材料和试剂

1.接种环10 µl（Laboindustria SPA，目录号：21131）

2.培养皿Ø 90 （Laboindustria SPA，目录号：21 050 ）

3.移液管头（梅特勒托莱多，目录号š ：1 7007956，17007952）

4. 50毫升高清晰度聚丙烯（PP）锥形离心管（Falcon，目录号：352070）

5.带有盖子的NIR石英SUPRASIL 300矩形宏单元，容积3.5毫升（PerkinElmer，目录号：B0631015）

6. PIREX介质瓶，刻度，Corning，500毫升（VWR，PIREX，目录号：1395-500）

7.假单胞菌savastanoi PV 。savastanoi （Psav ）DAPP-PG 722菌株（Moretti等人，2014），于-80 °C的15％甘油中保存

8.丁香假单胞菌PV 。番茄（Pto ）DC3000菌株（Gizjen ，2008），在-80 °C下用15％甘油存储

9. MilliQ双蒸馏水

10.的Tris碱（Sigma-Aldrich公司，目录号：T1503）; 制备0.12 M水溶液，用1 M HCl调节pH到8.0 ，高压灭菌并在室温下保存

11.的Fura 2-AM（Sigma-Aldrich公司，目录号：F0888）; 在DMSO中以50 µl等分试样制备2 mM溶液，并在-20 °C冷冻。存放在-20 °C，用铝箔包裹，以免发生光降解。避免反复冷冻和解冻等份试样

12. EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）；制备0.5 M的储备水溶液，用0.5 M NaOH调节pH到8.0 ，高压灭菌并在室温下保存。从储备溶液中制备2 mM水溶液

13.氯化钠（西格玛奥德里奇，目录号：S7653）

14.胰蛋白（（西格玛奥德里奇，密理博，目录号：T7293）

15.酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：Y1625）

16.氯化钙（Sigma-Aldrich，目录号：449709）；制备50 mM水溶液并在121 °C下高压灭菌20分钟

17. Hank的缓冲盐溶液（HBSS）缓冲液；用8.18 g / L NaCl ，0.4 g / L KCl （Sigma-Aldrich，目录号：P9541），5.96 g / L HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）制备1 L水溶液，将pH调节至7.4并高压灭菌在121 °C下20分钟

18. EDTA（Sigma-Aldrich公司，目录号：E9884）; 制备0.5 M的原液，用NaOH调节pH到8.0 ，在121 °C高压灭菌20分钟，然后在室温下保存。从储备溶液中制备0.1 mM水溶液

19. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）；准备1％的水溶液并在121 °C下高压灭菌20分钟

20. Luria Bertani （LB）培养基（请参阅食谱）

设备

1 L量筒（DWK Life Sciences，目录号：21 390 54 08）
BRAND磁力搅拌棒（Sigma-Aldrich，Aldrich，目录号：BR137630）
磁力搅拌器（Heidolph MR 2000，目录号：200- 505-20000-00）
Eppendorf Research Plus G木偶（Sigma-Aldrich，Eppendorf，目录号：EP3123000918 ）
高压灭菌器（EXAPro ，Lequeux ，目录号：P80602001）
摇床SI500 （Stuart，目录号：FV-79520-00）
的Eppendorf ®离心机5804R（Sigma-Aldrich公司，Sigma，目录号：EP022628146）
Heratherm TM培养箱（该RMO科学，目录号：51028112）
LS-50B发光光谱仪（PerkinElmer，目录号：17931）
层流柜Gelaire BSB 6A（Gelaire ）

软件

FL WinLab软件版本3（PerkinElmer）
棱镜8（GraphPad ，https : //www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）

程序

细菌生长（第1天：〜15分钟，然后孵育16小时）
注意：请勿在生长培养基中使用任何抗生素，因为它会干扰实验。请勿使用超过最大试管体积10％的量，以确保细菌生长。在无菌条件下进行所有步骤。

制备的新鲜培养物PSAV DAPP-PG 722或PTO通过接种细菌细胞，用刮DC3000菌株一个在-80从15％的甘油原液接种环℃，在含有LB琼脂培养基并孵育16小时，在27陪替氏培养皿℃。

细菌生长（第2天：〜15分钟，然后孵育16小时）
注意：请勿在生长培养基中使用任何抗生素，因为它会干扰实验。请勿使用超过最大试管体积10％的量，以确保细菌生长。在无菌条件下进行所有步骤。

将细菌细胞环接种到装有5 ml LB肉汤的50 ml管中。将试管在振荡培养箱中于27 °C和200 rpm孵育16 h （直到OD 660 = 0.8）。

用Fura 2-AM进行细胞制备（第3天：〜3.5小时）
注意：请勿以> 16,000 × g的速度离心细菌悬液，以免损坏细胞。用铝箔纸包裹装有Fura 2-AM的试管，或在黑暗中工作，以免探头发生光降解。

通过在室温下（RT）离心（15,585 × g ，3分钟）从5 ml细胞培养物中收集细菌细胞。
弃去上清液，将细胞重悬于5 ml无菌0.12 mM Tris HCl （pH 8 .0）中。
调整的细菌悬浮液以1 × 10 8 CFU毫升-1通过使OD 660为0.06。
通过在室温下离心（15,585 × g，3分钟）再次收集10 ml这种细菌悬液。
弃去上清液并将细胞沉淀重悬于5 ml 0.12 mM Tris HCl （pH 8 .0）（= 5 × 10 9 CFU）中，加入0.5 ml 2 mM EGTA溶液（pH 8 .0），并于25孵育在空气培养箱中保持5分钟，使细菌易于吸收Ca 2+探针。
加入20 µl 2 mM CaCl 2溶液淬灭EGTA。
通过在室温下以15585 × g离心3分钟来沉淀细胞。
弃去上清液，将细胞重悬于5 ml HBSS中，并加入2 µl 2 mM Fura 2-AM储备液。请注意，在使用新鲜储备溶液使用之前，应将Fura 2-AM新鲜添加到HBSS中。
孵育在培养箱中在HBSS + Fura2-AM该细胞悬浮液，而不在25摇动℃下进行2小时。
通过在室温下以15585 × g离心3分钟来沉淀细胞。
加入5 ml HBSS（不含染料），重悬细胞，在室温下孵育1分钟。

Ca 2+含量的测量（日期3：〜1.5小时）
注意：使用《用户指南》，使用FL WinLab软件设置LS-50B发光光谱仪。

将1 ml的细胞悬液倒入装有BRAND磁力搅拌棒的NIR Quartz SUPRASIL 300矩形宏样品池中，以减少涡旋并确保正确读取样品。
放置矩形宏切尔升在LS-50B荧光分光光度计，等到至i红绿灯底部变成绿色nitialize分光计（图3A），并点击它来开始测量。用类似的光谱仪可以得到类似的结果。
等待约50 s（对于信号稳定有用的时间），然后添加30-240 µl的50 mM CaCl 2溶液以达到0.5至4 mM的最终浓度（图4）。
加入1 ml的1％Triton X-100破坏细胞，记录时间并等待信号稳定。在测量结束时添加Triton X-100，因为它可以确定系统中的最大Ca 2+水平。
1毫升0.1添加毫EDTA （pH为8 .0）到CHEL吃了的Ca 2+离子在溶液中，并记录精确的时间在出现DISPLA ÿ，因为它是最后的重要Rmin的判定，等到信号稳定，然后按在“交通信号灯”按钮（图3A）中，确保其变为红色以获取信号并保存值。通过添加EDTA，Ca 2+离子被螯合，从而可以确定系统中的最低Ca 2+水平。
注意：在测定结束时添加Triton X-100和EGTA，以便使用完整的细胞进行测量。如果细胞不完整，则无法确定最小和最大Ca 2+值。

根据Grynkiewicz等人的公式自动确定Ca 2+的浓度。（1985）[也参见d ATA分析]，设定校准值Rmin的和RMAX （图3B）在FL的校准标签布局WINLAB软件，据报道在用户指南中。
注意：如果没有此软件，则必须按照数据分析第1点中的说明确定每个样品的Rmin和Rmax 。

按转换为[离子]按钮（图3B），使用之前设置的校准值将信号的原始数据集转换为Ca 2+离子浓度数据集，并保存生成的文件。如果没有FL WinLab软件，则必须使用Grynkiewicz等人的公式计算Ca 2+离子浓度。（1985）。

图3. FL WinLab软件。A.牛逼他红绿灯按钮，可以启动和停止的分析和介绍了仪器的状态。乙。Ť他校准选项卡布局允许以管理原始数据和转换为[离子]按钮以可视化的数据（从FL WINLAB用户指南，PerkinElmer公司，英国）。

计算添加CaCl 2之前和之后存在的Ca 2+离子之间的差异（图4）。

图4. FL WinLab软件生成的用于在添加CaCl 2之前和之后计算Δ[ Ca 2+ ] c的图的示例。迹线中存在峰是由于LS-50B发光光谱仪每两秒钟移动一次波长的变化而引起的。因此，必须考虑基线（虚线）来进行Ca 2+浓度的计算。大约50 s后，当信号稳定后，添加CaCl 2 （红色箭头），并在基线达到的最高Ca 2+浓度值（蓝色箭头）和该值之间计算Δ[Ca 2+ ] c添加CaCl 2时（红色箭头）。

孵育在HBSS将细胞缓冲液补充有的Fura 2-AM（基础条件）或HBSS缓冲液补充有2毫米的Fura 2-AM和不同碳源（例如。，5 mM的葡萄糖，果糖或蔗糖），50 μM ATP，或其他感兴趣的条件。值得注意的是，应该从测量开始仅在50秒后最佳地添加这些化合物（图5）。

数据分析

1.使用Grynkiewicz等人的公式计算游离细胞内Ca 2+的浓度。（1985年）：

Ca-Fura-2配合物的K d ：D缔合常数

β ：˚F luorescence强度比为380nm的激发波长，并用不含Ca 2+

R：- [R得到的荧光强度的ATIO

ř分钟和- [R最大：˚F的Ca luorescence强度比激发在340nm和380nm处，在不存在（分钟），并在存在（最大）2+ ，分别

2.为了验证结果，必须进行多次生物学复制。在这里，进行了十次独立的实验，数据点和误差线（图5）分别代表平均值和标准误差。在PSAV DAPP-PG 722个细胞中，这已经观察到，在基础条件下（我。ê 。，HBSS缓冲液）增加外部的Ca 2+的增加的细胞内的Ca结果2+浓度。响应于培养基中外部Ca 2+浓度，胞质Ca 2+浓度迅速增加（图5）。当不同的碳源（葡萄糖，果糖或蔗糖）或ATP与Ca 2+结合使用时，这种趋势得到了抑制（图5）。

图5.一种细胞内的Ca的增加2+水平假单胞菌savastanoi PV 。萨瓦斯坦（Psav ）DAPP-PG 722 。在HBSS培养基中（基础条件，实心正方形）或在葡萄糖，果糖，蔗糖，吲哚3乙酸（IAA）或色氨酸（空心圆）存在下，在细胞外氯化钙的浓度范围内孵育的Psav细菌细胞。每个点代表10个独立实验的平均值±SE。从Moretti等人。（2019 ）。

食谱

Luria Bertani（LB）培养基（1升）
将800毫升MilliQ水加到1升量筒中
用磁棒将量筒放在磁力搅拌器上
加入10克胰蛋白,、 5克酵母提取物和5克氯化钠
加入MilliQ水至1升
倾250毫升介质分为四个500毫升PYREX ®玻璃瓶
在121 °C下高压灭菌20分钟

致谢

这项工作得到了DSA3研究基金“ Fondo di base”的财政支持，并由他们共同撰写了CM，RB和CAP。此方法已在Moretti等人中使用。（2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突，也没有竞争的经济利益。

从研究中包括的所有个体参与者获得知情同意。

参考

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