材料和试剂

1. P ipette提示

2. 12和24孔细胞培养板（Greiner，蜂星，产品目录号：665180和662160）

3.旋盖式尿杯（Sarsted ，目录号：75.9922.721）

4.塑料基模（Simport ，目录号：HIS0221）

5. Parafilm M（Amcor，目录号：PM996）

6. 2毫升试管（Sarstedt ，目录号：72.693.105）和5毫升试管（Sarstedt ，目录号：62.558.201）

7.无菌过滤器0.2微米（康宁，目录号：431219）

8.培养皿直径为100毫米（Corning，目录号：CLS43016）

9.棉签（高压灭菌）（从当地超市购买）

10.猪眼球（当地屠宰场或屠夫）

注意：对于此协议，不能控制动物的年龄和品系。各国之间也可能有所不同。

11.来自人类供体组织的角膜基质细胞（在Fernández- Pérez和Ahearne ，20 19b中进行了描述）

12.来自人类角膜缘活检的角膜上皮细胞，或永生化的人类角膜上皮细胞系（EverCyte ，目录号：hTCEpi ）

13.聚维酮碘消毒剂10％w / w（Ecolab，Videne ，目录号：HAS051P）

14. OCT嵌入冷冻嵌入矩阵（Thermo Fisher Scientific，目录号：12678646）

15.液氮保存在小型绝缘容器中

16.不含CaCl 2和MgCl 2的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）

17.去细胞溶液。十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4390）和Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）

18.氯化镁（西格玛奥德里奇，目录号：M0250）

19.氯化钙溶液（Sigma-Aldrich，目录号：21115）

20. DNase（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）

21. RNase（西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich），目录号：R5000）

22.高压灭菌的去离子水

23.抗微生物剂，2％的V / V青霉素-链霉素（Gibco公司，目录号：15140122）和0.25微克/毫升两性霉素B（Sigma-Aldrich公司，默克公司，目录号：A2942）的PBS或细胞培养基中。

24.聚四氟乙烯（聚四氟乙烯）切成直径12毫米的圆盘（Chemours ，2毫米厚的薄片）

25.大鼠尾部胶原蛋白〜10 mg / ml（Corning，目录号354249）

26. Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）低葡萄糖（Hyclone ，目录号：10529702）

27. DMEM / F12 1：1（Hyclone ，目录号：SH30023.01）

28.胎儿牛血清（FBS）（Gibco公司，目录号：10270106）

29.抗坏血酸（西格玛奥德里奇，目录号：A8960）

30. ITS 100 × （Gibco ，目录号：41400045）

31.角质形成细胞生长培养基（PromoCell ，目录号：C20011）

32.手动细胞计数器和血细胞计数器（Blaubrand ，目录号：BR717805）

33. 10 ×不含CaCl 2和MgCl 2的PBS （Corning，目录号：46-013-CM）

34.酚红钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：P5530）

35. 1 M NaOH （Honeywell，目录号：CCS8045）

36.脱细胞溶液（请参阅食谱）

37. MgCl 2缓冲液（请参见食谱）

38. DNase和RNase解决方案（请参阅食谱）

39. 10 ×含酚红的PBS（请参阅食谱）

40.基质细胞培养基（请参阅食谱）

41.角质化细胞（请参见食谱）

设备

解剖和操纵工具（无菌钳，剪刀，手术刀，包括弯曲成L形的2 mm宽刮铲（Witig ，目录号：WITG7.412.051）
直径10 mm的活检打孔器（Acuderm ，Acu -Punch，目录号：P1050）
低温恒温器（徕卡，型号：CM1850UV）
-80°C冰箱（Thermo Fisher，型号906）
轨道振动筛（Witeg SHO-1D）
搅拌板（Henry Troemner ，VWR，高级系列4x4）
离心机（海蒂诗，型号：320R）
37°C烤箱（Memmert ，UF55）
生物安全柜（Faster Srl 。，SafeFAST Classic，212）
加湿CO 2培养箱中（热科学，FORMA免缝-CYCLE，i790）
Vortexer （Fisherbrand ，Mini-E，货号：15212985）
台式微型离心机（StarLab ，目录号：SLN2631-0007）
移液器（品牌，Transferpette ，目录号：705891）
冷却托盘。膨胀的聚苯乙烯容器，带有融化的冰或预冷的金属珠（实验室装甲珠）

程序

该协议分为5个主要过程。首先，我们描述如何从猪眼球中切除角膜（A）。之后，我们解释如何获得脱细胞的床单（B）。第三，详细描述了制备富含细胞的胶原蛋白水凝胶的过程（C）。然后，我们概述了用去细胞片和水凝胶（D）组装构建体的过程。最后，描述了将上皮细胞添加至构建体的过程（E）。

从眼球切除角膜（整个过程如图1所示）
从本地来源获得眼球，然后放入密封的袋子中，用融化的冰冷藏，将其运送到实验室。请勿将其浸泡在PBS或类似物中运输。在24小时内使用。
检查是否有损坏的角膜并丢弃。对于未损坏的地球仪，请用剪刀除去所有残留的辅助组织，例如眼睑，肌肉和泪腺。
注意：浅表上皮缺损没有问题，但更深的基质异常是有问题的。如果基质不透明和/或角膜中有血管，则丢弃。

使用无菌技术在生物安全柜中执行所有其他操作步骤。
将眼球浸入用PBS以1：4稀释的聚维酮碘中浸泡4分钟，轻轻搅动容器。我们建议使用无菌尿杯。每只眼睛50毫升就足够了。溶液应在室温下使用。
用PBS清洗眼球3次，每次2分钟，并在以后的阶段保持湿润。我们建议使用无菌尿杯。每只眼睛50毫升就足够了。溶液应在室温下使用。
用蘸有70％无菌乙醇的无菌棉签轻轻擦拭眼睛表面，以促进上皮的去除。
使用镊子围绕眼球的圆周增加眼内压，并用圆形活检打孔器切开中央角膜。
用细镊子将切开的角膜微透镜保持在边缘，用PBS（5 ml无菌PBS）冲洗，然后转移到装有OCT基质的基础模具中。如果根尖表面朝下，则可获得最佳结果。
将组织学模具放在液氮上，不需要将其浸没。浮动是可以接受的。静置2分钟以确保完全冻结；透明的角膜微孔和OCT基质会变成白色。
将冷冻的微透镜转移到-80 ° C的冰箱中。使用前最多可存放12个月。

图1.切除角膜的主要步骤。A.从屠宰场收到的眼睛（步骤A1）。B.去除周围组织并用聚维酮碘冲洗（步骤A2-A5）后，眼睛。C.用镊子握住眼睛以增加眼内压（步骤A7）。D.使用活检打孔器去除角膜（步骤A7）。E.在PBS中短暂洗涤之后，在浸入OCT中并冷冻保存之前，角膜微透镜（步骤A8）。

获取去细胞的组织片
将带有微透镜，24孔板和切割刀片的基础模具放在低温恒温器内，以使温度平衡至少30分钟。
将一些新鲜的OCT基质放在低温恒温器样品卡盘上，然后将样品冷冻在其上。
将切片的厚度设置为60 µm。
切掉部分，丢弃通常不会全尺寸的第一个部分。收集每张纸，每张收集到24孔板的每个孔中。一个角膜将提供大约10个切片。
笔记：

较厚的床单更易于操作，但装满细胞的速度较慢。在临床环境中，可以改变角膜片的数量和厚度以适合要修复的角膜缺损的整个厚度。
拾起角膜片或去除溶液时，应小心操作，以免损坏或将其吸到移液器吸头中。我们不建议使用真空抽吸器，因为抽吸纸张的可能性很高。处理时，用细镊子抓紧纸边。最好配合使用，将两把镊子放在薄片的相对边缘上。L形刮铲可用于轻轻地抬起床单的边缘，或与一组镊子一起帮助抬起整个床单结构。我们不建议将切片合并在一起，并在50 ml管中进行脱细胞，因为这些板会粘在一起。
用Parafilm密封板后，可将其在-20 °C以下的温度下最多保存3个月。
在无菌条件下，向每个孔中加入2 ml无菌PBS。轻轻摇动板，以促进OCT基质融化到PBS中。5分钟后，用移液器移出溶液。
向每个孔中加入1 ml脱细胞溶液。在室温下以50 rpm的速度放在定轨振荡器上放置24 h。
注意：此处，脱细胞是使用两种去污剂SDS和Triton X-100进行的。其他脱细胞方法也是可用的（Fernández- Pérez和Ahearne ，2020年）。

除去去细胞溶液，然后加入DNase和RNase溶液，每孔再加1 ml。将板放在轨道振动器上1小时，但这次在37 ° C的烤箱中。板会变成白色。
除去DNase和RNase溶液，每孔加1 ml补充有抗菌剂的PBS 。在室温下放置在轨道振动器上24小时。
除去抗菌剂，然后每孔加入1毫升无菌去离子水。放置至少1小时以去除盐分。继续处理，或用Parafilm密封板，并在4 ° C下冷藏2周。
小心地取出每张纸，将其举到特氟龙光盘上。当从水中移出床单时，它们经常会卷曲。用弯曲的细镊子弄平所有卷曲的薄片。
将未覆盖的床单在生物安全柜中晾干至少1小时。
小心地撕下每张纸，弯曲铁氟龙盘以减轻它们的分离。将床单收集在5毫升的试管中。床单很轻，请注意不要被生物安全柜的气流拉走。通过这种方式干燥，可以在使用前将纸页在密封管中保存6个月。干燥的脱细胞薄片可以在图2A中看到。

注意：在此过程中，OCT基质，基础模具，液氮和低温恒温器刀片不是无菌的，我们在脱细胞后和在培养基中均使用抗微生物剂以避免污染。另外，我们期望飞秒激光可用于切割新鲜组织，并避免使用OCT基质以及此片材制造阶段的任何微生物污染。另外，如果需要成形片来改变折射特性，则激光也可以提供合适的微透镜。

准备胶原蛋白水凝胶
准备一个装有冰或珠子的冷却托盘。
在无菌条件下预冷所有溶液和移液器吸头，并保持凉爽，直到组装完成。
计算所需的最终体积，并吸取相应量的大鼠尾部胶原蛋白溶液，使其足以在2 ml试管中获得3.5 mg / ml的最终浓度。允许120微升每5片材的总构造。
加入最终所需体积的10 × PBS的5％。
使用涡旋仪混合，溶液将变为黄色（酸性）。
加入1 M NaOH ，以所用大鼠尾胶原溶液的体积计算× 0.023。
使用vortexer混合。该解决方案现在应该有一个红色的颜色。胶原溶液批次的变化可能意味着它们需要进一步调节NaOH浓度才能达到中性。
添加无菌去离子H ^ 2 O.
使用涡旋仪混合，并使用台式微型离心机短暂旋转。

笔记：

始终缓慢吸出和分配溶液。用容积式移液管等分大鼠尾部胶原。快速移液产生的气泡会降低层的内聚力。
水凝胶制备的计算示例，体积为1 ml（按此顺序添加）：
计算所需的胶原蛋白储备量，如下所示：最终体积×最终浓度/储备液浓度。例如，如果储备胶原蛋白为9 mg / ml，则在制备1 ml溶液（3.5 mg / ml × 1,000 µl / 9 mg / ml）时应使用388.9 µl 。
50微升10 × PBS
8.94 µl 1M NaOH 。该体积的计算方法是将所用胶原蛋白的原始体积乘以0.023（在本示例中为388.9 µl × 0.023 = 8.94 µl）。
502.16微升无菌去离子ħ 2 O.这是通过减去所有用来将终体积[1000微升- （388.90微升+ 50微升+ 8.89微升+ 50微升）= 502.16微升]体积计算
调整细胞密度，使50 µl 10 × PBS中的细胞数量为10 × 10 6 。这是相当高的细胞密度，因此请小心移液。
一旦其他一切准备就绪，请执行细胞胰蛋白酶消化和细胞悬浮液调节，以免细胞长时间处于低温状态。只要胶原蛋白溶液在冰上，它就不会凝胶化4小时。避免将细胞长时间放置在10 × PBS中，否则它们可能会遭受渗透性休克。

除了大鼠尾巴以外的胶原蛋白来源也可能适用，但尚未通过我们的协议进行测试。ECM来源的水凝胶可以提供更模拟物的环境中，因为它们含有比I型胶原蛋白等细胞外基质成分，并且可以从猪角膜（获得Ahearne和证券，2015;芬ández -Pe解析度和Ahearne ，2019一）。

组装与角膜基质细胞组织构建胶原凝胶（该过程示于图小号2B-2E）
使用胰蛋白酶消化和洗涤的标准程序收获角膜基质细胞。
计数细胞，并在10 × PBS中将细胞密度调整为200 × 10 6个细胞/ ml 。将细胞悬浮液添加到胶原蛋白混合物中。细胞悬液的体积将为溶液总体积的5％。使用移液器轻轻混合，但要彻底混合，以确保细胞分布均匀。
将无菌聚四氟乙烯盘放在培养皿中，然后将一张干纸放在上面。用30 µl无菌去离子水润湿第一张纸，然后用移液管将多余的纸除去。
将25微升细胞胶原水凝胶滴加到片的中心。
小心地将第二张干纸放在第一张上。第二层将吸收许多细胞-胶原水凝胶混合物。在第二张纸上再添加25 µl细胞胶原水凝胶，然后再次用另一张胶原纸覆盖。重复该过程，直到有五张脱细胞的薄片和四层细胞胶原水凝胶混合物。
盖上培养皿盖并在37°C下孵育30分钟，以使胶原蛋白凝胶化。
向预热至37°C的12孔板的每个孔中添加2-3 ml基质细胞培养基（配方5）。
将Teflon光盘与结构一起提起，然后将其小心地浸入平板孔中。然后用细镊子将特氟隆盘取下。构造通常会立即从椎间盘上脱落，但是如果这种情况没有发生，则可以使用L形扁平刮铲来辅助其释放。否则，纸张应该在第二天就已经取下，否则将需要丢弃。可以将构建体移至24孔板中。
为促进角化细胞表型，应使用无血清的角化细胞培养基（方案6）。每周刷新媒体三次。

图2.协议概述。A.干燥的脱细胞猪角膜片显示出良好的光学性能。B.角膜片和水凝胶组装后立即构建。C.胶凝过程后的构造物（注意颜色略微变浅）。D.结构具有良好的光学性能。E.在组织培养中构建。

添加上皮细胞层
在添加上皮细胞之前，让培养物培养2周，以使角膜基质细胞建立并稳定片层。
使用标准胰蛋白酶消化方案收获上皮细胞，并将细胞密度调节至3.33 × 10 6细胞/ ml，以获得每个构建体50,000个细胞的最终接种密度。
从孔中取出培养基，并小心吸取15 µl充分混合的上皮细胞悬液至构建体表面。孵育30-45分钟以允许细胞附着。
细胞附着后，加入1 ml的角质形成细胞培养基。培养1周，每2天更换一次媒体。

菜谱

脱细胞溶液
向100毫升去离子水中添加500毫克SDS和1毫升Triton X-100。

为了帮助绘制粘性的Triton X-100，请先从移液器吸头上切下末端。调匀上的搅拌板，在室温下，然后通过灭菌0.2微米过滤器在生物安全柜中。通常可以在室温下保存6个月，但是如果有沉淀物，请丢弃。

MgCl 2缓冲液
通过向100 ml去离子水中添加203.3 mg MgCl 2来制备缓冲液
通过小心地添加1 M NaOH使pH值达到7.5
室温下可保存一年。每次使用前检查pH值，并过滤灭菌所需量。
DNase和RNase解决方案
在无菌条件下，用去离子水制备400 U / ml DNase，5 mM CaCl 2和900 U / ml RNase的储备溶液。
分成1毫升等分试样，对于DNase，在-20 ° C下最多可保存12个月，对于RNase，可保存6个月。
为了制备脱细胞溶液，在使用前，加入250 μ升DNase和110 μ升RNA酶库存至10ml的MgCl 2缓冲液中得到10U / ml的每种核酸酶的终浓度。
10 ×含酚红的PBS
注意：此溶液仅用于制备水凝胶，并可以监控溶液的pH值。

向100 ml的10 × PBS中添加15.9 mg酚红钠盐
层流罩内的无菌过滤器
在室温下稳定一年
基质细胞培养基
培养基由补充有10％v / v FBS和100 U / ml青霉素/链霉素的DMEM低葡萄糖组成。

角质细胞培养基
DMEM-F12（1：1）补充了1 × ITS和100 µg / ml抗坏血酸和100 U / ml青霉素/链霉素。

致谢

导致这些结果的研究已获得欧盟研究计划（Horizon 2020 Research and Innovation Program，Horizon 2020 Research and Innovation Program ）资助的欧洲研究委员会（ERC ）和爱尔兰科学基金会（15 / ERC / 3269）的资助。

此处描述的协议已在出版物中使用：Fernández- Pérez等。（2020年）。

使用BioRender.com创建的图形摘要。

利益争夺

作者说没有侵犯他的权益。

伦理

死后提供猪眼球作为食物供应的副产品。经过捐献者家庭的适当研究同意，人体细胞来自角膜移植术后残留的组织，该角膜是通过都柏林爱尔兰输血服务处的眼组织库进行的。都柏林三一学院的医学院研究伦理委员会批准了使用人体组织获得细胞的伦理学批准。

参考

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