材料和试剂

1. 15 ml，50 ml螺帽管（SARSTEDT，目录号：62.554.502 ；62.547.254）

2. 1.5毫升，2毫升反应管（SARSTEDT，目录号：72.706 ；72.695.500）

3. 20微升，200微升，1 ，000微升移液管尖端（SARSTEDT，产品目录号：70.1116 ; 70.760.002 ; 70.762）

4. 5毫升，10毫升，25毫升血清移液管（SARSTEDT，目录号：86.1253.001 ; 86.1254.001 ; 86.1685.001）

5. 50毫升Leucosep TM管小号（格雷纳生物一个GmbH的，目录号：227290）

6.包含XF24传感器盒，XF24细胞培养微孔板和XF校准溶液的Seahorse XF24 FluxPak（Agilent Technologies，目录号：100850-001）

7.人静脉血，EDTA抗凝- S-Monovette ® 7.5毫升K3E（SARSTEDT，目录号：01.1605.001）

8. Ficoll-Paque TM PLUS（GE Healthcare，目录号：17-1440-03）

9.聚-D-赖氨酸溶液，1.0 mg / ml（默克密理博，目录号：A-003-E，储存温度-20°C）

10.台盼蓝溶液0.4％（Sigma-Aldrich，目录号：93595）

11. Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM），高葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D7777，储存温度4°C）

12.二甲基亚砜È （DMSO）（卡尔罗斯，目录号：A994）

13.从寡霉素链霉omyces diastatochromogenes （Sigma-Aldrich公司，目录号：O4876，储存温度-20℃;异构体A，B，和C的混合物。），2.5mM的在DMSO中

14.羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯hydr （FCCP; Sigma-Aldrich，目录号：C2920，存储温度4°C），在DMSO中为2.5 mM

15.鱼藤酮（Sigma-Aldrich，目录号：R8875），在DMSO中为2.5 mM

16.来自链霉菌属的抗霉素A。（Sigma-Aldrich，目录号：A8674，储存温度-20°C），在DMSO中为2.5 mM

17. NaCl（C arl Roth，目录号：3957）

18. NaOH（C arl Roth，目录号：6771）

19. KCl（卡尔·罗斯，目录号：6781）

20. Na 2 HPO 4 ·12H 2 O（卡尔·罗斯，目录号：N350）

21. KH 2 PO 4 （Carl Roth，目录号：3904）

22. 1 × PBS（请参阅食谱）

23. 0.9％NaCl溶液（请参阅食谱）

24. 10 M NaOH溶液（请参阅配方）

25.聚-D-赖氨酸工作溶液（50 µg / ml）（请参见食谱）

26. 2.5 mM寡霉素溶液（请参阅食谱）

27. 2.5 mM FCCP解决方案（请参阅食谱）

28. 0.1 M鱼藤酮溶液（请参阅食谱）

29. 2.5 mM鱼藤酮溶液（请参阅食谱）

30. 2.5 mM抗霉素A溶液（请参阅食谱）

31.分析介质（请参见食谱）

设备

移液器：的Eppendorf研究®加10微升，20微升，200微升，1000微升仪（Eppendorf，产品目录号：3123000020 ; 3123000039 ; 3123000055 ; 3123000063）
移液辅助工具：PipetBoy acu 2（Integra Biosciences，目录号：155 000）
改进Neubauer计数室（Carl Roth，目录号：PC72.1）
倒置显微镜：Primovert（Carl Zeiss，目录号：415510-1100-000）
水浴（GFL，目录号：1003）
不带CO 2的培养箱（GFL，目录号：4010）
摆出转子离心机：5804 R（Eppendorf，产品目录编号：5805000010; 5804709004）
水净化系统：ELGA ® PURELAB挠曲3（威立雅，目录号：PF3XXXXM1）
pH计：FE20 FiveEasy TM （Mettler Toledo，目录号：30266626）
Seahorse XF24细胞外流量分析仪（Agilent Technologies，目录号：100737-100）

软件

波形控制器软件（安捷伦技术，版本1.8.1.1）
可选：Wave桌面软件（安捷伦科技公司）

程序

用于检测在使用XF分析器人PBMC线粒体功能的实验程序示意地示于˚F igure 2.这之后的各个工作步骤的详细描述。

图2.使用XF分析仪测量人PBMC中线粒体功能的工作流程图。

实验前一天
的水合XF24传感器盒（由盒盖，传感器盒本身和效用的板;参见˚F igure 3B和3C）：
将1 ml XF校准溶液添加到效用板的每个孔中。
用移液器吸头除去可能在传感器上产生的气泡。
将组装好的板在非CO 2 37°C的培养箱中孵育过夜。
交换机上的XF24分析仪（见˚F igure 3A）一个第二让它升温至37℃过夜。

图3. XF24分析仪（A）和XF24传感器盒（B和C）。从上方（B）和下方（C）显示了包括传感器标记的传感器盒。此外，注油口标有（B），并显示了效用板（C）。

在XF分析仪上编程测量协议：
平衡：30分钟
测量周期1：
混合：4分钟
等待：2分钟
测量：3分钟
3次重复

端口A的喷射（50微升的7.5μM寡霉素;终浓度0.75μM）
测量期2：
混合：4分钟
等待：2分钟
测量：3分钟
3次重复

端口B的注射（55微升的10μM FCCP ;终浓度1μM）
测量期3：
混合：4分钟
等待：2分钟
测量：3分钟
3次重复

端口C的注射（60微升的16.7μM鱼藤酮/抗霉素A;终浓度1.67μM）
测量周期4：
混合：4分钟
等待：2分钟
测量：3分钟
3次重复

实验日
XF24细胞培养微孔板的涂层：
向每个孔中加入30 µl的Poly-D-赖氨酸工作溶液（50 µg / ml），并将板在室温下孵育1小时。
弃去上清液，用300 µl ddH 2 O洗涤每孔，并在无菌条件下（约30分钟）将平板风干。
的PBMC的分离（继续与微孔板涂层在该步骤期间;见˚F igure 4 ）：
将15 ml的Ficoll-Paque TM P LUS（RT）加入50 ml的Leucosep TM试管中，并在室温以1,000 × g的浓度离心30 s。
用0.9％NaCl溶液（至少7.5 ml和最多15 ml）以1：2的比例稀释适当体积的抗凝人体血液。
将所得的体积（至少15 ml，至多30 ml）转移到准备好的Leucosep TM管中，并在不带制动器的摆出式转子中于室温以1,000 × g离心10分钟。
收获PBMC馏分，该血浆在Leucosep TM管的多孔屏障上方的血浆和Ficoll之间显示为白色层（有关详细信息，请参见制造商的说明或参阅Matt and Bergemann，（2019 ））。为此，请使用1,000 µl Eppendorf移液器，并将PBMC收集在50 ml螺帽管中。
用10 ml PBS洗涤细胞一次，并以250 × g离心10分钟。
重复洗涤步骤两次，每次5 ml PBS。
使用改进的Neubauer计数室确定细胞数。

图4.用Leucosep TM管分离PBMC 。在左侧，该试管的下方装有Ficoll-Paque TM ，而在多孔屏障上方则装有抗凝和稀释的血液。在右侧，密度梯度离心后，试管从上到下显示以下几层：血浆– PBMC – Ficoll-Paque TM –多孔屏障– Ficoll-Paque TM –红细胞和粒细胞。

使用前准备好测定介质并在37°C下预热。
播种的PBMC ONT ö预涂覆XF24细胞培养微板中：
注意：每种条件下建议使用4至5口井。A1，B4，C3和D6孔通常用作背景孔（无细胞）。一种示例性的板布局以及接种在聚d赖氨酸的PBMC的图像中示出˚F igure 5。

每孔取5 × 10 5分离的PBMC，并以250 × g离心5分钟。
每孔将细胞沉淀重悬于100 µl分析培养基中。
每孔添加100 µl细胞悬液。
用450 µl分析培养基填充背景孔。
在平开的转子中以250 × g的速度将板离心1分钟，并关闭制动器。
向装有细胞的孔中加入350 µl测定培养基（每孔的最终体积：450 µl）。
在无CO 2的情况下于37°C孵育平板直至测量（平均约1 h ）。

图5. XF24细胞培养微孔板的示例性板布局（左侧）和接种在Poly-D-赖氨酸涂层的XF24细胞培养微孔板（右侧）上的PBMC的明场显微镜图像。左侧：Ť他孔A1，B4，C3和D6被用作背景孔（无细胞）。一种颜色（浅绿色，深绿色，深橙色，浅橙色）分别代表一种状态。每个条件有5口井。右侧：图像以100 ×放大倍数显示PBMC 。

在XF24传感器盒中装入化合物：
制备化合物如下：
稀4.86微升的2.5mM的寡霉素溶液在1615微升测定培养基（导致7.5μM）。
稀6.48微升的2.5mM的FCCP溶液在1614微升测定培养基（导致10μM）。
在1,598 µl分析培养基中稀释10.82 µl的2.5 mM鱼藤酮溶液和10.82 µl的2.5 mM抗霉素A溶液（每次结果16.7 µM）。
如下装入XF24传感器盒的进样口：
注意：避免在进样口中形成气泡，并在装入后小心操作XF24传感器盒，以防止化合物滴落。

填充所有端口A与50μl的7.5μM寡霉素。
用55微升填充所有端口乙的10μMFCCP。
填写所有端口下用60微升的16.7μM鱼藤酮/抗霉素A.
在XF分析仪中开始运行（按照软件说明进行操作）：
将XF24传感器盒（无盖）放入XF分析仪中，然后开始校准。
校准完成后，用XF24细胞培养微孔板替换效用板并开始测量。
将测量结果归一化为细胞数：
通过反复上下移液，将PBMC重悬在每个孔的最终体积（615 µl）中。
使用改进的Neubauer计数室确定每孔的细胞数。

数据分析

通过如图10所示，划分每孔的细胞的计数数目000，并且为了normali进入下“正常化”波浪软件结果泽的数据（见˚F igure 6）。

图6. Wave软件的屏幕截图，其中带有用于规范化和数据导出的标记。

根据比较一种情况的单井的OCR进程来定义异常值，并将其排除在分析之外。
注意：至少应使用三个重复进行分析。

结果导出到海马XF细胞美图压力测试报告生成器，它链接到浪潮软件（见˚F igure 6）。该软件工具会自动计算并报告参数，然后由Mito Stress Test进行分析。
从报告生成器中获取计算出的值，并使用适当的统计软件对其进行分析。

代表数据

使用XF分析仪和应力试剂寡，FCCP，抗霉素A的氧消耗率测量的典型结果和鱼藤酮（三刀应力测试）的所示˚F igure 7。

图7.用XF分析仪测量的PBMC的Mito压力测试的耗氧率（OCR）。描绘了两个不同主题的结果未归一化（A）和归一化（B）。

笔记

由于人体血液样本通常只能在每种情况下获得一次，因此建议对冷冻保存的标准PBMC样本进行测量。这可以用于其他标准化步骤。
所述的端口d XF24传感器盒没有在所描述的实验中使用并为此Ë所有端口d可以留空。在端口A，B和C中，必须填充所有24口井，以确保均匀注入化合物。

菜谱

1 × PBS
8克氯化钠

0.20克氯化钾

2.88 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O

1.24克KH 2 PO 4

ddH 2 O至1 L，pH 7.4

0 。9％NaCl溶液
9克氯化钠

ddH 2 O至1 L

10 M NaOH溶液
40克NaOH

ddH 2 O至100 ml

聚-D-赖氨酸工作溶液（50 µg / ml）
50 µl聚-D-赖氨酸溶液，1.0 mg / ml

950微升ddH 2 O

2.5 mM寡霉素溶液
5毫克寡霉素

2.528毫升DMSO

2.5 mM FCCP解决方案
10毫克FCCP

15.737毫升DMSO

0 。1 M鱼藤酮溶液
1克鱼藤酮

25.353毫升DMSO

2.5 mM鱼藤酮溶液
25微升的0.1M的鱼藤酮溶液

975微升DMSO

2.5 mM抗霉素A溶液
25毫克抗霉素A

18.529毫升DMSO

测定培养基
0.675克Dulbecco改良的Eagle's中高葡萄糖

ddH 2 O至50 ml，pH 7.4

致谢

这项工作是由巴登-符腾堡州科学，研究和艺术部通过“合作研究生院InViTe”资助的。我们要感谢med博士。Adrian Schulte和他在Überlingen-Hödingen的F. X. Mayr Bodensee中心的团队提供了血液样本。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

实验根据赫尔辛基宣言进行，并由德国LandesärztekammerBaden-Württemberg伦理委员会批准。此外，所有志愿者均被提前告知，并书面同意使用其血样。

参考

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