材料和试剂

1.5 ml Eppendorf管（上虞市伊特塑胶有限公司，目录号：MCTB015或类似产品）
15毫升管
手术刀和scalpellum（青岛中兰国际贸易有限公司，目录号：SS-002021或类似产品）
圆形（9×1.5 cm）和方形（56 × 35 × 30 cm ）培养皿（上虞市伊特塑胶有限公司，目录号：PD0009或类似的产品;海门莱伯瑞克实验仪器制造有限公司，目录号：LB077或类似的）
一次性组织研磨塑料杵1.5毫升管中（Corning，爱思进® ，目录号：PES-15-B-SI，或类似的）
接种环（Renon实验室实验有限公司，目录号；52150000或类似产品）
胶带（3M Micropore TM ，1530C-0或类似的胶带）
拟南芥种子
Murashige和Skoog基础盐混合物（MS）（Sigma-Aldrich，目录号：M5524）
胰蛋白（（西格玛（Sigma），目录号：T7293）
酵母提取物（西格玛，目录号：Y1625）
NaCl（Sangon Biotech，目录编号：A501218）
NaOH或KOH（Sangon Biotech，目录号：A100583和A610441）
琼脂（西格玛（Sigma），目录号：L2897）
琼脂糖（Sigma，目录号：A9539）
RedSafe TM核酸染色溶液（Invitrogen，目录号：S33102）
2K加梯（Transgenbiotech，Trans2K ®加DNA标记，目录号：BM121）
二次蒸馏灭菌H 2 O
100％乙醇（Sangon Biotech，目录号：A500737）
漂白剂（商业5％NaClO用水以1：5稀释）
DNA提取试剂盒（Qiagen DNA Blood＆Tissue，Qiagen，货号：69504或类似产品）
用于PCR主混合物溶液（Transgenbiotech，2 × EasyTaq ® PCR超混合液，AS111-01）
菌ERIC ˚F ingerprinting和的16S rRNA PCR扩增引物：
埃里克（5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'）

27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）

1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）

设备

不锈钢长柄镊子（Labdirect，目录号：SA-Q2090或类似产品）
分析天平（Sartorius，Practum224-1S或类似产品）
机械移液器（Eppendorf Research Plus，P1000，P100和P10或类似产品）
台式涡旋混合器（DragonLab MX-S或类似产品）
台式离心机（Eppendorf，带有A-4-62型转子的离心机5810R或类似产品;最高4,000 rpm / 3,220 × g ）
净化台（BCM-1000A生物净化台，Airtech或类似产品）
摇床培养箱（Eppendorf，New Brunswick TM I26可堆叠培养箱摇床或类似设备）
滚动培养箱（麒麟贝尔实验室仪器有限公司，麒麟贝尔QB-128或类似产品）
高压釜
巴斯德烤箱
植物生长室（Percival CU36L5或类似的植物）或生长室。
文化烤箱（上海景洪DHG-9038A或类似产品）
电泳设备（Bio-Rad，PowerPac TM基本电源+宽子微型子电池GT电池或类似设备）
凝胶成像系统（Bio-Rad，ChemiDoc XRS + TM凝胶成像系统或类似产品）
热循环仪（Bio-Rad，T100热循环仪或类似产品）

程序

以巨大芽孢杆菌YC4-R4为例的细菌培养
1.从LB-琼脂平板上的甘油储备液中刷新YC4-R4，并在37°C下孵育24 h * / **。

2.取一个菌落接种5 ml LB培养基（体外）（建议使用15 ml管）。在振荡器（220 rpm，37°C）中孵育过夜。对于土壤接种，每升新鲜培养物中应使用1 ml预培养物来扩大规模（最终量取决于土壤的初始水分和盆栽量）*。

3.通过将4.5 g /升ddH 2 O混合，制备0.45％NaCl溶液。在121°C下高压灭菌20分钟。使用前冷却至室温。

4.将培养物以3,220 × g离心10分钟。将沉淀重悬于相同体积的0.45％NaCl中。OD 600 〜0.8-1.1（数生长期;通常，等于10 6 -10 8 CFU / ml）的建议。

ñ OTES：

*此步骤应在无菌条件下进行。
**对于使用抗生素抗性菌株的测试，可以使用适当的抗生素制备LB平板。

准备细菌生长培养基
1.每升ddH 2 O混合10 g胰蛋白p，5 g酵母提取物和10 g NaCl 。

2.为了制作LB琼脂平板，每升添加15 g琼脂。

3.在121°C下高压灭菌20分钟。对于LB琼脂板，将液体培养基倒入培养皿中，使其冷却并固化。

准备植物生长培养基
1.将MS粉末分别以每升ddH 2 O的一半强度（2.21 g）和琼脂（分别根据测试要求，分别为圆形和方形平板分别为0.7％和1％）混合。

2.用NaOH或KOH将pH调节至5.7。

3.在121°C下高压灭菌20分钟。将培养基倒入培养皿中，使其冷却并固化。

种子灭菌和植物生长条件
将种子与无水乙醇在1.5 ml试管中混合，并保持搅拌1分钟。对于100颗种子，建议使用1毫升乙醇。
丢弃乙醇，并添加20％的漂白剂溶液（来自商业漂白剂库存）。对于100粒种子，建议使用1毫升20％漂白剂溶液。在转盘中搅拌10-15分钟。
丢弃漂白剂，并在无菌工作台中用无菌ddH 2 O洗涤3次。
借助移液器吸头*将种子逐一种植在MS培养基上。
在4℃下将种子分层48小时。分层后，在以下条件下将板垂直放置在生长室中14天：22°C；光照12小时/黑暗12小时周期；相对湿度40％；以及高达155 µmol·m -2 s -1的光强度。
注意：*此步骤应在无菌条件下进行。

体外定植试验
在无菌条件下，放置15〜20 14 -天之后萌发在½MS 1％琼脂（在平方培养皿）每个副本在1.5ml无菌管中生长（DAG）秧苗（无菌管的体积取决于植物的大小）。在0.45％NaCl溶液中加入1 ml细菌。
将管在摇床上（220 rpm，26°C *）孵育过夜。
丢弃细菌溶液。将幼苗放在无菌表面上，例如无菌铝箔或纸或培养皿中。用无菌剃刀刀片切开根部，并将其保存在1.5 ml的试管中。
加入1 ml的75％乙醇对根部表面进行消毒，并持续搅拌（转盘或类似装置）处理7-10分钟。
丢弃乙醇，并用无菌ddH 2 O清洗根部3次。
丢弃ddH 2 O，并用无菌雌蕊研磨根部（用于1.5 ml管）。
向试管中加入1 ml的0.45％NaCl，涡旋匀浆，并准备连续稀释液（通常5倍10倍稀释液就足够了）。
一滴一滴板（10滴10μl的AP的p ROX。多达100微升的总体积）在LB琼脂平板上的各稀释，让它们干燥为2分钟，并培育在30℃下** 24小时（图1）。

图1.在四分之一生长板中逐滴接种系列稀释液的实例。将液滴小心地放置在干燥的生长培养基板上，以避免干扰。

保持并以最大速度离心原始溶液。沉淀完根屑后，弃去上清液，并在60°C的烤箱中完全干燥48小时，并使用巴斯德烤箱将该重量记录为干重（DW）。
计算细菌菌落数，并考虑稀释度和接种量，计算菌落形成单位（CFU）。用根DW归一化CFU值以获得定植率。定植率=（CFUs ×稀释倍数）/根DW的mg。
ñ OTES：

所有工作应在无菌条件下进行。
*此温度已经过测试，可确保植物无压力条件；同时，还应考虑在相同温度下细菌的生长，以避免对细菌施加压力。
**本文使用的温度对于示例细菌的菌落计数是最佳的。强烈建议针对不同菌株优化温度，以避免菌落过度/重叠。

测定土壤中植物的定植率
1.如上所述生长拟南芥幼苗。

2.根据所需条件准备土壤。在我们的测试中，土壤是通过将1：石与土壤基质的1：3（v：v）混合物混合而制成的。为了最大程度地减少土壤中不需要的微生物，需要对土壤进行定级化处理（75°C持续3小时+冷却间隔10小时+ 75°C持续3小时）。将5株DAG幼苗转移到土壤中。

3.在0.45％NaCl溶液中接种细菌。作为参考，在普通的0.4 L锅中，在种植的幼苗周围接种50 ml细菌溶液。

4.使植物在所需测试要求的条件下生长（例如，有或没有某些非生物胁迫）。

5.在需要定植定量时，收获根（通常为20-40 mg根）。要进行根部收获，请使用镊子手动剥离每个根部周围的土壤，然后使用软组织剥离最小且粘附最紧密的土壤。必须通过3 × ddH 2 O洗涤*清除细小的土壤颗粒。根部清洁后，按照指示进行消毒，研磨，准备稀释液并计算E部分中的CFU。

注意：*此步骤应在无菌条件下进行。

菌株隔离和鉴定
1.尽管土壤已被封土，但通常F部分将产生除接种菌株以外的一小部分细菌。要确认已接种菌株的身份并计算其在总细菌种群中的比例，请首先按形态对细菌菌落进行分类（使用https://microbeonline.com/colony-morphology-bacteria-describe-bacterial-colonies/，参考），然后使用无菌牙签挑出形态相似的单个菌落，并将其转移至液体LB培养基中进行培养。通常，应随机取样20-30个菌落，以免产生偏差（图2）。

图2.在常规的根定殖量化过程中具有不同形态的菌落的示例。通过菌落的颜色，大小或亮度选择不同的形态。箭头的颜色表示预应变株：根据以下标准：红色–强烈的黄色；蓝色–白色，大号；橙色–白色，体积小；和绿色–米色，表面无光泽。

2.在摇床上（220 rpm，30°C）在5 ml液体LB中培养各个菌落24 h。

3.离心培养物（建议在台式离心机中进行：3,220 × g ，10分钟），弃去上清液，并通过高效方法从沉淀物中提取DNA。在这里，建议使用DNA提取试剂盒（请参见方法）。

4.用27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）（或同等物）扩增16S rRNA基因并测序，然后对其进行BLAST鉴定，以鉴定分离的物种。

5.为了进一步区分已接种菌株与相同物种的其他菌株，请使用ERIC引物（5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'）进行PCR，以为每个菌株生成指纹表型。使用测试中使用的储备菌株作为参考。在2％的琼脂糖凝胶中运行样品以最大程度地分离谱带。使用GelJ将模式与参考进行比较，并获得相似性指标。图3包括代表性的凝胶图像输出。

图3.具有代表性的ERIC-PCR凝胶图像输出的实施例（从V改性í lchez等人，2020）。MWM：分子量标记；从接种土壤的根中回收1-4株。伊诺克菌株：最初是土壤接种的菌株。

数据分析

每种测试均应按照上述指示的条件（体外或在土壤中）进行至少三个重复。根据学生的t检验，当P值˂0.05时，结果将被认为具有统计学差异。相对定植率的计算公式为：RC =（菌落数×稀释倍数）/根DW的mg。

笔记

如果将此方法应用于其他植物物种，则按配方缩放以适合植物大小。对于研磨样品，建议使用1.5 ml试管和配套的雌蕊。自动研磨可以在低振动频率下进行。在使用机械破坏设备（例如TissueLyser）的情况下，请使用低频率的破坏，以避免可能引起细菌膜破坏的过热和机械应力。高频机械破坏可用于从土壤，污泥或其他复杂样品中提取总DNA。积极的研磨/粉碎方法增加了在细菌菌株的最终计数和鉴定中引入偏差的可能性。
基于乙醇的灭菌过程已在拟南芥和番茄作为参照植物的根中进行了测试。在拟南芥中（图4），将7-10分钟（较长和较粗的根大约需要5分钟，如在番茄中）被认为是最佳的根部表面消毒时间（这些测试是用Gram +细菌进行的；考虑到较短的消毒时间）。公克-）。较长的孵育时间可能会干扰定殖细菌的定量。

图4.乙醇处理后的拟南芥根中的菌落数。在用乙醇处理后，最后洗涤溶液中的菌落形成单位（CFU）计数（蓝色柱）和相应的根定殖计数（红色柱）。X轴表示乙醇处理时间。n ＝ 3，数据表示为平均值±SE。

但是，应该注意的是，该设置是针对拟南芥植物的。灭菌时间取决于所测试的植物和细菌种群的类型，因此强烈建议根据实际实验设置优化灭菌时间。

致谢

HZ实验室的研究得到了中国科学院（CAS）的支持。联谊会得到了CAS院长的国际研究金计划奖学金的支持。我们感谢PSC的Rosa Lozano-Duran教授和匿名审阅者对协议的严格阅读。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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