材料和试剂

1. 35毫米µ盘，高玻璃底部（ibidi ，目录号：81158）

2.线性亚乙基聚乙烯亚胺（PEI），MW 25000，转染等级（PEI 25K TM ；Polysciences ，目录号：23966-1）

3. 60-70％融合的HeLa细胞

为了进行该分析，从细胞系服务获得细胞。我们之所以使用这些细胞，是因为它们易于转染，具有适合囊泡可视化的大小并且易于处理，但是，也可以使用其他细胞系（请参阅注1）。

4. 1 × Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS），无钙，无镁（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190144）。储存温度：4 °C

5. pIRESneo3-Str-KDEL-MMP2-SBP-EGFP载体。储存温度：-20 °C

重要说明：此质粒是通过用Addgene质粒编号65264（Str -KDEL_ST-SBP-EGFP）中的MMP2（我们的目标蛋白）替换ST（ST6GAL1）序列而产生的。

6.的Opti -MEM ®减少血清培养基（Life Technologies公司，Gibco公司，目录号：31985070）。储存温度：4 °C

7. 500 mM d生物素（Merck，SUPELCO，目录号：47868）。储存温度：4 °C

8. Dulbecco氏改良的Eagles培养基，高克lucose，GlutaMAX的TM ，丙酮酸钠（DMEM，Life Technologies公司，Gibco公司，目录号：10569010）。储存温度：4 °C

9.热灭活的胎牛血清（FBS； Life Technologies，Gibco ，目录号：16000044）。储存温度：-20 °C

10.青霉素/链霉素（P / S； Life Technologies，Gibco ，目录号：15140122）。储存温度：-20 °C

11. DMEM，高葡萄糖，HEPES，无酚红（Life Technologies公司，Gibco公司，目录号：21063029）。储存温度：4 °C

12. 1毫克/毫升的PEI溶液（请参阅食谱）

13. DMEM完全培养基（请参阅食谱）

设备

电磁搅拌器
层流罩
细胞培养箱设置为37 °C ，5 ％CO 2
水浴温度设定为37 °C
显微镜：
DeltaVision Elite系统基于：
奥林巴斯IX-71倒置显微镜（奥林巴斯公司）
奥林巴斯60 ×/ 1.42 PLAPON油镜（奥林巴斯公司）
PCO pco.edge sCMOS 5.5显微镜相机
7色InsightSSI模组雷射
DAPI -FITC-TRITC-Cy5和/或CFP-YFP- mCherry过滤器
活细胞成像孵育室的温度设置为37 °C 。可选：5％CO 2和湿度。

软件

SoftWoRx 5.5软件（GE Healthcare，http： //incelldownload.gehealthcare.com/bin/download_data/SoftWoRx/7.0.0/ReleaseNotes%20softWoRx%207.0.0.html ）
斐济（Schindelin等，2012 ，https://fiji.sc）

程序

细胞培养和质粒转染
所有涉及细胞培养的步骤都必须在层流罩中进行
种子3 × 10 4的HeLa细胞在ibidi使用2毫升35毫米μ-培养皿DMEM完全培养基。至少准备3 -每个实验5菜肴。
将细胞在37 °C ，5％CO 2下孵育24小时。
设置PEI的转染反应（每皿/孔：200微升的OptiMEM + 2微克RUSH构建体，例如，pIRESneo3-SS-STR-KDEL-MMP2-SBP-EGFP，+ 15微升50毫摩尔PEI溶液）。
涡旋转染反应，并在室温下孵育20分钟。
滴加到细胞中，并在37 °C ，5％CO 2下孵育24小时。

活细胞成像
1.设置用于活细胞成像的孵育室。在开始实验之前，将腔室预热至少2小时。

2.从细胞中去除培养基，并用1 × DPBS洗涤一次。

3.加入1 ml DMEM高葡萄糖，HEPES，无酚红。

4.将细胞带到培养箱中，并将荧光细胞聚焦在多个视野上。将曝光时间调整为最大荧光强度的50％，因为在高尔基（Golgi）压实货物时，信号会增加。图2描绘了时间0时的视野示例。

图2 。HeLa细胞瞬时表达MMP2-RUSH构建体。用于记录MMP2囊泡运输的选定视野的广域反褶积显微镜图像。该图像对应于视频的第一时间帧（t = 0）。红色正方形突出显示了视频1中显示的单元格。比例尺：20 µm。

视频1 。MMP2eGFP交易的活细胞显微镜检查。视频描述了图强调了细胞URE 1带有红色正方形。它很好地显示了生物素孵育20分钟后的高尔基体压实，以及添加生物素后35分钟时来自高尔基体的囊泡出芽。

5.可选：以0.35 µm的步长获取Z堆栈，以对多个平面成像。

6.在细胞顶部的培养皿中加入1 ml DMEM高葡萄糖，HEPES，无酚红和80 µM生物素的补充液，以使最终生物素浓度达到40 µM（1：1稀释）。

7.立即在1分钟的时间范围内开始采集45分钟。

8.每次使用新培养皿重复该过程，直到至少成像10-15个细胞

影像分析
活细胞
使用softWoRx软件对图像序列进行反卷积。另外，也可以使用斐济数据分析期间执行去卷积图像（参见插件卷积3D和反卷积实验室）。
将文件另存为* .dv。视频1显示了HeLa细胞中MMP2 RUSH的45个1分钟时间序列。

数据分析

在斐济打开图像序列文件。如果每个图像都保存为单个文件，请打开一组相应的文件，然后使用“要堆叠的图像”工具将它们按顺序分组。如果将图像保存为序列，则在打开文件时将看到以下窗口弹出（图3）：

图3 。在斐济导入图像窗口

要正确打开文件，请确保在视图堆栈菜单（第1号）中选择“超级堆栈”，不要单独导入文件（即第2号中没有选择），也不要分割时间点或通道（第2号）。 3）。用于分析的宏已经集成了分割通道功能。
可选：通过单击“图像”菜单>“堆栈”>“ Z-项目”来堆叠Z帧（图4A）。在此菜单中，确保所选的投影类型为“最大强度”（箭头，图4B）。

图4 。Z投影菜单的屏幕截图。A. Z堆栈的选择。B. Z-stack菜单。箭头指示应选择的投影类型。

将生成一个文件（MAX_“原始文件名”）。将其保存在将保存处理过的图像的位置。
根据每个文件成像的单元格数量，您可以根据需要将整个视场裁剪为单个单元格。以此目的：
选择矩形工具（红色箭头，图5A）。选择徒手工具也很有用。
通过单击图像菜单>复制来复制选择（图5B）。
保存重复的图像并关闭原始图像。宏将不会在打开2张图像的情况下运行。

图5 。选择一个单细胞进行分析。A.使用矩形工具（红色箭头）选择单个单元格。B.复制所选单元格以进行进一步处理。

在斐济打开用于“活细胞囊泡分析”的定制ImageJ宏，网址为https://github.com/MehrshadPakdel/RUSH-Vesicle-Analysis/blob/master/Live-Cell_Vesicle_Analysis_V2.ijm（图6）。

图6 。显示用于生命细胞分析的宏的窗口

您可以根据信号强度和感兴趣货物的运输速度，在宏中调整自动阈值方法以优化ER信号和Golgi信号。
运行宏。将对所有帧量化囊泡，并将生成结果文件并将其自动保存在原始文件目录中的新结果文件夹中（请参阅第4步）。图7说明了最终结果，显示了每个帧的二进制文件（Binary_filename ，图7A），以及粒子分析器窗口（Particle_filename ，图7B）和囊泡计数（log窗口，图7C）。可以将这些值复制到excel电子表格中，以进行单细胞定量或与其他细胞系进行比较。有关进一步的可能分析，请参见Deng等。（2018 ）和Pacheco-Fernandez等。（2020年）。
重要的是，并非所有单元都显示货物运输。我们观察到，在一小部分细胞中，货物在添加生物素后从未离开过ER。这些细胞应排除在分析范围之外。
统计分析可以在时间点，不同治疗方法，不同细胞系等之间进行比较。为此，除非数据遵循正态分布，否则使用非参数t检验比较至少15个细胞的平均囊泡数量。如果是这种情况，请执行一次样本t检验。

图7 。囊泡定量分析的结果。该图显示了使用活细胞RUSH囊泡分析宏进行囊泡定量分析的屏幕截图。窗口（A）描绘了每个时间帧生成的二进制图像；窗口（B）的颗粒（即囊泡）识别；窗口（C）在每个时间范围内对囊泡的定量。突出显示的是所描绘的时间范围（42/46）的囊泡数量。

笔记

1.该系统在其他细胞系上也能很好地工作，但是，PEI转染方案可能不适合，因此应首先建立其他转染试剂或方法。以我们的经验，RUSH系统在HEK和MDA-MB-231细胞中也能很好地工作，尽管对于MDA-MB-231细胞，仅使用Lipofectamine 2000成功转染。

2.共聚焦显微镜的设置也可以在35毫米培养皿中进行。我们建议至少计数15个单元格，以进行有效的统计分析。

菜谱

PEI解决方案
将50 mg聚乙烯亚胺溶于40 ml蒸馏水中
用电磁搅拌器在稍微加热的板上将溶液充分混合
调节pH至7.4
完整体积可达50毫升
分装成500 µl，并储存在-20 摄氏
DMEM完全培养基
加入FBS和P / S至终浓度分别为10％和1％，以制备500 ml DMEM培养基

致谢

该协议先前已在出版物（Deng等人，2018）和（Pacheco-Fernandez等人，2020）中记录过。这项工作得到了Deutscher Akademischer Austauschdienst （DAAD），Deutsche Forschungsgemeinschaft （DFG），美国国立卫生研究院（NIH），透视计划（Boehringer Ingelheim Fonds ）和马克斯·普朗克生物化学研究所的资助。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争性的经济利益。

参考

Boncompain ，G.，Divoux ，S.，Gareil ，N.，de Forges，H.，Lescure ，A.，Latreche ，L.，Mercanti，V.，Jollivet ，F.，Raposo ，G.和Perez，F. （2012）。细胞群体中分泌蛋白运输的同步。Nat Methods 9（5）：493-498。
Boncompain ，G.和Perez，F.（2013年）。基于荧光的哺乳动物细胞运输分析。方法细胞生物学118：179-194。
Boncompain ，G.和Weigel ，AV（2018）。高尔基综合体中的运输和分类：多种机制对各种货物进行分类。Curr Opin Cell Biol 50：94-101。
Cancino ，J.，Capalbo ，A。和Luini ，A。（2013）。高尔基依赖信号：膜运输的自我协调。方法细胞生物学118：359-382。
Chen D.，ES Gibson和MJ Kennedy（2013）。光触发的蛋白质分泌系统。J Cell Biol 201（4）：631-640。
Deng，Y.，Pakdel ，M.，Blank，B.，Sundberg ，EL，Burd ，CG和von Blume，J.（2018）。SPCA1钙泵的活动将鞘磷脂合成与反式高尔基体网络中的分泌蛋白分选相结合。Dev Cell 47（4）：464-478 e468。
Glick，BS和Luini ，A.（2011年）。高尔基交通模型：关键评估。Cold Spring Harb Perspect Biol 3（11）：a005215。
Kurokawa ，K.，Osakada ，H.，Kojidani ，T.，Waga ，M.，Suda ，Y.，Asakawa ，H.，Haraguchi ，T.和Nakano，A.（2019）。可视化高尔基体内部的分泌性货物运输。J Cell Biol 218（5）：1602-1618。
Pacheco-Fernandez，N.，Pakdel ，M.，Blank，B.，Sanchez-Gonzalez，I.，Weber，K.，Tran，ML，Hecht，TK，Gautsch ，R.，Beck，G.，Perez，F 。，Hausser ，A.，Linder，S.和von Blume，J.（2020）。Nucleobindin-1通过促进MMP的高尔基体内运输来调节ECM降解。J Cell Biol 219（8）。
Pantazopoulou ，A.和Glick，BS（2019）。膜交通通路的动力学视图可以超越高尔基隔室的经典视图。前沿细胞生物学杂志7：153。
Pfeffer ，SR（2010）。高尔基体如何工作：胸骨祖细胞模型。美国国家科学院学报（Proc Natl Acad Sci）美国A 107（46）：19614-19618。
Schindelin ，J.，阿尔甘-Carreras，I.，雄犬，E.，Kaynig ，V.，Longair ，M.，Pietzsch ，T.，Preibisch ，S.，Rueden酒店，C.，萨尔费尔德，S.，施密德，B ，Tinevez ，JY，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri ，K.，Tomancak ，P。和Cardona，A。（2012）。斐济：一个用于生物图像分析的开源平台。Nat Methods 9（7）：676-682。
Stephens D.和Perez F.（2013年）。前言。在：佩雷斯（F.）和史蒂芬斯（D.）（编辑）。高尔基复合函数分析方法（第118卷，第xix–xx页）。学术出版社。