材料和试剂

1.细胞培养烧瓶，75厘米2 （格雷纳生物一，蜂星® ，目录号：658175）

2.细胞培养皿，100/20毫米（格雷纳生物一，蜂星® ，目录号：664160）

3. 2 ml反应管（Greiner Bio-One，目录号：623201）

4. 3毫升无菌注射器（Ultident Scientific，目录号：BD-309657）

5.针头式过滤器0.2微米的亲水性聚醚砜，32mm直径（帕尔，的Acrodisc ® ，目录号：4652）

6. 10毫升无菌注射器（Ultident Scientific，目录号：BD-302995）

7.注射器过滤0.45微米醋酸纤维素亲水性，有28毫米直径的（赛多利斯，Minisart ® ，目录号：16555）

8. 15ml锥形管（格雷纳生物一，蜂星® ，目录号：188271）

9. 0.5 ml反应管（Greiner Bio-One，目录号：667201）

10.溴己二甲胺（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：H9268）

11. 48孔细胞培养板（Greiner生物一，蜂星® ，目录号：677180）

12. 1.5 ml反应管（Greiner Bio-One，目录号：616201）

13. 12孔细胞培养板（Greiner生物一，蜂星® ，目录号：665180）

14. 1.5 ml光保护反应管（Greiner Bio-One，目录号：616283）

15.细胞培养烧瓶，25厘米2 （格雷纳生物一，蜂星® ，目录号：690175）

16. 6孔细胞培养板（Greiner生物一，蜂星® ，目录号：657160）

17. 96-孔黑色细胞培养板（Greiner生物一，μCLEAR ® ，目录号：655096）

18. 24孔细胞培养板（Greiner生物一，蜂星® ，目录号：662160 ）

19. HEK 293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）

20.质粒：

pLenti - FlaviA -GFP-puro （来自Jorge L. Arias-Arias的礼物，Addgene质粒＃140088）

pLenti -CMV- FlaviA - mNeptune -puro （Jorge L. Arias-Arias的礼物，Addgene质粒＃140091）

pMD2.G（Didier Trono的礼物，Addgene质粒＃12259）

psPAX2（Didier Trono的礼物，Addgene质粒＃12260）

21.含100 µg / ml氨苄青霉素的LB琼脂平板（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：L5667）

22. LB汤（米勒）（默克，西格玛奥德里奇，目录号：L2542）

23. 100 mg / ml氨苄青霉素溶液（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：A5354）

24. NucleoSpin质粒微型试剂盒（Macherey -Nagel，目录号：740588.50）

25. DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX TM ，丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：10569044）

26.抗生素-抗真菌药100 × （Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：15240062）

27.合格的胎牛血清（FBS），经热灭活（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：10438-026）

28.线性亚乙基聚乙烯亚胺（PEI），MW 25000，转染等级（Polysciences ，PEI 25K TM ，目录号：23966-1）

29. UltraPure TM不含DNase / RNase的蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：10977015）

30.盐酸36.5-38.0％，生物试剂（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：H1758）

31. BHK-21 [C-13]（ATCC，目录号：CCL-10）

32. MEM，GlutaMAX TM补充品（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：41090101）。

33.丙酮酸钠，100 mM的（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，目录号：11360070）。

34. PBS，pH 7.4中（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，目录号：10010023）。

35. TrypLE TM表达酶（1 × ），无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：12604013）

36.嘌呤霉素二盐酸盐从链霉菌alboniger （默克，Sigma-Aldrich公司，目录号：P8833）

37.临床分离株DENV-2 / CR / 13538/2007 （哥斯达黎加，卡塔哥，Costarricense deInvestigaciónyEnseñanzaenNutricióny Salud研究所）（S oto-Garita等人，2016年）

38.疫苗株YFV / US / 17D / 1937（赛诺菲巴斯德，YF-VAX ® ）

39. FluoroBrite TM DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：A1896701）

40. GlutaMAX TM补充剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：35050061）

41.最低必需中型鹰牌AutoMod TM （默克，西格玛奥德里奇，目录号：M0769）

42.羧甲基纤维素钠盐（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：C4888）

43.碳酸氢钠（Merck，西格玛奥德里奇，目录号：S5761）

44.完整的DMEM （请参阅食谱）

45. PEI溶液（1毫克/毫升）（请参阅食谱）

46.聚乙烯溶液（10毫克/毫升）（请参阅食谱）

47.完整的MEM （请参阅食谱）

48. PBS 1％FBS （请参阅食谱）

49.嘌呤霉素溶液（10毫克/毫升）（请参阅食谱）

50. FluoroBrite TM DMEM 2％FBS （请参阅食谱）

51. 2％FBS斑块培养基（请参见食谱）

设备

生物安全柜（ESCO，Labculture ® II级，A2型，目录号：LA2-3A2-E）
CO 2培养箱（Thermo Scientific，型号：Forma Series II，目录号：3110）
4°C冰箱（Thermo Scientific，价值实验室，目录号：20LREETSA）
-20°C冰箱（Thermo Scientific，Value Lab，目录号：20LFEETSA）
-80°C冰柜（三洋，VIP系列，目录号：MDF-U32V）
水浴（PolyScience ，目录号：WBE20A12E）
离心机（Eppendorf，型号：5810）
微量离心机（Eppendorf，型号：5418）
移液器（T hermo Scientific，Finnpipette TM F2 GLP试剂盒，目录号：4700880）
移液器（T hermo Scientific，S1，目录号：9511）
血细胞计数器（Boeco ，Neubauer改进，目录号：BOE 13）
摇动培养箱（Shel Lab，目录号：SSI3）
恒温® C座仪（Eppendorf，目录号：5382000015 ）
涡旋混合器（T hermo Scientific，MaxiMix TM ，目录号：M16715Q）
紫外线交联剂（UVP，CL-100，目录号：UVP95017401）
NanoDrop TM 2000分光光度计（Thermo Scientific，目录号：ND-2000）
蒸汽灭菌器（大和号，目录号：SQ510）
净水系统（Merck，Milli -Q优势A10）
倒置显微镜（尼康，日食，货号：TS100）
流式细胞仪（BD Biosciences，BD Accuri TM C6）
细胞分选仪（BD Biosciences，BD FACSJazz TM ）
自动荧光显微镜（Biotek ，Lionheart FX）具有：
CO 2气体控制器（Biotek ，目录号：1210012）

ħ umidity室（Biotek的，目录号：1450006）

4 ×物镜（Biotek ，目录号：1220519）

20 ×物镜（Biotek ，目录号：1220517）

GFP过滤器立方体（Biotek ，目录号：1225101）

465 nm LED立方体（Biotek ，目录号：1225001）

Cy5过滤器立方体（Biotek ，目录号：1225105）

623 nm LED立方体（Biotek ，目录号：1225005）

软件

1. Gen5 Image +（Biotek ，https : //www.biotek.com ）

2. CellProfiler 4.0（Broad Institute，https： //cellprofiler.org/releases ）

程序

慢病毒载体的组装和滴定
部件

1.准备下列标准分子生物学程序质粒股票（https://www.jove.com/v/5062/plasmid-purification）和协议由制造商提供的的NucleoSpin质粒微型试剂盒（马歇雷-Nagel）。

2.用8 ml DMEM 10％FBS（配方1）在100/20 mm细胞培养皿中手动接种6,000,000个HEK 293T细胞，并在37°C和5％CO 2下孵育过夜，以达到70-80％融合度。有关播种细胞的详细步骤，请参阅Freppel等人的生物协议论文，2018年（参考文献3）。

3.使用移液器，除去并丢弃培养皿中的所有DMEM 10％FBS（〜8 ml），然后加入4 ml新鲜的DMEM 2％FBS（配方1），以更换培养基。

4.如下准备转染混合物：

悬浮液A：45 µl PEI 1 mg / ml（配方2 ）+ 955 µl未补充的DMEM（不含FBS和抗真菌药）。

悬浮液B：6微克pLenti -弗拉维亚-GFP-PURO或pLenti -CMV-弗拉维亚- mNeptune -puro + 6微克pMD2.G + 6微克psPAX2和带来至1,000微升与未补充的DMEM。

将悬浮液A与B混合，并在室温下孵育15分钟。

5.将2 ml转染混合物添加到细胞中（逐滴），并在37°C和5％CO 2下孵育过夜。

6.用6 ml新鲜的DMEM 2％FBS代替培养基，并在37°C和5％CO 2下孵育48小时。

7.收集培养上清液并过滤（孔径为0.45-μm）以清除细胞和碎片。使用蛋白质粘附力较低的过滤器，例如醋酸纤维素或聚醚砜（PES）。不要使用硝酸纤维素滤膜，因为它们可能会结合慢病毒颗粒。

8.准备500 µl等分试样，并在-80°C下储存。

滴定法

1.如上所述，在具有500μl/孔MEM 2％FBS（配方4）的48孔细胞培养板上，每孔接种50,000 BHK-21细胞，并在37°C和5％CO 2下孵育过夜。准备额外的孔以用作对照细胞。

2.在水浴中（37°C）解冻500 µl慢病毒等分试样之一，并以5 µg / ml的终浓度添加聚乙烯（配方3）。

3.准备10倍系列稀释液（10 -1 -10 -6慢病毒库存的）在1.5ml反应管中。将50 µl慢病毒颗粒开始在450 µl 2％FBS + 5 µg / ml聚乙烯（10 -1 ）的DMEM中混合。将试管涡旋5 s，然后将50 µl 10 -1慢病毒稀释液与450 µl DMEM 2％FBS + 5 µg / ml聚乙烯（10 -2 ）混合。对其他稀释液（10 -3 -10 -6 ）重复此步骤，并在室温下孵育15分钟。在稀释液之间更换吸头，以避免交叉污染。有关10倍系列稀释液制备的详细图形说明，请参阅Freppel等人于2018年发表的生物协议论文（参考文献3）。

4.用150 µl /孔的未稀释慢病毒原液及其各系列稀释液替换细胞培养基。向对照细胞中加入150 µl /孔的DMEM 2％FBS + 5 µg / ml聚乙烯。为避免交叉污染，从对照开始，依次稀释（从高到低稀释），再从未稀释的慢病毒原种开始，依次接种样品。

5.在25°C下以300 × g离心2 h以进行病毒吸附。

6. ř E放置用500μl/孔的DMEM 2％FBS并孵育48小时接种物在37℃和5％CO 2 。

7.弃去培养基，用100 µl /孔的PBS洗涤细胞一次，添加100 µl /孔的TrypLE TM表达（无酚红），在37°C下孵育5分钟，然后用400 µl /孔重悬细胞。 PBS 1％FBS的孔（配方5 ）。

8.根据报告蛋白的基础背景，并与未转导的对照细胞进行比较（图1），通过流式细胞仪确定GFP + （488 nm激光-530/30 nm滤光片）或mNeptune +（640慢病毒种子的不同稀释度感染的样品中存在1 nm激光-675/25 nm滤光片）细胞。有关荧光蛋白流式细胞术的详细步骤，请参阅Hawley等人（2004年）的协议（参考文献5）。

9.使用可检测的转导细胞的较高稀释度数据，使用下式计算以转导单位每毫升（TU / ml）为单位的生物效价：

TU / ml =（P×N / 100×V）×1 / DF

其中P = GFP +或mNeptune +细胞的百分比，N =转导时的细胞数量= 50,000，V =每孔的接种量= 0.15 ml，DF =稀释因子= 1（未稀释），10 –1 （稀释1/10）），10 –2 （稀释1/100）等（T iscornia等，2006）。

记者细胞系的生产和选择
生产

1.如上所述，在具有1 ml /孔的MEM 2％FBS的12孔细胞培养板上，每孔接种100,000 BHK-21细胞，并在37°C和5％CO 2下孵育过夜。为对照细胞准备一个额外的孔。

2.解冻在水浴（37℃）携带遗传构建编纂为任一慢病毒颗粒的500个微升等分试样的库存中的一个弗拉维亚-GFP或Flavia的-mNeptune记者和添加聚brene以5μg最终浓度/毫升

3.根据先前计算的以TU / ml为单位的生物学滴度，以500的感染率（MOI）为1 （每细胞1 TU ）制备500微升/孔的慢病毒接种物。如100,000个细胞每孔铺板在manteinance培养基（MEM 2％FBS），100000 TU必须在MEM 2％FBS + 5微克/毫升稀释聚凝胺至500的最终体积微升。在室温下孵育15分钟。

4.用500 µl /孔的len tiviral接种物替换细胞培养基。向对照细胞中加入500 µl /孔的MEM 2％FBS + 5 µg / ml聚乙烯。

5.在25°C下以300 × g离心2 h以进行病毒吸附。

6.用1 ml /孔的MEM 2％FBS代替接种物，并在37°C和5％CO 2下孵育48小时。

7.基于报告蛋白的基础背景，通过荧光显微镜在绿色/ GFP（FlaviA -GFP）和远红/ Cy5（FlaviA-mNeptune ）通道中监测转导的有效性。

选拔

1.为选择转导细胞的抗生素，用每孔750 µl含8 µg / ml嘌呤霉素的MEM 10％FBS代替培养基（R ecipe 6），并在37°C和5％CO 2下孵育过夜。对对照细胞进行相同的处理。

2.用1 ml /孔的MEM 10％FBS含4 µg / ml的嘌呤霉素替换转导和对照细胞的培养基。在光学显微镜下（通常24-48小时）证明在37°C和5％CO 2下孵育直至对照细胞的100％死亡率。

3.用1 ml /孔的MEM 10％FBS + 0.5 µg / ml嘌呤霉素替换所选细胞的培养基，并在37°C和5％CO 2下孵育，直至达到80-90％的融合度。

4.将选定的细胞加入5 ml MEM 10％FBS + 0.5 µg / ml嘌呤霉素的25cm²培养瓶中，并在37°C和5％CO 2下孵育，直至达到80-90％的融合度（https：// www.jove.com/v/5052/passaging-cells）。

5.对于FACS选择，丢弃培养基，用1 ml PBS洗涤细胞一次，加入500 µl TrypLE TM表达（无酚红），在37°C下孵育5分钟，然后用1 ml重悬细胞。每毫升PBS 1％FBS。

6.用血细胞计数器（https://www.jove.com/v/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells）计数细胞，并以1,000,000个细胞/ ml在PBS 1中制备2 ml细胞悬液。％FBS 。

7.将细胞悬液吸入细胞分选仪。对于FlaviA -GFP报道分子，使用FL1检测器（488 nm激光-530/30 nm滤光片）分离出至少两个具有不同但均一水平的报道者基础背景的细胞亚群（图1）。将相同的步骤应用于FlaviA-mNeptune报告基因，但使用FL4检测器（640 nm激光-675/25 nm滤光片）。

注意：FlaviA -GFP和FlaviA-mNeptune报告基因的基础背景使其对细胞表达水平敏感：如果表达过高，背景将掩盖报告基因激活后产生的信号。如果表达太低，则背景中将没有足够的报告信号。

图1. BHK-21 / FlaviA -GFP稳定细胞的FACS分析。A.直方图显示由于FlaviA -GFP报告蛋白的基础背景，野生型和报告BHK-21细胞之间绿色荧光（FL1检测器530/30 nm滤光片）之间的差异。B.散点图显示了具有不同水平的FlaviA- GFP报告基因的稳定BHK-21细胞群体的异质性。为了选择最佳的报告细胞（最高信噪比），必须分离至少两个具有不同（低，中或高）但均一水平的报告者基础背景的细胞亚群，并通过活细胞成像进行测试在黄病毒感染后。

8.小号EED孤立小区suppopulations在48孔细胞培养板的不同孔用1ml /孔的MEM 10个％FBS + 0.5微克/毫升PU霉素孵育在37℃和5％CO 2 ，直到达到汇合度为80-90％。

9.通道所选择的细胞的6 -孔细胞培养板用3ml MEM 10％FBS的+ 0.5微克/毫升嘌呤霉素孵育在37℃和5％CO 2 ，直到达到80-90％汇合。

10.根据步骤C中所述的方案，通过活细胞成像黄病毒感染动力学测试不同的分离细胞亚群。

注意：最好的报告细胞是黄病毒感染后具有最高信噪比的细胞。荧光信噪比的计算方法是，在相同的接种后时间，将用感染性病毒处理过的报告细胞的信号除以用紫外线灭活的病毒处理过的报告细胞所产生的噪声。

通过活细胞成像在报告细胞中的感染动力学
1.准备和滴度的黄病毒你选择的种子（例如，DENV，ZIKV，或YFV）根据tostandard病毒学方法（麦地那，F.等人，2012; ˚F reppel 。等人，2018）。为了使病毒灭活，将200 µl /孔的黄病毒种子放入24孔细胞培养板中，移开盖子，并以400,000 µJ / cm 2的能量将5个周期的紫外线（254 nm）暴露于紫外线交联剂中。在两次循环之间，用手摇动平板5秒钟。

2.如上所述，在含100 µl /孔MEM 2％FBS的µClear黑色96孔板中每孔接种15,000 BHK-21 / FlaviA -GFP稳定细胞，并在37°C和5％CO 2下孵育过夜。

3.根据以斑块形成单位（PFU）/ ml计算的黄病毒种子滴度，以低MOI（0.1至0.25）制备50 µl /孔的接种物。如15,000个细胞每孔在维持培养基铺板，1之间，500和3 ，750个PFUS必须在MEM 2％FBS稀释至50的最终体积微升/孔。乘以要接种的孔总数，并准备一个接种悬液。同样，准备紫外线灭活接种悬浮液。

4.用50 µl /孔的感染性或紫外线灭活的黄病毒接种物替换细胞培养基，并在37°C和5 ％CO 2中孵育2 h以进行病毒吸附。每15分钟用双手摇动平板5秒钟。

5.用150 µl /孔的FluoroBrite TM DMEM 2％FBS（配方7）替换接种物，并在37°C和5％CO 2下孵育动力学所需的时间（例如120 h）到自动荧光显微镜中。向周围的孔中加入200 µl /孔的PBS，以避免干燥。

6.使用您的显微镜的软件（例如，的Gen5图片+），节目中的图像采集与4 ×或20 ×物镜在绿色/ GFP通道在去播下感染后时间（图2A）。

注意：图像的采集参数（激发强度，曝光时间和相机增益）根据通过FACS分离的特定报告细胞亚群而变化。务必包括额外的控制室孔，以调整采集参数，因为过度暴露于激发光可能会损害实验条件的细胞。我们的建议是将这些参数设置为在动力学的第一张图像中仅能感知到报告蛋白背景信号的水平，以增加在被黄病毒蛋白酶激活后报告基因荧光的动态范围。

图2.通过活细胞成像在报告BHK-21细胞中的DENV-2感染动力学。A.将表达FlaviA -GFP报告基因的稳定BHK-21细胞感染性或UV灭活的DENV-2 13538以低MOI接种0.1，并在指定时间段通过活细胞成像捕获。放大倍数为40 × ，比例尺= 100 µm。B.使用CellProfiler 4.0软件对感染动力学进行图像分析，可以根据报告的荧光随时间推移显示单个细胞（图中的每个彩色线对应于单个细胞）。黑色虚线表示细胞荧光的平均值。

活细胞成像在报告细胞中进行动力学斑测定
1.如上所述，在含100 µl /孔MEM 10％FBS的µClear黑色96孔板中，每孔接种25,000 BHK-21 / FlaviA-mNeptune稳定细胞，并在37°C和5％CO 2下温育。

2.在1.5 ml反应管中准备黄病毒种子的10倍系列稀释液（10 -1 -10 -6 ）。将50 µl黄病毒种子开始混合在450 µl MEM 2％FBS（10 -1 ）中。将试管涡旋5 s，然后将50 µl 10 -1黄病毒稀释液与450 µl MEM 2％FBS（10 -2 ）混合。对其他稀释液（10 -3 -10 -6 ）重复此步骤。在稀释液之间更换吸头，以避免交叉污染。有关10倍系列稀释液制备的详细图形说明，请参阅Freppel等人于2018年发表的生物协议论文（参考文献3）。

3.用黄病毒种子每次系列稀释的50 µl /孔替换细胞培养基。用50 µl紫外线灭活的黄病毒种子接种对照孔。在37°C和5％CO 2下孵育2小时，以进行病毒吸附。每15分钟用双手摇动平板5秒钟。

4.用150 µl /孔的噬菌斑培养基2％FBS（配方8）替换接种物，并在37°C和5％CO 2下孵育120 h到自动荧光显微镜中。向周围的孔中加入200 µl /孔的PBS，以避免干燥。

5.使用您的显微镜的软件（例如，的Gen5图片+），节目中的图像采集（整个阱的蒙太奇）与4 ×在期望的感染后时间远红/ Cy5通道目标（图3A）。

注意：图像的采集参数（激发强度，曝光时间和相机增益）根据通过FACS分离的特定报告基因细胞的变化而变化。务必包括额外的控制室孔以调整采集参数，因为过度暴露于激发光可能会损害实验条件下的细胞。我们的建议是将这些参数设置为在动力学的第一张图像中仅能感知到报告蛋白背景信号的水平，以增加在被黄病毒蛋白酶激活后报告基因荧光的动态范围。

图3.通过活细胞成像在报告者BHK-21细胞中进行YFV动力学噬菌斑测定。A.用FlaviA-mNeptune报告基因的稳定BHK-21细胞接种感染性或紫外线灭活的YFV 17D的十倍稀释液（10 -1 -10 -6 ）。加入2％FBS噬菌斑培养基后，在指定的时间通过活细胞成像捕获平板的整个孔。放大倍数为40 × ，比例尺= 1,000 µm。B.用软件CellProfiler 4.0对动力学噬菌斑测定进行图像分析，可以鉴定单个病毒噬菌斑（上图）并随时间追踪这些噬菌斑（下图）。对于得到的结果有更深的例证我们的动能斑块的检测，请观看活细胞成像v IDEO （视频1 ）。

视频1.报告者BHK-21细胞的ZIKV噬菌斑测定动力学

数据分析

A.报告细胞中的感染动力学

使用我们的CellProfiler管道进行单细胞分析（“ SingleCellsTracking.cpproj ” ，图4 ），根据感染细胞的荧光进行单细胞跟踪（图2B ）。要执行此分析，只需将图像拖放到“图像”模块中，然后按“分析图像” 。为了修改适用于您的单元格和条件的管道，请转到“开始测试模式” ，调整模块中描述的参数（一个接一个），然后按“步骤”以查看应用于特定模块的修改的输出。准备好所有修改后，按Exit Test Mode并进入Analyze Images 。单细胞分析管道中包含的模块如下：

1.图像：只需将一个时间序列的图像文件拖放到“图像”模块中。确保数据集中所有文件的名称均包含测量荧光的通道的名称（例如GFP）和延时显微镜图像的连续编号（例如GFP_72h）。

2. NamesAndTypes ：在数据集中所有文件的名称中包含一个表达式，选择规则标准，在这种情况下，指示荧光的通道（例如GFP）。对于数据集的每个文件，它都会创建一个名为“ Sensor”的图像。

图4 。CellProfiler图像分析管道可用于单细胞追踪黄病毒感染的BHK-21 / FlaviA -GFP报告基因细胞

3. CorrectIlluminiationCalculate （照明功能计算：常规）：此模块从“传感器”图像中计算常规照明校正函数并创建具有增强对比度的图像，称为“ IllumSensor ”。

4. CorrectIlluminiationCalculate （照明功能计算：背景）：该模块从“传感器”图像中计算基于背景的照明功能，称为“ IllumSensorbackground ”。

5. RescaleIntensity ：将常规照明功能的输出图像（“ IllumSensor ”）转换为具有重新缩放强度的图像（“ RescaleSensor ”）。

6. CorrectIlluminationApply ：此模块将“ IllumSensorbackground ”校正功能应用于“ RescaleSensor ”图像，并生成名为“ CorrSensor ”的增强图像。

7. CorrectIlluminationApply ：第二个校正模块适用于原始“传感器”图像，应用“ IllumSensorbackground ”校正功能，但保留原始强度值，并生成称为“ mSensor ”的输出图像。

8. IdentifyPrimaryObjects ：此模块与增强型图像“ CorrSensor ”一起使用，以标识对象Cells 。您可以修改“典型”直径，以使用其他细胞系或参数获得正确的细胞分割。

9. MeasureObjectIntensity ：测量已识别对象单元格的强度，但在图像上具有仅通过照明（“ mSensor ”）校正的原始强度值。

10. TrackObjects ：此模块在延时显微镜下跟踪细胞，并生成称为“ TrackedCells ”的输出图像。

11. GraytoColor ，OverlayOutlines ，SaveImages ：这些模块创建并保存带有主要对象识别轮廓的彩色图像，以供研究人员的眼睛和标准进行文档记录和细胞分裂验证。

12. ExportToSpreadsheet ：将选定的度量保存到excel电子表格（例如，Integrated强度）。

注意：与该协议一起，我们提供了一个Zip文件“ SingleCellsTracking管道和数据集” ，其中包含应用的管道（“ SingleCellsTracking.cpproj ”）以及一个由单个输入图像组成的示例数据集来运行管道（“ Input_image_GFP ”），两个输出文件以确认预期结果（“ Output_image_GFP ”和“ Infected_Cells ”）。

B.报告细胞中的动力学噬斑测定

病毒斑块的鉴定和追踪是通过在CellProfiler中编程的两个不同管道进行的。对于单斑块识别，请使用我们的“ PlaqueIdentification.cpproj ”管道（图5）来生成图像，如图3B上面板所示。要在一个时间序列上跟踪斑块并确定每个识别出的斑块的细胞计数，请首先应用“ PlaqueIdentification.cpproj ”管道生成带有已识别斑块的图像，然后使用该图像和“ PlaqueTracking.cpproj ”管道（图6）获得跟踪图像，例如图3B下部面板中所示的那些图像。根据细胞类型和/或密度，可以使用“开始测试模式”选项并逐步运行每个模块来对几个参数进行一些修改，以实现最佳的噬菌斑识别。上述管道的模块如下：

图5.用于在BHK-21 / mNeptune报告细胞中鉴定黄病毒斑块的CellProfiler图像分析管线

图6.用于BHK-21 / mNeptune报告细胞中黄病毒斑块追踪的CellProfiler图像分析管线

斑块识别管线

1.图像：只需将一个时间序列的图像文件拖放到“图像”模块中。确保所有数据集中的文件名确实包括在该通道的名称测量荧光（例如，mNeptune ）和时间推移显微镜图像增加连续编号（例如，mNeptune_72h）。

2. NamesAndTypes ：与包含在数据集中的所有文件，在这种情况下的名称的表达式选择规则标准，表明荧光（的信道例如，mNeptune ）。对于数据集的每个文件，它都会创建一个称为“传感器”的图像。

3.裁切：如果需要删除图像的一部分（例如，距离条），这是一个可选模块。它将生成名为“ CropSensor ”的输出图像。

4. IdentifyPrimaryObjects ：此模块从“ CropSensor ”图像中识别单个对象Nuclei 。您可能需要更改对象的“典型直径”或“阈值”策略及其参数，以获得对单元格的最佳标识。

5. MeasureObjectNeighbors ：测量在指定的Neighbor距离内每个Nuclei对象的邻居数。您可能需要修改此参数以获得邻居编号的最佳最佳范围，以区分属于噬菌斑的细胞与周围的细胞。该模块创建一个名为“ ObjectNeighborCount ”的图像。

6. FilterObjects ：此模块设置阈值，以使用上一个模块中计算的邻居数范围来识别斑块所属的Nuclei对象。您可能需要根据邻居的范围设置此最小值，以最佳识别斑块所属的Nuclei对象。它生成输出对象FilteredNuclei 。

7. IdentifySecondaryObjects ：将上述FilteredNuclei扩展确定的像素数，以填充“ CropSensor ”图像中属于斑块的单元格之间的间隙。您可能需要修改用于扩展主要对象的像素数，以填补大部分空白。此模块标识输出对象Cells 。

8. ConvertObjectstoImage ：展开的Cells对象构成了创建名为“ CellImage ”的新图像的基础。

9. IdentifyPrimaryObjects ：使用之前的“ CellImage ”来标识新的Plaque对象。您可能需要修改对象的“典型直径”范围，以使用此模块生成的可视输出中的不同感染后时间的图像来获得正确的斑块识别，如彩色帧“斑块”所示。在这种情况下，必须像我们的示例数据集一样，一张一张地分析图像。

10. ConvertObjectstoImage ：将Plaque对象转换为称为“ PlaqueImage ”的图像。

11. SaveImages ：使用“ PlaqueImage ”创建并保存一个名为“ Output_image_PreviousPlaques ”的图像，该图像构成了使用管道“ PlaqueTracking.cpproj ”进行斑块跟踪的输入图像之一。

12. OverlayObjects ：此模块将“ CropSensor ”图像与Plaque对象融合在一起，以生成名为“ OverlayImage ”的复合图像。

13. SaveImages ：创建名为“图像Output_image_OverlayPlaques ”的基础上“窗格在overlayImage ” 。

注意：依此协议，我们提供了一个Zip文件“ PlaqueIdentification跟踪管道和数据集”，其中包含应用的管道（“ PlaqueIdentification.cpproj ”）以及一个示例数据集，该示例数据集由两个输入图像组成，以运行管道并进行必要的调整（ “ Input_image_mNeptune_72h”和“ Input_image_mNeptune_96h”）以及四个输出文件以确认预期结果（“ Output_image_PreviousPlaques_72h”，“ Output_image_PreviousPlaques_96h” ，“ Output_image_OverlayPlaques_72queh”和“ Output_image_lay”）。

斑块追踪管道

1.图像：只需拖放噬斑测定荧光图像（例如，“ Input_image_mNeptune_72h”）文件和使用先前噬斑识别管线创建的输出图像（例如，“ Output_image_PreviousPlaques_72h”）文件即可。确保空斑测定荧光图像做的名称包括其中被测量的荧光的信道（的名称例如，mNeptune ）和时间推移显微镜图像增加连续编号（例如，mNeptune_72h）。

2. NamesAndTypes ：硒LECT用表达规则标准包含在所有的噬斑测定荧光图像的名称，在这种情况下，指示的荧光的信道（例如，mNeptune ）。对于每个荧光图像，它将创建一个称为“传感器”的图像。

3.模块3-8与“斑块识别”管道中描述的模块相同。

4. IdentifySecondaryObjects ：此模块将“ CellImage ”中的新Plaque对象标识为先前标识的PreviousPlaques主要对象周围的次要对象。

5. TrackObjects ：此模块使用时间分辨图像上的重叠标准随时间跟踪斑块，并创建名为“ TrackedPlaques ”的输出图像。您可以调整“最大距离”以考虑匹配，以实现最佳噬菌斑追踪。

6. SaveImages ：保存“ Tracked_Plaques ”图像以供您验证和最终结果。

7. RelateObjects ：此模块将新的Plaque对象与先前标识的Nuclei对象相关联。

8. ExporttoSpreadSheet ：此模块将构成所有已分析图像中每个可识别斑块的细胞数（核对象）的数据导出到excel电子表格。

注意：与该协议一起，我们提供Zip文件“ PlaqueIdentification跟踪管道和数据集”，其中包含应用的管道（“ PlaqueTracking.cpproj ”）和一个示例数据集，该示例数据集由运行管道的四个输入图像组成（“ Input_image_mNeptune_72h”，“ Input_image_mNeptune_96h” ”，“ Output_image_Previous Plaques_72h”和“ Output_image_PreviousPlaques_96h”）以及三个输出文件来确认预期结果（“ Tracked_Plaques_72h”，“ Tracked_Plaques_96h”和“ Viral_Plaque ”）。

菜谱

1.完整的DMEM

500毫升DMEM（Gibco ）

5毫升抗生素-抗真菌药100 ×

5毫升（2％）或50毫升（10％）的FBS

用手旋转匀浆（20次，轻轻地避免形成泡沫）

储存在4℃。稳定4个月

2. PEI溶液（1毫克/毫升）

1毫克PEI粉

1 ml蒸馏水中的0.2 M HCl

热和摇，在60℃，600rpm下在热混合器®块

过滤灭菌（孔径0.2 µm）

将45 µl等分试样准备入2 ml反应管中，并在-80°C下保存。稳定4个月

3.聚乙烯溶液（10毫克/毫升）

10.6毫克六溴二苯醚粉末

溶解在1毫升的destilled水

过滤灭菌（孔径0.2 µm）

将50 µl单次使用的等分试样准备到0.5 ml反应管中，并储存在-20°C下。稳定1年

4.完成MEM

500 ml MEM（Gibco ）

5 ml丙酮酸钠100 mM

5毫升抗生素-抗真菌药100 ×

5毫升（2％）或50毫升（10％）的FBS

用手旋转匀浆（20次，轻轻地避免形成泡沫）

储存在4℃。稳定4个月

5. PBS 1％FBS

45 ml PBS，pH 7.4

5毫升完整MEM 10％FBS

储存在4℃。稳定4个月

6.嘌呤霉素溶液（10 mg / ml）

10毫克嘌呤霉素

溶解在1毫升的destilled水

过滤灭菌（孔径0.2 µm）

将20 µl单次使用的等分试样准备到1.5 ml的光保护反应管中，并储存在-20°C下。稳定2年

7. FluoroBrite TM DMEM 2％FBS

500毫升FluoroBrite TM DMEM（Gibco ）

5毫升GlutaMAX TM补品

5 ml丙酮酸钠100 mM

5毫升抗生素-抗真菌药100 ×

5毫升的胎牛血清

用手旋转匀浆（20次，轻轻地避免形成泡沫）

储存在4℃。稳定4个月

8.斑块培养基2％FBS

9.4克MEM（Sigma）

900毫升Milli -Q水

调节pH至4.0

10克羧甲基纤维素钠盐

高压灭菌（121°C在100 kPa下15分钟）

在Milli- Q水中的30 ml 7.5％碳酸氢钠溶液（通过过滤灭菌-孔径0.2 µm）

10毫升GlutaMAX TM补品

10 ml丙酮酸钠100mM

10毫升抗生素-抗真菌药100 ×

20毫升FBS

用手旋转匀浆（20次，轻轻地避免形成泡沫）

储存在4℃。稳定4个月

致谢

我们要感谢马萨诸塞大学化学系的Jeanne A. Hardy博士在我们出色的合作过程中所表现出的友善和科学建议。我们还要感谢哥斯达黎加大学（项目VI-803-B9-505）和国际基因工程与生物技术中心（GRP CRP / CRI18-02）的资助来源。

利益争夺

作者宣称他们没有任何利益冲突。

参考

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