶上形成生物膜（阳性对照））。

数据分析

设置没有任何涂层和微生物的硅橡胶表面的吸光度值，但将其与生物膜生长和结晶紫染色的步骤相同，作为阴性对照。从具有生物膜的表面的吸光度值中减去该值。
评估没有涂层的硅橡胶表面上生物膜的形成，作为阳性对照，并将其设置为100％。将涂有羟丙甲纤维素软膏且无任何精油的硅橡胶表面设置为0％精油涂覆的表面。
使用以下等式，测量处理物生物膜形成的吸光度值，并计算处理物生物膜形成相对于阳性对照的减少量（％）：

降低百分比= [（（吸光度阳性对照（560 nm）–吸光度处理（560 nm））/吸光度阳性对照（560 nm）] × 100％

使用MINITAB 18软件进行统计分析。
应用安德森-达林测试以确定是否生物膜形成和生物膜抑制数据瓦特ERE正态分布的。此后，应用Levene检验来评估方差的均匀性。
如果发现结果呈正态分布，则应用两因素实验设计并通过Tukey测试进行成对比较。如果未发现结果呈正态分布，请使用非参数检验（Kruskal-Wallis和Mann-Whitney U检验）评估结果。

笔记

至少需要一式三份地通过修饰的结晶紫结合测定法确定精油包被的硅橡胶表面上念珠菌的生物膜形成，包括对照。
当吸光度太高时，将溶解的结晶紫稀释，然后将吸光度值乘以稀释倍数。

菜谱

脑心脏输液肉汤（1升）
将37 g BHI粉末溶于1 L蒸馏水中，并使用高压釜在121°C的温度下灭菌15分钟。

脑心浸液琼脂（1升）
在1 L蒸馏水中溶解37 g BHI粉末和30 g Agar-Agar粉末，然后在121°C下用高压釜灭菌15分钟后，将培养基放入无菌的陪替氏培养皿中。

1％结晶紫溶液（w / v）
将5 g结晶紫溶解在500 ml蒸馏水中，并将结晶紫溶液（1％，w / v）在摇动培养箱中于室温以150 rpm孵育2 h 。

10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）（1 L）
将4.35 g K 2 HPO 4和3.4 g KH 2 PO 4溶解在100 ml蒸馏水中，得到储备的0.5 M磷酸钾缓冲液。
将0.5 M磷酸钾缓冲液稀释至10 mM磷酸钾缓冲液。
使用pH计将缓冲液的pH值调节到7.0，并用高压灭菌器在121°C下消毒15分钟。

致谢

这项研究得到了土耳其安卡拉哈塞特佩大学科研项目协调部（授权号：FDK-2016-10821）的资助。该协议源自Sahal等人。（2020）。

利益争夺

该作者宣称没有竞争的经济利益。

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