材料和试剂

10μl，20μl，200μl，1,000μl移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，目录号：2140-05、72830-440、72830-044、72830-042）
1 ml，5 ml，10 ml，25 ml，50 ml无菌血清移液管（Thermo Fisher Scientific，目录号：14672-918、14672-920、4101、14672-900、53384-451 ）
6孔组织培养皿中（Corning，隼® ，目录号：353046 ）
带无菌盖的96孔组织培养平底板（Costar TM ，目录号：29442-056）
深孔96孔无菌平板（Life Technologies，目录号：11388-566）
15和50毫升锥形管中（Corning，隼® ，目录号：353110和352098）
聚丙烯微量离心管（Life Technologies | AB / Invitrogen，目录号：AM12400）
2 ml螺帽管（Sarstedt，目录号：72.694.006）
T-75烧瓶（Corning，目录号：3276CS）
T-150烧瓶（Corning，目录号：430825）
WYPALL吸水纸巾（金佰利®专业版，目录号：KIM41200）
水库（Costar公司试剂水库，康宁® ，目录号：29442-474）
冷冻小瓶（Corning，目录号：431386）
通过美国组织培养物保藏中心（ATCC，目录号：CRL-2378.1）获得MA-104克隆1细胞。
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）1 ×无钙，无镁，pH 7.0-7.3（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14190-250 ）
伽马射线照射的胎牛血清（GE Healthcare，Hyclone TM ，目录号：SH3007103IREA-HYL ）
1 ×抗生素-抗真菌药（Life Technologies | AB / Invitrogen，目录号：15240062 ）
0.25％胰蛋白酶0.53 mM EDTA（Life Technologies | AB / Invitrogen，目录号：12604-013）
DMEM （Fisher Scientific，目录号：11965-118）
恢复冷冻介质（Thermo Fisher，目录号：12648-010）
丙酮（Fisher Scientific，目录号：A18-4）
甲醇（Fisher Scientific，目录号：A412P4）
异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A415-4）
乙醇（Sigma - Aldrich，目录号：E7023 ）
马血清（Vector Laboratories，目录号：S-2000）
由APHIS，USDA产生ASFV P30单克隆抗体（吴等人。，2020）
的Vectastain ® ABC试剂盒，过氧化物酶小鼠IgG（Vector Laboratories公司，目录号：PK4002）
矢量® VIP，过氧化物酶底物试剂盒SK-4600（Vector Laboratories公司，目录号：ZF0517）
牛白蛋白组分V低内毒素，BSA（MP生物医学，目录号：810681）
ASFV野毒株：例如ASFV-乔治亚州野毒株（ASFV-G）
MA-104媒体（请参阅食谱）
阻塞缓冲区（请参见配方）
固定解决方案（请参阅食谱）
猪血红细胞的25％v / v悬浮液（请参阅食谱）
0.1％BSA（请参阅食谱）
70％乙醇（请参阅食谱）

设备

2 L烧杯
弗罗斯蒂冷冻箱先生（Nalgene，目录号：5100-0001）
II级生物安全柜（LABCONCO ® ，NSF ® ，型号：D045939）
加湿的37±2°C，5±1％CO 2培养箱（Panasonic，目录号：KM-CC17RU1A）
-70°C冰箱（Panasonic MDF-U76VA-PA ，目录号：17117N0425）
-20℃的冰箱（Kenmore的，米Odel等：2539261110 ）
4°C的冰箱，可接受范围为2°C至8°C（Sanyo Medicool ，型号：MPR-513）
液氮冷冻室<-120°C储存温度。
37°C水浴（Lab-line Aquabath TM ，型号：18052AQ）
移液器（Drummond Scientific，目录号：4-000-101）
微量移液器：单通道，1-10 µl，2-20 µl，50-200 µl，100-1,000 µl （Eppendorf目录编号：Q11390H，K12770H，Q24196H，L18745H）
移液器：多通道，0.5-10微升，5-50微升，50-300微升（实验室小号ystem ，Ç atalog数字：N87539，D23745，E21512）
多通道用于更大体积（Rainin TM Pipet-Life XLS，L-1200，100-1,200 µl，目录号：17014497）
倒置显微镜（Carl-Zeiss ，型号：Axio Observer 3）
亮线血细胞计数器（Sigma，目录号：Z359629）
台式离心机（Eppendorf，型号：5417R）
SORVALL ® LYNX 6000（赛默飞世尔科技，目录号：75006590）
涡旋混合器（Daigger vortex Genie2 TM ，目录号：G22220）
平板振荡器（Gene Mate，BioExpress Rocker Variable，目录号：R-3200-1）

程序

在干冰或液氮中冷冻从ATCC融化的MA-104细胞的冷冻小瓶
从干冰或液氮存储中取出MA-104细胞的冷冻小瓶。
在37解冻MA-104细胞 °C水浴。
将MA-104细胞冷冻小瓶的盖子放在水面上方，以减少污染的机会。
当MA-104细胞几乎融化时（只有一小块冰），将小瓶移至组织培养罩。
用70％的乙醇擦拭小瓶的表面，然后除去顶部。
用无菌巴斯德吸管小心取出MA-104细胞悬液。
在37 °C的T75烧瓶中轻轻加入MA-104细胞，其中装有15 ml预热的MA-104培养基
将MA-104细胞放在5％CO 2培养箱中的T75烧瓶中。
24小时后，丢弃旧媒体。
在T-75烧瓶中加入15 ml MA-104培养基，并将烧瓶放入5％CO 2培养箱中。

MA-104细胞培养子当共nfluent （图1）在比1：3至1:10
除去并丢弃培养基。
用10 ml 1 × DPBS冲洗MA-104细胞单层。
要去除痕量的含胰蛋白酶抑制剂的血清，只需用0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA溶液冲洗细胞单层即可。
向烧瓶中加入3.0 ml胰蛋白酶-EDTA，并将烧瓶保持在5％CO 2培养箱中，在倒置显微镜下每2分钟观察一次，直到细胞单层完全分散（通常需要5-15分钟）。
加入8.0 ml MA-104培养基并通过上下轻轻移液来破坏细胞
向新的T-150烧瓶中加入约1 ml细胞悬液的等分试样
在5％CO 2培养箱中于37 °C孵育培养物

图1. 100％融合的MA-104细胞，准备将其传代到新的烧瓶中

用于制备MA-104细胞的传代培养和铺板比率：

为了在分裂后2天达到80％的MA-104细胞融合度，使用1：3的比例。

为了在分裂后4-5天达到MA-104细胞80％的融合，使用1:10的比例。

培养MA-104细胞在6 -孔培养皿，在种子1 × 10 6个细胞/孔。

培养MA-104细胞在96 -孔培养皿，在种子1 × 10 4个细胞/孔。

冷冻MA-104细胞的程序
乙EFORE冷冻MA-104细胞检查细菌，酵母，或倒置显微镜下真菌污染。
在生长的对数期（70-90％融合之间；图2 ），仅冷冻健康的细胞。

图2. MA-104细胞显示处于活跃对数生长期，可随时准备用于冷冻原种

分裂MA-104细胞：丢弃旧的生长培养基。用10 ml 1 × DPBS洗涤细胞单层，然后弃去1 × DPBS。用胰蛋白酶/ EDTA冲洗细胞并丢弃，然后加入3 ml胰蛋白酶/ EDTA。一旦细胞开始分离，轻轻摇动烧瓶，并用8 ml生长培养基重悬细胞。轻轻地上下吹打以分散团块，分散细胞，得到均匀的悬浮液。
使用血细胞计数器在倒置显微镜下计数细胞。
用于冷冻的细胞数应在5 × 10 6 -1 × 10 7细胞/小瓶的范围内。计算最终细胞浓度在此范围内所需的冷冻培养基体积。
转移细胞悬液至无菌离心管，平衡离心机，和在离心机201 ×克（1 ，000 rpm）离心5分钟。
小心地去除尽可能多的上清液，而不会干扰沉淀
通过将计算量的回收冷冻培养基（Thermo Fisher，目录号：12648-010）添加到2 ml螺帽管中，快速重悬沉淀，并在管上贴上标签。
将小瓶放入Mrs. Frosty Freezing容器中，该容器可使细胞缓慢冷却。
关闭冷冻容器，并在-70 °C放置至少过夜。
第二天，将冷冻的MA-104小瓶转移到液氮中

血液吸附（HA）检测MA-104细胞中的ASFV滴定
对于在96滴定-孔培养板用1 × 10 4个细胞/在MA-104介质以及制备推荐的细胞悬液/孔体积为100 µl。
制备吨烯倍使用MA-104介质的每一非洲猪瘟病毒样品（猪血）的连续稀释液。
从10 -7至10 -1的顺序将50 µl ASFV样品的每种稀释液添加到含有100 µl MA-104细胞的平板孔中。
在37°C和5％CO 2下孵育细胞。
感染（hpi）后24小时，将1微升猪红细胞的25％v / v悬浮液添加到平板中的MA-104细胞的每个孔中。
在37°C和5％CO 2下孵育7天。
在倒置显微镜下观察培养皿的吸血情况，以确认感染。
使用Reed and Muench方法（Reed and Muench，1938年）通过Hemadsorping剂量（HAD）计算病毒滴度，并将其表示为log 10 HAD50 / ml。

HA检测MA-104中的ASFV感染
对于HA，将2 ml在MA-104培养基中制备的MA-104细胞悬液平板接种在6孔组织培养皿中，密度为1 × 10 6个细胞/孔。
非洲猪瘟病毒字段样品添加到6孔板的三个孔用1 μ升，10 μ升和100 μ升。
1 hpi，将100μl猪红细胞25％v / v悬浮液分别添加到每个孔中。
感染后24 h，观察ASFV感染的细胞在MA-104细胞中的玫瑰花结形成（图3）。根据ASF样品的数量和质量，玫瑰花结的形成时间可能会更长，如果在24 hpi时未观察到玫瑰花结，则每天检查7天。

图3 。被ASFV-G感染并与显示清晰HA的红细胞一起孵育的MA-104细胞

我mmunoperoxidase（IPA）在MA-104细胞染色ASFV
*在生物安全柜上执行*

将2 ml在MA-104培养基中制备的MA-104细胞悬液以1 × 10 6个细胞/孔的密度平板接种在6孔组织培养皿中。
非洲猪瘟病毒字段样品添加到6孔板的三个孔用1 μ升，10 μ升和100 μ升。
将板在培养箱中于37°C孵育72小时。
从培养箱中取出培养皿。
丢弃媒体通过反相板和倾倒到媒体2升烧杯中，然后将介质的其余部分浸泡通过反转镀到厚纸张保持毛巾在盘容器
固定用2-细胞毫升定影液：在每个孔中（1丙酮和甲醇的1:1溶液）。
将板在室温下孵育15-20分钟。
准备解决方案：
封闭溶液：DMEM + 2％正常马血清保持在4°C
抗体溶液：DMEM + 2％正常马血清+ ASFV p30单克隆抗体（1：200稀释）保持在4 °C
抗小鼠IgG溶液：DMEM + 2％正常马血清+ 0.25％抗小鼠IgG （Vectastain ABC试剂盒，过氧化物酶小鼠IgG）保持在4 °C
1 × DPBS + BSA + A + B溶液：1 × DPBS + 0.1％BSA + 0.6％A + 0.6％B（“ A”和“ B”是Vectastain ABC试剂盒的成分），保持在4 °C
过氧化物酶底物溶液：1 × DPBS（从实验室容器）+矢量® VIP试剂保持在4 ℃（使用来自每个每5ml溶液中的四瓶的3滴）

*在台式机上执行*

丢弃定影溶液在2升烧杯中，转化平板上厚纸巾以除去剩余的定影液和风干板为10分钟。
加入2 ml /孔的封闭液。轻轻敲击或摇动所述板，以确保在整个表面的每个井被覆盖由该溶液。
将板在37°C下孵育30分钟。
将封闭溶液弃于2 L烧杯中，将板倒置在厚纸巾上，以除去剩余的封闭溶液。
添加2毫升/孔抗体溶液。
将板在37°C下孵育30分钟。
将抗体溶液丢弃在2 L的烧杯中，并使用挤压瓶用1XD PBS冲洗2次。
添加2米I /孔的抗小鼠的lgG溶液。
将板在37°C下孵育30分钟。
在30分钟的孵育过程中，准备1 × DPBS + BSA + A + B溶液。在1 × DPBS中添加0.1％BSA w / v ，并充分混合，然后从Vectastain ABC试剂盒库存中添加0.6％v / v溶液A和溶液B。将新鲜配制的1 × DPBS + BSA + A + B溶液保持在室温下。
将抗小鼠IgG溶液倒入2 L烧杯中，并使用挤瓶用1 × D PBS冲洗2次。
加入2 ml /孔的1 × D PBS + BSA + A + B溶液。
孵育所述板（一个或多个）在37℃下进行30分钟。
将1 × DPBS + BSA + A + B溶液丢弃在2 L的烧杯中，并使用挤瓶用1 × DPBS洗涤2次。
加入2 m I /孔过氧化物酶底物溶液。
在室温下孵育平板10分钟。
将过氧化物酶底物溶液倒入2 L的烧杯中，并用自来水冲洗板。
风干该板用于10分钟。
使用里德和穆恩奇方法（Reed and Muench，1938）计算滴度。图4显示阳性ASFV染色。
注意：执行洗涤时要格外小心，因为每个洗涤步骤需要使用不同的溶液，并且溶液之间的交叉污染可能会导致实验失败和读数错误。

图4 。使用抗结构蛋白p30的单克隆抗体对固定感染了ASFV-G的MA-104细胞进行IPA染色以进行ASFV染色，MA-104细胞显示出清晰的ASFV染色

数据分析

Requir的EMENT在初级猪巨噬细胞病毒培养是一种技术上的挑战过程和用于检测和定量感染非洲猪瘟病毒是历史上完成的。我们先前将MA-104细胞鉴定为可支持ASFV强劲生长的市售细胞系，从而可从临床和现场样品中检测出感染性ASFV（Rai等人，2020）。MA-104细胞的倍增时间为72小时，重要的是，不需要任何特殊培养基来培养这些细胞或在这些细胞中进行病毒培养。MA-104细胞可大批量容易冻结，从而允许在疾病爆发所需数量的细胞的及时扩展时需要大量的样本的小号要被处理，以确认样本是否只包含非洲猪瘟病毒DNA或感染性病毒ASFV。因此，MA-104细胞可以绕过产生猪巨噬细胞的原代细胞培养物（需要新鲜的猪血，这是普通兽医诊断实验室不容易获得的），从而可以帮助快速诊断ASFV。可以使用抗ASFV特异性抗体通过HA或IPA染色轻松检测MA-104细胞中的感染性ASFV 。IPA染色可以进一步检测在CD2中具有突变且无法形成HA的ASFV野外分离株。IPA染色将用于PCR呈阳性但未观察到HA来确定样品中是否存在活感染性病毒的情况下（Borca等，2018 ）。通过IPA对ASFV感染的细胞进行清晰染色优于使用猪巨噬细胞作为底物，因为猪巨噬细胞具有固有的过氧化物酶活性，导致未感染细胞的染色背景高，从而导致假阳性反应（Rai等人，2020）。

笔记

解冻MA-104细胞时，切勿使细胞瓶无人看管，因为在37°C下，细胞解冻会在1-2分钟内完成，并且在37°C下长时间暴露会导致冷冻保护剂毒性。当仍有少量冰晶残留时，从水浴中取出小瓶。
解冻后立即对细胞特别敏感。应将它们播种到预热的培养基中。
应避免低接种密度，以启动从液氮存储或供应商提供的小瓶中取出的细胞。
等待细胞分离时，请勿通过敲打或摇动烧瓶来搅动细胞，以免细胞结块。地方细胞是难以在37到分离延长的时间℃，以促进分散。
不要将细胞在-70°C下保存2天以上。它将降低细胞活力。
冷冻细胞时，请勿在室温下长时间放置于Recovery冷冻培养基中，因为培养基中的冷冻保护剂会对细胞有毒。
该协议应在动物生物安全3级实验室中进行，因为ASFV是一种选择剂，只能将其指定为动物生物安全3级实验室进行处理。
容器的外部需要通过用10％漂白剂浸泡的毛巾擦拭来进行表面消毒。
要在不同的工作区域和存储区之间转移包含病毒的小瓶，培养皿或存储箱，请始终使用空气密封的辅助容器。
仅在生物安全柜中打开辅助容器。在从生物安全柜中取出表面之前，请同时污染样品瓶/板/盒和辅助容器。
将所有固体和液体废物容纳在经过批准的Biohazard容器中。以适当的周期进行高压灭菌后，处置实验中使用的所有材料。

菜谱

MA-104媒体
500毫升DMEM

50毫升FBS

5毫升抗生素-抗真菌药

阻塞缓冲
500毫升DMEM

10毫升（2％）马血清

定影液（丙酮和甲醇的1：1溶液）
50毫升丙酮

50毫升甲醇

0.1％牛血清白蛋白
将0.5 g BSA（4°C）添加到500 ml 1 × DPBS瓶中

猪红细胞的25％v / v悬浮液
加入9毫升红细胞沉淀和27毫升1 × DPBS，使25％的血液在1 × DPBS中

储存在4 °C标签上的红细胞的百分数和日期

70％乙醇
70毫升100％乙醇

30毫升dH 2 O

致谢

通过与美国国土安全部科学技术局的跨机构协议资助的Ma-104细胞的鉴定，编号为：70RSAT18KPM0000138。

通过美国能源部（DOE）与美国能源部（DOE）之间的跨机构协议，任命了橡树岭科学与教育学院（ORISE）管理的梅花岛动物疾病中心（PIADC）研究参与计划，这在一定程度上支持了这项研究。美国农业部（USDA）。ORISE由ORAU管理，DOE合同编号为DE-SC0014664。

利益争夺

作者Ayushi Rai，Manuel Borca和Douglas Gladue已申请使用MA-104细胞作为ASFV检测底物的专利。

参考

Borca，MV，Holinka，LG，Berggren，KA和Gladue，DP（2018）。CRISPR-Cas9，一种有效提高重组非洲猪瘟病毒发展的工具。科学代表8：3154。
Rai，A.，Pruitt，S.，Ramirez-Medina，E.，Vuono，EA，Silva，E.，Velazquez-Salinas，L.，Carrillo，C.，Borca，MV和Gladue，DP（2020）。连续稳定和可商购的细胞系的鉴定，用于鉴定临床样品中的非洲传染性猪瘟病毒。病毒12（8）。doi：10.3390 / v12080820。
里德（Reed，LJ）和穆安奇（Muench，H）（1938）一种估算百分之五十端点的简单方法。美国卫生学杂志27 （3）：493-497。
Tulman，ER，Delhon，GA，Ku，BK和Rock，DL（2009）。非洲猪瘟病毒。于：鲜为人知的大型dsDNA病毒。施普林格出版社柏林海德堡卷。328页，第43-87页。
Whitaker，AM和Hayward，CJ（1985）。三种猴肾细胞系的表征。Dev Biol Stand 60：125-131。
吴，P 。，Lowe ，A 。d 。，罗德里格斯（Y. Rodriguez ）。ÿ 。，Murgia ，M 。V 。，多德（Dodd），K 。一。，罗兰，R 。[R 。和贾，W. （2020 ）。非洲猪瘟病毒磷蛋白P30的抗原区域。跨境紧急通讯地址：10.1111 / tbed.13533。