材料和试剂

注意：请确保所有试剂和材料均不含RNase。

1. 1.5毫升低结合力试管（Sarstedt ，目录号：72.706.700）

2.果蝇果蝇r S2细胞（果蝇基因组资源中心，https：//dgrc.bio.indiana.edu/Home）或任何细胞系/组织

3. RNeasy迷你套件（Qiagen，目录号：74104）

注意：我们没有测试其他RNA提取试剂盒，但可以认为制造商并不重要。但是，不同试剂盒中各种RNA种类的可提取性可能有所不同。

4.根据重组蛋白的标签，使用抗FLAG M2亲和凝胶（Sigma，目录号：A2220）或其他合适的亲和树脂

5.酵母tRNA溶液（Sigma，目录号：R5636）

6. BSA馏分V粉末（用于封闭）（Sigma，目录号：05482）

7.无核酸酶的水（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9937）

8. DNase I重组，无RNase（Sigma，目录号：04716728001）

9. BSA 20 mg / ml溶液（用于vitRIP ）（新英格兰生物实验室，目录号：B9000S）

10.重组RNasin RNase抑制剂（40 U / μl ）（Promega ，目录号：N2515）

11.腺苷5'-三磷酸二钠盐（ATP）（Sigma，目录号：10127523001）

12.蛋白酶K（BioCat ，目录号：BIO-37039-BL）

13. 10％SDS解决方案

14.苯酚：氯仿：苯醇ROTI Aqua-P / C / I（Carl Roth，目录号：X985.1）

15. 3 M乙酸钠pH 5.2

16.糖原（20 mg / ml）（Sigma，目录号：10901393001）

17.分析用乙醇绝对盐（西格玛，目录号：1009832500）

18. SuperScript III第一链合成系统（Thermo Fisher Scientific，目录号：18080051）

19. Fast SYBR Green Mastermix （Thermo Fisher Scientific，目录号：4385610）

20. Quant- iT Qubit RNA HS检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32855）

21.安捷伦RNA 6000 Pico试剂盒（安捷伦，目录号：5067-1513）

22.安捷伦DNA 1000试剂盒（安捷伦，目录号：5067-1504）或安捷伦高灵敏度DNA试剂盒（安捷伦，目录号：5067-4626）

23. NEBNext rRNA耗竭试剂盒（人/小鼠/大鼠）（新英格兰生物实验室，目录号：E6310）

24.用于Illumina的NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒（新英格兰生物实验室，目录号：E7760）

25.氯化钾

26.氯化钠

27. Na 2 HPO 4

28. KH 2 PO 4

29. HEPES

30.氯化镁2

31. NP40（IGEPAL CA-630，西格玛，目录号：I3021）

32.抗FLAG M2单克隆抗体（西格玛，目录号：F3165）

33. 2 × SDS PAGE样品缓冲液（125 mM Tris HCl pH 6.8，4％SDS，20％甘油，0.01％溴酚蓝，200 mM DTT）

34. 1 × PBS（请参阅食谱）

35. vitRIP-100缓冲区（请参阅食谱）

36. vitRIP-250缓冲区（请参阅食谱）

设备

-80°C冷冻室
DeNovix DS-11分光光度计（Biozym ，目录号：31DS-11）或其他具有254 nm和280 nm波长的分光光度计
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5424R）
带加热盖的Eppendorf ThermoMixer C（Eppendorf，目录号：5382000015，5308000003）
旋转器（Neolab ，目录号2-1175）
量子位荧光计（Invitrogen）
Bioanalyzer 2100仪器（安捷伦）
Lightcycler 480仪器II，384孔（Roche，目录号：05015243001）或其他实时PCR系统
（访问）Illumina HiSeq 1500测序平台

软件

STAR –与参考的剪接转录比对（Alexander Dobin ，冷泉港实验室，https：//github.com/alexdobin/STAR）（Dobin等人，2013）
Samtools （基因组研究有限公司，桑格研究所，http： //www.htslib.org ）（Li等，2009）
Bedtools （犹他大学奎兰实验室，https: //bedtools.readthedocs.io/en/latest/ ）
IGV –集成基因组学查看器和igvtools （IGV团队，Broad Institute和圣地亚哥大学UC，http： //software.broadinstitute.org/software/igv/home ）（Robinson等人，2011年）
R（R核心团队，https：//www.r-project.org）
RStudio（RStudio，https ://rstudio.com ）
生物导体（生物导体核心团队，http ://bioconductor.org ）（Huber et al。，2015）

程序

笔记：

使用不同批次的纯化蛋白质和总RNA，必须进行≥3个生物学重复实验。
需要为每个实验系统优化条件。蛋白质和/或RNA滴定可能需要获得一个最佳的信噪比。
包括与实验RNA进行的vitRIP反应，但缺少重组蛋白，以对珠子上的RNA背景进行评分。
额外的对照反应（例如，从不同物种中提取的总RNA或在其RNA结合结构域中突变的蛋白质（如果已知））可能有助于进一步表征已鉴定的蛋白质-RNA相互作用的特异性。
在无RNase的条件下工作。

总RNA的制备
在标准条件下培养果蝇S2细胞。有关详细信息，请参阅果蝇基因组资源中心（https://dgrc.bio.indiana.edu/Home）。
通过离心（500 × g ，5分钟，25°C）收集5 × 10 6指数增长的细胞，并弃去上清液。
用500 µl PBS洗涤细胞沉淀，离心收集（500 × g ，5分钟，25°C ），弃去上清液。
直接进行RNA提取或将细胞沉淀物在-80°C下保存，最长持续3个月。
根据制造商的说明，使用Qiagen RNeasy Mini Kit提取总RNA。用50 µl不含RNase的水中洗脱RNA，并用分光光度法测定浓度。5 × 10 6 S2细胞的典型产量在25-50 µg之间。
将提取的RNA储存在-80°C下直至进一步使用（最长持续1年）。避免频繁冷冻/解冻RNA样品以防止降解。
注意：可以使用任何其他细胞系或动物组织。我们成功地测试了成年果蝇的几种雄性和雌性果蝇细胞系以及头部组织。从组织中提取RNA的方法可能需要调整。

高纯度蛋白质的制备
注意：此处介绍的vitRIP协议以特征明确的RNA解旋酶MLE为例。但是，vitRIP可以应用于可以纯化至近乎均质的任何蛋白质。必须针对每种蛋白质分别确定蛋白质纯化策略，并且不能一概而论。

表达感兴趣的蛋白质在适当的异源表达系统（例如，大肠杆菌或昆虫SF21细胞）并纯化至接近均一。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析蛋白质样品的纯度。
通过适当的方法（在280 nm处吸收或Bradford蛋白测定）确定蛋白浓度。如有必要，请使用旋转浓缩器以增加蛋白质浓度。速冻小等分试样（10-20 µl），并储存在-80°C下。vitRIP所需的蛋白质浓度在很大程度上取决于对RNA底物的亲和力，需要通过应用蛋白质滴定系列凭经验确定，如Müller等人（2003年）中所述。（2020年）。另请参阅步骤D，注释3。
使用前，将蛋白解冻于冰上，旋转以除去潜在的聚集体（20,000 × g ，10分钟，4°C），并将上清液用于vitRIP 。
杆状病毒驱动的SF21细胞表达后，全长FLAG标记的果蝇果蝇MLE的纯化在Izzo等人的文章中有详细描述。（2008 ）和Maenner等。（2013），仅在为MLE洗脱缓冲液（20mM不同HEPES -KOH pH 7.6的，200毫米的KCl ，1 mM的DTT，2毫摩尔MgCl 2 ，10％甘油）。纯化的MLE的典型浓度为0.5-1 µg / µl，可直接用于vitRIP 。

抗FLAG M2亲和凝胶的制备
注意：始终准备新鲜的树脂。可以使用与亲和标签匹配的任何其他树脂。或者，可以使用包被至蛋白A或蛋白G Sepharose的蛋白特异性抗体。

每个vitRIP反应使用20 µl Anti-FLAG M2亲和凝胶（“珠子”）。
：洗净珠甲在500 DD 1ml PBS中，转化管10倍，离心1分钟×克，4℃，并丢弃上清液。再重复一次此步骤。
封闭磁珠：将dd 2％BSA / PBS / 0.1 mg / ml酵母tRNA固定在磁珠上，并在4°C旋转孵育1小时。在4 × 500 × g下离心1分钟，弃去上清液。该步骤旨在防止蛋白质和/或总RNA与FLAG亲和凝胶发生非特异性结合。
：洗净珠甲在500 DD1毫升vitRIP-100缓冲液中，倒置试管10次，离心1分钟×克，4℃，并丢弃上清液。再重复一次此步骤。
在最后的洗涤步骤中，尽可能多地丢弃上清液，并将珠子放在冰上。

拉下RNA-蛋白质复合物
笔记：

将所有步骤移至冰上并于4 °C离心。使用低约束力的管子。
vitRIP的RNA量取决于单个转录物的丰度以及所研究蛋白质与RNA的亲和力。该量可以通过应用RNA滴定系列凭经验确定。在我们手中，每个vitRIP反应（100 µl体积）总RNA 2 µg效果很好。
vitRIP的蛋白质浓度取决于与RNA的亲和力，需要通过滴定凭经验确定。我们建议从10-250 nM的重组蛋白和2 µg的总RNA开始。如果未观察到结合，则蛋白质量可能会增加。用5-50 nM蛋白进行MLE vitRIP 。

每个反应用vitRIP-100缓冲液稀释2 µg总RNA到最终体积为10 µl。此混合物（1μL）的10％作为一个RNA输入采样，并保持在冰上。
与纯化的蛋白混合剩余的90％的RNA混合物（9微升）的（MLE-FLAG：5纳米和50纳米，分别地）在100μl的在vitRIP-100缓冲液含10微克BSA，总体积0.1 U /不含µl RNase的重组DNase I，0.8 U / µl RNasin RNase抑制剂和1 mM ATP。
孵育30分钟，在25℃（热块与加热盖）。
在20,000 × g ，1分钟，4 °C下旋转反应，并将上清液转移到1.5 ml管中的封闭且平衡的FLAG珠粒（来自S tep C5）。
旋转在室温（22°C）下孵育30分钟。
在500 × g下离心1分钟，在4°C下离心并弃去上清液（=未结合的级分）。
洗珠用1ml vitRIP-100缓冲液：甲DD 1ml缓冲液，旋转在室温下1分钟，离心1分钟，在500 ×克，4℃，并丢弃上清液。
洗珠用1ml vitRIP-250缓冲液：甲DD 1ml缓冲液，旋转在室温下1分钟，离心1分钟，在500 ×克，4℃，并丢弃上清液。
洗珠用1ml vitRIP-100缓冲液：甲DD 1ml缓冲液，旋转1分钟，在室温下和分布在两个管的珠蛋白和RNA提取：75％（750微升）用于RNA提取和25％（250微升）用于蛋白质提取。在4 × 500 × g下离心1分钟，弃去上清液。

蛋白质提取用于蛋白质印迹分析
向每个样品（步骤D10中25％的珠子材料）中，加入20 µl 2 × SDS样品缓冲液。在搅拌下于95°C孵育5分钟。
以500 × g离心1分钟以沉淀出珠子，并通过SDS-PAGE和Western Blot分析上清液，以成功提取蛋白质。
注意：使用抗FLAG抗体以1：5,000（v / v）稀释度通过Western blot分析来分析FLAG标记的MLE的vitRIP 。MLE作为对应145 kDa分子量的单条带可见。

RNA提取用于RNA鉴定
输入样本：中号IX 10％RNA输入（1微升），5μl的10％SDS，10μl的蛋白酶K（10毫克/毫升）和84微升vitRIP-100缓冲液中。孵育在一个热块在55℃下，45分钟搅拌1（与加热盖），000转。
IP样品（75％的珠材料，来自步骤D10）：加入5 µl 10％SDS，10 µl蛋白酶K（10 mg / ml）和85 µl vitRIP-100缓冲液。在55°C的恒温器（带加热盖）中孵育45分钟，同时搅拌（1,000 rpm）。
在室温下以500 × g的速度离心管1分钟，以沉淀IP样品的珠。
转移上清（含有洗脱RNA），并转移到一个新的1.5ml管中。
向每个样品（输入和IP）中，加入1体积（约100 µl）的酸性酚：氯仿：异戊醇。将每个试管彻底涡旋10秒钟，并在室温下以20,000 × g离心5分钟。
安全说明：处理苯酚：氯仿：异戊醇时，请始终使用通风橱，并妥善处理含酚废物。

将上层水相（包含RNA；约100 µl）转移至新的1.5 ml试管中，并加入1/10体积的3 M乙酸钠pH 5.2、20 µg不含RNase的糖原和2.5体积的冰冷的100％EtOH 。
在-20°C下孵育> 12小时以沉淀RNA。
在20,000 × g （全速），4°C下离心30分钟。小心地用移液器吸头除去并丢弃上清液，而不会干扰小且可能不可见的RNA沉淀。
加入1 ml冰冷的70％EtOH洗涤沉淀。
在20,000 × g （全速），4°C下离心15分钟。小心取出并丢弃上清液。
用20 µl移液器移走尽可能多的液体，然后风干沉淀（10-15分钟）。
将RNA沉淀重悬于20 µl无RNase的水中。上下吸移10次，然后快速旋转。为了完全溶解，将样品在25°C下温和搅拌（500 rpm）孵育15分钟。
使用Qubit荧光计和Qubit RNA高灵敏度（HS）分析试剂盒定量2 µl纯化的RNA。
注意：IP样品的RNA浓度可能很低，不在Qubit RNA HS分析试剂盒标准溶液的范围内。我们的经验表明，仍可以使用NEB Ultra II定向RNA文库制备试剂盒制备RNA测序文库。可以使用其他处理低投入样品的RNA-Seq文库制备试剂盒。

将RNA储存在-80°C直至进一步使用。

逆转录PCR
笔记：

如果已知目标蛋白质的一个或多个RNA靶标，则可以使用基因特异性引物通过定量RT-PCR分析vitRIP 。以包括未结合的转录物（例如管家基因），因为它是重要的阴性对照。
在MLE vitRIP ，已知的MLE靶roX2 RNA的富集使用roX2特异性引物进行定量并表示为相对于结合级分的输入。丰富的7SK RNA充当了阴性对照。有关引物序列的详细信息，请参见Müller等。（2020年）。在图2A中给出了一个例子。

DNase我消化
混合8 µl RNA，1 µl 10 × DNase I反应缓冲液，0.5 µl DNase I和0.5 µl RNasin 。
在37°C下孵育1小时。存放在冰上。
使用SuperScript III第一链合成系统进行cDNA合成
使用10 µl经DNase I处理的RNA，并按照制造商的说明使用随机六聚体引发进行cDNA合成。
用不含RNase的水稀释cDNA 1：5至1:50（取决于转录本的丰度），并使用转录本特异性引物和FAST SYBR Green Mastermix通过qRT -PCR进行分析。请遵循针对您的Real-Time PCR机的建议。

RNA-Seq文库制备
注意：文库制备方案取决于实验策略。总RNA中高含量的rRNA将干扰分析，应在文库制备之前将其除去。在MLE vitRIP样品，rRNA的使用rRNA基因的探针特异于人/小鼠/大鼠rRNA的，这也对果蝇的rRNA工作得相当好耗尽。这种策略可以识别vitRIP样品中的各种RNA （编码和非编码）。或者，如果实验策略旨在鉴定专门富集的聚腺苷酸化的RNA，则可以使用oligo d（T）珠来富集聚腺苷酸化的RNA。

图书馆准备的起始材料
质量控制：甲nalyze 1纯化输入的微升，并使用RNA 6000微微试剂盒免疫沉淀RNA上的生物分析仪。
根据RNA-Seq文库制备试剂盒的建议选择合适的RNA量。对于使用NEB Ultra II定向RNA文库制备试剂盒制备MLE vitRIP文库，将30-40 ng RNA用作起始材料。
rRNA耗竭
使用NEB rRNA耗竭试剂盒，使用Qubit荧光计定量的30-40 ng RNA进行rRNA耗竭。
遵循制造商关于rRNA消耗的规程（NEB＃E6310）。
使用RNA 6000 Pico试剂盒在Bioanalyzer上分析1 µl耗尽rRNA的样品。应主要消除18S和28S rRNA的主要峰（果蝇）。无法获得果蝇RNA样品的RNA完整性编号（RIN）。
图书馆准备
按照NEB Ultra II定向RNA文库制备试剂盒（NEB＃E7760）的说明，将消耗rRNA的样品用于文库制备。
使用DNA 1000或DNA高灵敏度试剂盒，在生物分析仪上评估每个库的1 µl样品的质量和数量。具有最大的单个峰的约300 bp的应观察到（图2B）。
序列上的Illumina公司在50个碱基配对末端模式HiSeq1500仪器。测序运行设置为50bp-8bp-8bp-50bp（read1-index1-index2-read2），其中未使用第二个索引文件。

图2. vitRIP分析的代表性示例。有关详细信息，请参阅该原始出版物（穆勒等人，2020年）。A.在不存在或存在ATP的情况下，带有S2 RNA的MLE vitRIP 。roX2和7SK的富集通过分析定量RT -PCR，并且相对于被显示的输入。Ctrl表示缺少重组MLE的纯RNA vitRIP样品。B.由输入和MLE vitRIP样品制备的RNA测序文库的代表性生物分析仪谱。在DNA 1000芯片上分析了文库，并显示了一个单峰，其预期最大值约为300 bp。C.与S2输入相比，roX2和7SK上MLE的代表性vitRIP配置文件的基因组浏览器视图。基因组坐标在图上方给出。D. MA图代表MLE vitRIP的差异表达分析。E.在不同条件下MLE vitRIP-seq数据的主成分分析（PCA）。X轴显示第一个（PC1），y轴显示第二个（PC2）主分量。F.在MLE RNA的U- / A-四核苷酸的频率的比较vitRIP相对于所述输入。感兴趣的RNA类别（roX2，线粒体RNA）突出显示。显示了Spearman的相关性（r）。

数据分析

笔记：

本部分描述了Müller等人于2020年发表的MLE vitRIP的RNA-Seq分析。可能需要根据所选模型系统调整程序。
分析≥3个生物学重复样本，以确保对数据进行有效的解释。
显示了简化的示例代码块，请参阅详细信息：https : //github.com/tschauer/vitRIP_2020。

A. Illumina测序的读取处理

1.将配对末端的读段（50 bp）映射到参考基因组（果蝇Dm6版本），并使用STAR aligner（版本2.5.3a）和Flybase注释（ftp://ftp.flybase.net）对每个基因的读数进行计数/releases/FB2017_04/dmel_r6.17/gtf/dmel-all-r6.17.gtf.gz），同时过滤出具有多个比对的读取。

STAR- runThreadN 8

- readFilesCommand gunzip解-C

- quantMode GeneCounts

-基因组目录$ { path_to_star_index }

- sjdbGTFfile $ { gtf_file }

- readFilesIn $ {fastq_file } _ 1.txt.gz $ {} fastq_file _2.txt.gz

- outFileNamePrefix $ { fastq_file }。

- outSAMtype BAM SortedByCoordinate

- limitBAMsortRAM 50亿

- outFilterMultimapNmax 1

2.计数的对齐使用读取总数samtools （1.7版本），并生成标准化（每百万读取）bedgraph文件使用genomeCoverageBed （bedtools版本2.27.1）。

总计=` samtools视图-c $ { bam_file }`

scaler =`echo“ scale = 10; 1 /（$ {total} / 1000000）” | BC `

genomeCoverageBed - IBAM $ { bam_file } - BG -split进制$ {缩放}> $ { bedgraph_file }

3.转换bedgraph到TDF文件使用igvtools （98年3月2日的版本）。

igvtools toTDF -z 5 $ { bedgraph_file } $ { tdf_file } $ { path_to_fasta }

4.在IGV浏览器中可视化tdf文件（图2C）。

B.差异表达分析

将计数表（由STAR生成的* ReadsPerGene.out.tab文件）加载并合并到R （版本3.6.1）中，并在75％的样本中保留读取计数至少为1的基因。

过滤< -应用（count_table ，1，函数（x）的长度（X [X> 1]）> = NcoI位（count_table ）/1.333）

count_table_filtered < -count_table [filter，]

使用DESeq2软件包（1.26.0版）进行差异表达分析，同时将复制信息添加为批处理变量。

dds < -DESeqDataSetFromMatrix （countData = count_table_filtered ，

colData = column_data ，

设计=〜批+样本）

dds < -DESeq （dds ）

注意：应该直接相互比较的样本必须安装在相同的DESeq2模型中。

使用结果函数（DESeq2）获得log2FoldChange估计值和调整后的p值。将调整后的p值截止值设置为0.01。

res < -results （dds ，

对比度= c（“样本”，“ IP”，“输入”），

IndependentFiltering = FALSE）

res.sign <-子集（res，padj <0.01）

将结果可视化为MA图，将红色显着的基因标记为橙色，将示例基因标记为橙色（图2D）。

plot（res $ baseMean ，res $ log2FoldChange，

log =“ x”，xlim = c（1，1e6），ylim = c（-10,10），

xlab =“对数均值”，ylab =“ log2倍数变化”，

col = rgb （0,0,0,0.1），pch = 19，cex = 0.25）

points（res.sign $ baseMean ，res.sign $ log2FoldChange，

col = rgb （0.8,0,0,0.5），pch = 19，cex = 0.25）

favorite_gene < - rownames （RES）％以％C（ “FBgn0019660”， “FBgn0019661”）

points（res $ baseMean [favorite_gene]，res $ log2FoldChange [favorite_gene]，

col = rgb （0.9,0.6,0,1），pch = 19，cex = 1）

C.主成分分析（PCA）

使用ComBat函数（sva软件包版本3.32）对归一化的读取计数进行批处理效果校正。

batch_var < -colData （dds ）$ batch

modcombat < -model.matrix （〜sample ，data = colData （dds ））

log2_corrected_counts < -战斗（DAT = LOG2（计数（DDS ，归= TRUE）+1），

批处理= batch_var ，mod = modcombat ，

par.prior = TRUE，prior.plots = FALSE）

在批次校正后的计数s上执行PCA并将其绘制成图（图2E）。

pca < -prcomp （t（log2_corrected_counts），scale。= TRUE）

percentVar <-回合（pca $ sdev ^ 2 / sum（pca $ sdev ^ 2）* 100,1）[1:10]

情节（pca $ x [，1]，pca $ x [，2]，

col = color_palette [ colData （dds ）$ sample]，pch = 16，cex = 0.7，

xlab = paste（“ PC1（”，percentVar [1]，“％）”，sep =“”），

ylab = paste（“ PC2（”，percentVar [2]，“％）”，sep =“”））

D.核苷酸频率分析

通过将FlyBase注释转换为TxDb对象（GenomicFeatures软件包版本1.36.4）来设置注释，并使用BSgenome软件包（版本1.52）提取基因序列。

txdb < -makeTxDbFromGFF （“ dmel-all-r6.17.gtf”，format =“ gtf ”）

seqlevelsStyle （txdb ）<-“ UCSC”

seqlevels （txdb ）<- gsub （“线粒体基因组”，“ chrM ”，seqlevels （txdb ））

染色体<-c（“ chrX”，“ chr2L”，“ chr2R”，“ chr3L”，“ chr3R”，“ chr4”，“ chrM”，“ chrY”）

range_genes < -genes （txdb ）

ranges_genes < -keepSeqlevels （ranges_genes ，染色体，pruning.mode =“粗略”）

genic_seq <-BSgenome :: getSeq（BSgenome.Dmelanogaster.UCSC.dm6，range_genes）

使用寡核苷酸频率函数（Biostrings软件包版本2.52）计算基因核苷酸频率。组寡核苷酸宽度要么4,5 ，或6，滑动窗口步骤1和as.prob为TRUE。

genic_4merfreq <-寡核苷酸频率（genic_seq ，width = 4，step = 1，as.prob = T）

行名（genic_4merfreq）<-名称（genic_seq ）

选择显着富集的基因（调整后的p值<0.01，log2 [IP /输入]> 0）。

res.sign_enriched <-子集（res，padj <0.01＆res $ log2FoldChange> 0）

select_enriched < - rownames （genic_4merfreq）％以％rownames （res.sign_enriched ）

select_notenriched < - ！（rownames以％（genic_4merfreq）％rownames （res.sign_enriched ））

freqs_enriched <-genic_4merfreq [ select_enriched ，]

freqs_notenriched <-genic_4merfreq [ select_notenriched ，]

可视化盒形图富集或不富集的基因的核苷酸频率。按序列的中位数频率对序列进行排序。

freq_order < -order （apply（freqs_enriched ，2，中位数），递减= T）

freqs_enriched < - freqs_富集[ ，freq_order ]

freqs_notenriched < -freqs_ notenriched [ ，freq_order ]

freqs_merged < -c（as.list （data.frame （freqs_enriched ）），

as.list （data.frame （freqs_notenriched ）））

boxplot （freqs_merged [rep（1:25，each = 2）+ c（0，ncol （freqs_enriched ））]，

col = c（“ darkred ”，“ darkgrey ”），las = 2，outline = F，

ylab =“频率”）

之间的关联可视化vitRIP富集（即，LOG2 [IP /输入]）和核苷酸频率为散点图。计算Spearman的相关性以评估该关系（图2F）。

res_freq < -merge （res，genic_4merfreq，by =“ row.names ”）

plot（res_freq $ log2FoldChange，res_freq [，“ TTTT”]，

main =“”，xlab =“ log2倍数变化”，ylab =“频率UUUU”，

xlim = c（-8,8），col = rgb （0,0,0,0.1），pch = 19，cex = 0.25）

退位（v = 0，col =“ grey32”）

科尔< - COR （res_freq $ log2FoldChange，res_freq [ “TTTT”]，方法= “斯皮尔曼”）

title（paste（“ cor =”，round（corr，2）），line = 0.5，cex.main = 1）

E.评估富集/未富集的RNA类

提取的注释（例如，外显子，内含子，5'和3'非翻译区，以及用于snRNAs，snoRNAs ，酶和tRNA）从GTF注释（即，DMEL-全r6.17.gtf）。

anno_gtf < -import.gff （“ dmel-all-r6.17.gtf”）

genes_3UTR < -anno_ gtf [ anno_gtf $ type ==“ 3UTR”，]

genes_3UTR_length <-聚合（宽度（genes_3UTR），

由=列表（genes_3UTR $ gene_id），FUN =最大值）

select_q95 <-genes_3UTR_length [ ，2]>分位数（genes_3UTR_length [，2]，0.95）

class.long3UTR < -基因_3UTR_length [，1] [select_q95]

注意：选择长3'UTR转录本作为3'UTR最长5％的转录本。在某些情况下，当一个基因带有3'UTR同工型时，便会选择具有最长3'UTR的同工型。

的提取物注释果蝇从的snoRNA类SnOPY数据库（的snoRNA orthological基因数据库; http://snoopy.med.miyazaki-u.ac.jp）（吉滨。等人，2013年）。使用org.Dm.eg.db软件包（版本3.8.2）将基因名称转换为基因ID。

snoRNA_snopy < -函数read.table （“snoRNA_snopy.txt”，首标= T，九月= “\ t”的，stringsAsFactors = F）

snoRNA_HACA <-snoRNA_snopy $ snoRNA.name [ snoRNA_snopy $ Box ==“ H / ACA”]

class.snoRNA_HACA < -mapIds （org.Dm.eg.db ，keys = snoRNA_HACA ，

键类型=“ SYMBOL”，列=“ FLYBASE”）

从已发表的数据中提取关于腺苷到肌苷编辑的RNA的信息（St Laurent et al。，2013）。将excel表读到R（gdata软件包版本2.18.0），然后从GTF注释中选择唯一的基因ID。

editedRNAs_symbols < -read.xls（“ nsmb.2675-S2.xlsx”，工作表= 4，stringsAsFactor = FALSE）

editedRNAs_symbols < -editedRNAs_符号[ ，1]

editedRNAs_symbols < - GSUB （“-R *”。 “”，editedRNAs_symbols [-1：-2]）

class.editedRNAs < -anno_gtf $ gene_ id [ anno_gtf $ gene_symbol ％in％editedRNAs_symbols ]

class.editedRNAs < -unique （class.editedRNAs ）

使用Fisher精确检验评估选定类别的RNA的富集。

class.mito < - ranges_基因[ seqnames （ranges_genes ）== “ CHRM ”] $ gene_id

Sign.inClass < -总和（（rownames （RES）％以％class.mito ）＆

res $ padj <0.01和res $ log2FoldChange> 0）

NS.inClass < - 总和（（rownames （RES）％以％class.mito ）＆

res $ padj > = 0.01＆res $ log2FoldChange> 0）

Sign.notClass < -总和（！（rownames （RES）％的％class.mito ）

res $ padj <0.01和res $ log2FoldChange> 0）

NS.notClass < - 总和（！（rownames （RES）％的％class.mito ）

res $ padj > = 0.01＆res $ log2FoldChange> 0）

fisher.test （matrix（c（Sign.inClass ，

Sign.notClass ，

NS.inClass ，

NS.notClass ），nrow = 2，byrow = T））

菜谱

注意：在无RNase的条件下准备所有缓冲液。

1 × PBS
140毫米氯化钠

2.7毫米氯化钾

10毫米Na 2 HPO 4

1.8毫米KH 2 PO 4

vitRIP-100缓冲区
25 mM HEPES-NaOH pH 7.6

100毫米氯化钠

0.05％（v / v）NP40

3毫米MgCl 2

vitRIP-250缓冲区
25 mM HEPES-NaOH pH 7.6

250毫米氯化钠

0.05％（v / v）NP40

3毫米MgCl 2

致谢

这项工作得到了德国研究基金会的资助（Be1140 / 9-1）。该协议最初发表在Müller等人的文章中。（2020年）。

利益争夺

无利益冲突可宣布。

参考

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