材料和试剂

秀丽隐杆线虫的维护
组织培养皿，35 × 10 mm（Corning，Falcon，货号：353001）
蠕虫镐（Genesee Scientific，目录号：59-30P16）
带挡板的微量移液器吸头（任何品牌，1 µl，20 µl和1,000 µl）
血清移液吸管，用于OP50接种的10 ml（Corning，Falcon，目录号：357551）
C. elegans Bristol N2 [秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC），https：//cgc.umn.edu（Stiernagle，2006年）]
大肠杆菌OP50株DA735 [秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC），https： //cgc.umn.edu ]
水，分子生物学等级（GE Healthcare，HyClone，目录号：SH30538.02）
琼脂（RPI，目录号：A20020-5000）
酵母提取物（ThermoFisher Scientific，目录号：BP9727-2）
Bacto P蛋白one（BD，Bacto，目录号：211677）
氯化钠（Avantor Performance Materials，JT Baker，目录号：3624-05）
胆固醇（Sigma，目录号：1580-01）
乙醇200证明（Decon Labs，目录号：2716）
Trizma-Cl（罗氏（Roche），目录号：10812846001）
Trizma-OH（罗氏（Roche），目录号：10708976001）
Luria-Bertani肉汤，细菌培养基（KD medical，目录号：BLC-5020）
M9缓冲器（IPM Scientific USA，目录号：11006-517）
盐酸左旋咪唑（Sigma，目录号：196142）

高压冷冻和冷冻替代
玻璃显微镜载玻片（ThermoFisher Scientific，目录号：10144633B）
1.5毫升试管，用于BSA溶液等分试样（ThermoFisher Scientific，目录号：05-408-129）
具有阻隔微量提示（任何品牌，1微升，20微升和1 ，000微升）
微管TTE提示而不阻挡仪（Eppendorf，1微升，目录号：30072.014）
纤维素毛细管（徕卡，目录号：16706869）
21针（G）x 1针½英寸（Covidien Monoject，目录号：305167）
一次性注射器（VWR，EMS，目录号：2.5毫升为72508或5毫升为72509）
酒精拭子（BD医疗，目录号：326895）
A型镀金铜制手推车（Leica，目录号：16770152）
B型镀金铜制手推车（Leica，目录号：16770153）
黑色低温标记（ThermoFisher Scientific，Nalgene，目录号：22-026-700）
样品架药筒系统，D3 mm半圆筒（Leica，货号：771849）
样品架药筒系统，D3毫米中间板（Leica，货号：771813）
Nalgene冷冻管（ThermoFisher Scientific，目录号：5000-1012）
50毫升聚丙烯管（BD Falcon，目录号：352098）
细绳或细绳（VWR，细绳，货号：30-33113）
一次性醋酸纤维素过滤器，网目尺寸为0.22 µm，直径25 mm（Millipore，Cameo针筒式过滤器，目录号：1213657）
250毫升锥形玻璃烧瓶（VWR，Pyrex，目录号：4444-250）
巴斯德移液器，硼硅酸盐玻璃，5毫升（ThermoFisher Scientific，目录号：13-678-20A）
塑料巴斯德吸管，2 ml和7 ml（Globe Scientific，目录号：137040和134090）
血清移液器，硼硅酸盐玻璃杯，1毫升（VWR，目录号：93000-682）
塑料杯（用于称量树脂）（VWR，Therapak，目录号：74850）
Beem胶囊（Ted Pella，目录号：69910-01）
Beem胶囊固定器（Ted Pella，目录号：132-B）
双刃碳钢刀片（Ted Pella，羽毛，目录号：121-9）
Kimwipes 05517（ThermoFisher Scientific，Kimberly-Clark Kimtech Science精密湿巾，目录号：06-677-72）
发泡胶容器或托盘（例如，运输容器的盖子，通常15 × 20厘米，深2厘米）
用于处理os的一次性聚丙烯刮刀（VWR，目录号：80081-194）
牛血清白蛋白（BSA），热激分数（Sigma，目录号：A3294）
指甲油（任何颜色）
四氧化锇（OSO 4 ）颗粒剂（EMS，Ç atalog号码：19134）
丙酮（赛默飞世科学，Ç atalog号：9011）
乙酸双氧铀（EMS，Ç atalog号码：22400）
甲醇（得自Mallinckrodt，Ç atalog号：3016）
聚/床812嵌入试剂盒用DMP-30（自Polysciences，Ç atalog号：08 792和08791 ）
干冰（内部供应）
双去离子水（内部供应）
干式液氮（LN 2 ）（内部供应）
十二碳烯基琥珀酸酐（DDSA）（Polysciences，目录号：08792，试剂盒与35相同）
纳迪克（NMA ）（Polysciences，目录号：08792，试剂盒与35相同）
改良的Youngren's，只有BACTO-蛋白p（MYOB）板用于蠕虫维护（请参阅食谱）
胆固醇储备溶液（请参阅食谱）
大肠杆菌OP50库存（请参阅食谱）
纤维素毛细管附件（请参阅食谱）
20％BSA解决方案（请参阅食谱）
25 mM Levamisole解决方案（请参阅食谱）
快速冻结替代（QFS）鸡尾酒（请参阅食谱）
聚/ B ed 812树脂混合物（请参阅配方）

设备

微量移液器（任何品牌，容量分别为1 µl，20 µl和1,000 µl）
尖头镊子（EMS，Dumont，目录号：78320-51T，72919-0A和78340-51S）（图1a-1c）
用PVC绝缘的镊子（EMS，Dumont，目录号：3C-linox-E）（图1d）
用PVC绝缘的长钳（Leica，VOMM，目录号：22SAESD）（图1e）
压线钳，解剖刀＃20（Bard-Parker，目录号：371620）（图1f）

图1.样品处理工具。交流用于样品处理尖锐点镊子（第甲小号TEP š 4-5）。德绝缘镊子冷冻样本恢复和传递（部分B小号TEP小号4-9，和C部分小号TEP小号6-7 ）。F。压接工具：＃20手术刀通过在金属表面上轻轻摩擦刀片来手动钝化（McDonald等，2010）。

顶板centrifu GE仪（Eppendorf，型号：5424或类似的）
带磨砂玻璃台架的底部照明立体显微镜（Leica ，型号：SM2745或类似产品）
徕卡高压冷冻机，超低温配备有体视显微镜和漏斗填充LN 2 （莱卡，米Odel等：ICE）
冷冻样品回收冷冻箱（不锈钢托盘，深），带有冷冻样品释放站和3毫米冲头，杆和塞子（奥地利莱卡； EM ICE高压冷冻机包装）
迷你台式轨道振动器（VWR，目录号：97109-890）
大型表面滑动加热器（高级，目录号：XH-2002）
红外测温仪（通用工具和仪器，目录号：IRT207）
分析天平（Sartorious Ç ORP，米Odel等：BCE64-15）
搅拌板（Corning ，目录号：PC420D或类似产品）
连接到机械泵标准干燥器（特德佩拉，米Odel等：VRD4）
带12毫米孔的金属块（ThermoFisher Scientific，目录号：88880152）
干冰桶，多个（VWR，Scienceware Magic Touch 2带盖，货号：M16807-2001）
本生灯
化学安全罩
实验室计时器
化学规模（梅特勒，米Odel等：AE240）
温度控制烘箱（昆西实验室，米Odel等：20GC）
标准高压釜
吹风机（任何带热风风扇的品牌）
大型LN 2杜瓦瓶样品存储（泰勒-沃顿，目录号：HC34）
25升滚动底座上的便携式LN 2杜瓦瓶（沃辛顿，目录号：LD25）
P ortable LN 2杜瓦瓶，4 L（沃辛顿，目录号：LD4）
用于处理LN 2 （任何品牌）的PPE（实验室外套，面罩和耐寒手套）
外科口罩（船上卫生，货号：28806；或任何品牌）

程序

秀丽隐杆线虫的单个胚胎的高压冷冻（HPF）
通过将20-30饥饿L1开始蠕虫培养幼虫上的新MYOB琼脂平板种子ED与大肠杆菌OP50细菌（见ř ecipe小号）。每隔第四天早上将2-3只成虫转移到一个新的MYOB盘中以保持蠕虫的生长（Stiernagle，2006年）。
在进行HPF实验前72小时，将5-6例怀孕的成年人转移到几个新的MYOB平板中（至少3个单独的平板以确保有足够的年轻成年人）。
在HPF实验的早晨，取出的20％w / v的BSA溶液两等份（500微升各）从4℃和自旋在94 ×g下（〜1000转）为5分钟在台式离心机以除去气泡。保持在室温下。
在解剖镜旁边放置3-4对干净的尖头镊子（图1a和1b），在Leica ICE高压冷冻机旁边放置1-2对（图1c）。镊子1a和1b适用于纤维素管的转移，而镊子1c适用于木板的转移。它是有旁镊子（图2个酒精棉临界一个）：除非你清理它们频繁，镊子变粘用20％BSA溶液，转移期间导致样品损失。
代替一个微量（1微升）设定为0.8微升和另一微量（20微升）定为12微升旁边醇拭子，镊子，卷边工具（白色箭头），和蠕虫拾取（黄色箭头），如图2一个。设置蠕虫解剖工具（带有21G针头的注射器，图2b ）。将多个纤维素管连接到移液器吸头上（图2c ，紫色箭头和插图）。保留一根专用于毛细管处理的微量移液器（1 µl）（图2c ）。
取出35毫米9-10片状物（A型和B型分别）P ETRI菜（图2 Ç ）中，用黑色标记标记A型腔，将其从B型后区分。
注：Ť YPE阿片状物具有在一个面上的单个300μm的深腔，而另一面是平坦的; 样品将在后面B型扶乩（的浅腔被放置小号TEP甲14 ）。

图2. HPF之前的蠕虫解剖设置。一种。微量移液器（1 µl和20 µl），尖头镊子，酒精拭子，压接工具（白色箭头）和蠕虫镐（黄色箭头）。b。蠕虫解剖工具–在2.5 ml注射器上使用一对21G针头，用作剪刀来剪断蠕虫。C。专用的微量移液器（1 µl），用于处理与移液器吸头相连的纤维素毛细管（紫色箭头和d）。币坯类型A和类型B被放置在单独的塑料P ETRI菜肴。d。甲纤维素毛细管附件（见ř ecipe 4）胚胎和/或蠕虫集合。

检查液氮（LN 2 ）运输杜瓦小号，以确保它们是空的和干燥。用LN 2填充一个大杜瓦瓶（25 L）和两个中等杜瓦瓶（4 L）。
打开Leica ICE高压冷冻机（图3a），等待听到压缩机打开（由嗡嗡声和轻微的振动确定），这也应反映在监视器状态屏幕中。装载站（图3b）应清洁干燥。用25 L杜瓦瓶中的LN 2向冷冻室（图3c）缓慢填充，并进行多次短暂的停顿，以避免触发警报和错误指示储罐已满。在冷却水箱的过程中，大量的LN 2蒸发。
注意：您可能需要第二人的帮助才能安全地倒入〜18升LN 2 。

组装HPF样品存储杜瓦瓶（图s 3d- 3 f）。请注意，杜瓦瓶中的三分容器可以在三个杯子中的每个杯子中最多容纳三个滤芯系统，这相当于在样品存储杜瓦瓶装满之前最多可以进行9次HPF“注入”。高压冰柜需要约20分钟才能达到LN 2温度。一旦平衡，填充HPF样本存储杜瓦（图3F）与LN 2和插入件插入徕卡ICE冷冻室（图3g，在装载站下方˚F igure 3A）。您必须等到冷冻室准备就绪为止，否则容器将收集并冻结空气中形成冰晶的冷凝物。与其他冷冻实验一样，在此过程中必须避免结冰或结霜。因此，请保持干燥条件，并迅速进行工作，以最大程度地减少样品和工具在潮湿环境中的暴露。
组装（图在Leica ICE高压冷冻装载站的两半塑料适配器小号3H- 3在图3b中j和箭头）。将带有小孔的刮板支架（图3i）放在底部钢表面上的塑料适配器顶部（图3b，黄色箭头）。手动关闭红色盖子（图3b），以确保冷冻机正常工作（图5），以运行空白的HPF循环。

图3.为HPF设置Leica EM ICE。一种。徕卡EM ICE高压冷冻机。b。装货站，从3a中的方框区域放大。箭头显示了每次HPF运行时放置板托的位置，顶部有一个半圆柱体（白色箭头和3h），在带有另一个孔的板托（3i）之上，另一个半圆柱体位于底部黑色钢制半块（黄色）上。箭头和3j）。C。LN 2加气口在灰色门后（黑色长箭头）。df。HPF样品存储杜瓦瓶的组装，包括三分体荚（3d）和分段插件（3e中的灰色圆柱体）。3e中的插图显示了组装后的俯视图；b箭头，“刺刀”或释放按钮和黄色箭头，锁定/打开位置。卡口被按压并旋转计数器-clockwise或顺时针以打开或锁定分别（左插图-刺刀一吨打开位置和右插图-刺刀在接近的位置）。G。收集支架单元在自动撤回冷冻室单元之前已插入容器中，在3a中的装载工位下方显示为黑色边框。带有“ in>”标签的凹口（插图3e ，黄色环）应面向HPF仪器固定装置。hj。徕卡墨盒系统包含两个相同的半圆筒和一个带有孔的平板支架。

用蠕虫采摘收集3-4个年轻的成年蠕虫，并将其滴入（12 µl）20％BSA溶液中，放在干净的载玻片上。用两根针作为剪子（图4a）将蠕虫切开（在身体的中部）以释放胚胎（McDonald，1999； Muller-Reichert等，2007 ；McDonald等，201 0 ）。
注意：如果收集到完整的蠕虫，请使用含25 mM左旋咪唑的20％BSA溶液并孵育2-3分钟以麻醉蠕虫。可以将蠕虫单独吸收到毛细血管中，如下所示。

目视扫描胚胎，以找到处于胚胎发育所需阶段的胚胎，并牢记导致HPF的步骤大约需要2分钟。避免在解剖范围内长时间观察，因为少量20％BSA溶液会因蒸发而迅速变干。
收集期望的级的胚胎，放置一个纤维素毛细管的开口端，安装于移液管尖端（图4b ，卡通）接近胚胎。由于毛细作用，胚胎将进入毛细管，因此无需将其移液（图4c，卡通）。
使用压接工具，以在毛细管轻轻按下，（否则会切开胚胎就会飘走）上被困胚胎两侧密封毛细管（参见图4c，卡通）。我们Ë相同的工具来与被困胚胎的部分（图4c，插图）从解剖蠕虫中分离掉。请记住，该部分的长度应保持在2 mm左右或以下（图4c，插图），以使其适合B型平舱的空腔（Muller-Reichert等，2008）。按照胚胎发育的胚胎被困的下一个解剖范围。
在所需的胚胎发育阶段前约1分钟，将0.8 µl的20％BSA溶液添加到100 µm的B型小板腔中（图4d）。必须将刮板填充到顶部，以免产生气泡，但不能过度填充，以防止过多的液体芯吸到装载区域。柔和的正弯月面通常就足够了。用尖头镊子将带有胚胎的毛细管部分（图4c，插图）转移到装有20％BSA溶液的B型小板中（为便于观察，图4d中显示了带有完整蠕虫的毛细管部分）。将A型预检板（平侧）放在B型预检板的顶部（图4g）。
转移的扶乩小号andwitch与胚胎固定内部（图小号4E-G ），以的徕卡EM ICE装载站（图3d中，预组装cartridege系统;还参见˚F igure小号4H-ⅰ）。手动关闭红色翼片（图4J）将启动冷冻过程，其中所述盒系统内固定的胚胎被冷却到LN 2项在几十毫秒内和之下的约2高的压力下，000巴（参照图5）。

图4. HPF的样品制备。交流在20％的BSA溶液中解剖幼虫。在每个图像上方的卡通图中描绘了步骤。将选择的胚胎收集到纤维素毛细管中，并用压接工具（c，插图）捕获。d。Planchette，在20％BSA溶液的纤维素毛细管内部充满整个蠕虫，并充满顶部。例如。上的锐点镊子，其用于将毛细管片（C传输，插图），以所述B型扶乩空腔，用于放置的A型扶乩（平坦侧）之上的B型扶乩。hj。将刨板三明治（g，右）牢固地放置在支架中（h，橙色箭头）。中号全线关闭红色盖（j）的装载站信息将样本投入到LN 2未DER高压。

图5.高压冷冻循环的温度和压力图。x轴是时间（以毫秒（ms）为单位），y轴是压力（以巴为单位，红色）或温度以开尔文（K）为单位，蓝色。仅出于说明目的，这是从高压冷冻机一次运行的可接受执行的屏幕截图，在样品冷却以18163 K / s的速率（dT / dt）开始时，压力读数为2237 bar。使用缩小按钮（右下角）压力，可以获得长达600毫秒的温度状态（请参见插图）。有关详细信息，请参阅Muller-Reichert等。（2007年和2008年）。

重复小号TEPS一个10一个15 ，直到你冷冻样品的必要数量。在Leica ICE高压冷冻机中，单个样品存储杜瓦瓶的最大容量为9个样品，但是通常在实验开始时执行空白HPF运行，最多可容纳8个样品。需要注意的是它可以将样品收集切换到新的和干燥的支架（图3D），以收集另一组向上的九个样品。其他高压冷冻机没有9个样品的限制。
高压冷冻样品可以在LN 2下保存多年。要长期保存样品，请转到协议B。要进行冷冻替代，请直接转到协议C，而跳过协议B。

从HPF机中回收冷冻样品
要存储冷冻样品，请用一把锋利的迷你螺丝刀的热端在侧壁上打孔，准备一个50毫升的聚丙烯管（将尖端短暂地放在本生灯上加热）。该孔可防止压力升高，并在意外变暖的情况下防止爆炸的危险。将长（约3英尺）长的绳子牢固地固定在盖子上（图6），并贴上胶带标签，以便将装有冷冻样品的试管从大型LN 2储罐中拉出。

图6.储存管的准备。如在部分B所述制备的50ml蓝帽管小号：TEP 1.插图甲管和磁带标签到串上N实施例的标签。

通过在其侧壁上打孔准备多个1 ml冷冻管（类似于S tep B 1）。该孔可防止管道中的压力积聚。用铅笔在每个冷冻管上标记日期，实验编号和样品编号。铅笔标记是丙酮和帮助稳定防止混合-起来之后。
使用吹风机将样品卸载腔室和附件单元中的水分完全清除（图7a）。用LN 2缓慢填充腔室，然后等待直到没有气泡为止，即LN 2表面是平静的。保持有机玻璃盖处于关闭状态，以最大程度地减少冰或霜的污染。
将所有镊子和其他配件放在温度为45°C的隔间附近的滑动加热装置中，并保持电吹风机的插入状态，以备再次使用时使用。快速并交替使用镊子，将镊子放在滑动加热器上，以防止冰晶沉积到样品卸载室中。
注意：戴外科口罩可减少充满LN 2的腔室中的凝结和雾气。

从Leica ICE高压冰箱中取出杜瓦瓶样品。将分割插入物和连接的三等分荚（图7c）转移到冷冻箱中的指定插槽（图7a，左侧），并通过按压和扭转“刺刀”来释放包含切板组件的三等分荚（图s 7c- 7d ）。 ”，或从分段插入件上的锁定到打开位置释放按钮（图7c ，蓝色箭头）。
将干燥的绝缘镊子（图1d）浸入LN 2中，使其远离样品约20 s，以将其冷却至LN 2温度。手表中的气泡，并等到了嘶嘶声停止小号。
一次从样品架中取出一个塑料适配器（图7e），仅在支架上留有冷冻的小刀。Q uickly保持器与冷冻片状物传送（在LN保持浸没2所有的时间）到所述样品释放站（图小号7E -7F ，右侧）。
用释放手柄（图7a，白色箭头），将冷冻的小刀从刀柄中冲出到容器中（图7g，黄色箭头）。在不传送/释放样品时，保持有机玻璃盖处于关闭状态，以最大程度地减少冰污染。
将预先标记的冷冻管放入冷冻箱中，并冷却至LN 2温度几分钟。我们ë干镊子（图1D）至TR ansfer冷冻币坯成各自的冷冻管（在LN保持浸没2的所有时间）。用您的手掌预热每个冷冻管帽，然后迅速合上。如果瓶盖不保暖且无水分，则它将冻结在试管中，并且几乎不可能在不预热整个试管的情况下重新打开试管，从而损坏冷冻样品。

图7.高压冷冻后的样品回收率。为了清楚起见，所有照片均在没有LN 2的情况下拍摄。一种。样品回收冷冻箱显示了一个用于样品架的托盘（左）和一个带有释放手柄的样品释放站（白色箭头），右侧是收集容器。bd。ICE高压冰箱的样品架将红色转移到样品回收冷冻箱中。逆时针旋转bayon等（c，蓝色箭头）可将样品收集容器单元从气瓶中释放出来。例如。一次将一个样品架转移到释放站。冷冻的小球被收集到水库中（g，橙色箭头）。

最终检查：检查是否有裂开的小方舟，如果发现，请收集没有黑点的小方舟。用作封面的A型预检器（平底）上标有黑点，并且由于冷冻胚胎在未标记的B型预检器的腔内，因此很容易在LN 2下识别并丢弃。
将所有冷冻管收集到预先贴有标签的50 ml聚丙烯管中（在便携式杜瓦瓶中在LN 2中进行预冷），用盖子盖上盖子，并在外面看到带标签的细绳（请参见图6），然后将其放入LN 2储罐中。样品可以适当地保存多年。

冷冻替代HPF胚胎用于电子显微镜
注意：此过程总共需要3-4天，由于孵育时间长，第一天可能需要8小时以上。确认您有足够的干冰和LN 2供应。试剂必须是新鲜准备的，因此请相应地计划您的一天。使用滑动加热器和吹风机使所有乐器保持无水分！

1.按照配方7 （Rahman等人，2020年）准备QFS鸡尾酒，并在预先标记的冷冻瓶中各装1毫升等分液（按样品编号标记，每小瓶一个冷冻样品）。

2.将一个带有12毫米孔的金属块朝上放在干冰桶中。填充LN 2并冷却至LN 2温度。经常添加LN 2以保持该块被淹没。在桶上盖上盖子，以防止结露。桶必须放置在化学通风橱中，随后的步骤会在通风橱中进行，因为是有毒且易挥发的。

3.通过将试管放入浸没在LN 2中的金属块中来冷冻QFS混合物。不要添加过多的LN 2 ，否则管子会从块中浮出。

4.从LN 2储罐中收集样品冷冻管（HPF胚胎或蠕虫）到装有LN 2的杜瓦瓶中（图8a，蓝色箭头）。

图8. QFS的样本传输。一种。冷冻样品在LN 2杜瓦瓶中转移（底部，蓝色箭头）。QFS鸡尾酒浸入LN 2的干冰桶中（左上方，黄色箭头）。b。将装有冷冻QFS鸡尾酒冷冻管（左上）和HPF样本冷冻管（右上）的浅聚苯乙烯泡沫塑料容器平放在LN 2中。一次打开一个试管，打开冷冻管（右上），将冷冻的小球倒入浅聚苯乙烯泡沫塑料容器中的LN 2中，然后转移到与i n S放在同一平面上的冷冻管中的冷冻QFS混合物中（左上）。TEP小号C5到C7用镊子。C。将QFS管横向放置在干冰上（在预冷的金属块中）。d 。桶中装满了更多的干冰，盖上盖子，然后放在轨道振动器上（McDonald和Webb，2011年）。

5.取一个干净干燥的浅泡沫聚苯乙烯泡沫塑料容器或托盘。通常15 × 20厘米深2厘米的运输容器盖就足够了。在托盘上添加LN 2并使其冷却，然后再进行后续步骤。

6.一次取出一根冷冻管。打开冷冻管的盖子，并迅速将小瓶平放在装有LN 2的聚苯乙烯泡沫塑料浅容器中，并从LN 2下方的小漏斗中倒出。在它旁边，也要打开瓶盖并在LN 2中放平并放置一个冷冻的装有QFS的样品瓶。将该样品瓶的瓶盖保持在您的手掌或滑动加热器中，以免结露，否则会结冰并被卡住。

7.用尖锐的镊子将装有冷冻QFS鸡尾酒的小瓶转移到每个小瓶中。快速站起冷冻管（将大部分样品瓶浸入LN 2中），然后将保暖帽拧到试管上。立即将其转移到在LN浸没金属块2 （小号TEP Ç 2 ）。如果可以轻松识别样品，则可以在单个QFS鸡尾酒管中放置多个小菜刀，但是我们警告说，小菜刀在QFS期间会相互碰撞并移走大样品。

8.经常检查并添加LN 2，以使金属块始终浸没在水中。将盖子放在顶部，以尽可能防止空气中的水分凝结。

9.重复小号TEPS Ç 4到C 7的未直到把所有样品含有币坯被转移到单独标记含有QFS-冷冻管。我们建议一次不要尝试超过八支试管。

10.小心倾倒LN 2，并在干冰桶的一半处注满冰块。旋转金属块，这样冷冻管现在可以平放在一边。加入更多干冰以完全覆盖金属块，并用盖子盖住桶。将其放在化学安全罩内以60个循环/分钟的速度放置的轨道振动器上放置3小时（McDonald和Webb，2011年）。

11. 3小时后丢弃干冰。放回盖子，并继续以60转/分钟的速度旋转一个小时。

12.取下盖子，并继续以60转/分钟的速度摇动另外一个小时（或根据需要），直到金属块达到约4°C的温度为止。经常用红外测温仪检查温度。这是关键的一步！在4°C或更高的温度下长时间暴露可能会使整个体积显着变暗，从而难以识别毛细管内的单个胚胎。

13.用100％丙酮（储存在4°C下）代替QFS混合物。首先，用玻璃移液器小心地移出QFS鸡尾酒（注意不要让Planchette受到干扰）。使用新鲜的移液器，将溶液（100％丙酮）释放到冷冻管的侧壁上，轻轻地重新注满。每次孵育1小时后，用以下混合物替换溶液（使用定为60个循环/分钟的定轨振荡器）。

1：2树脂：丙酮
1：1树脂：丙酮
2：1树脂：丙酮
根据机构生物危害处置程序，丢弃过程中使用的所有移液器，用过的和未使用的试剂，纸巾和Kimwipes。

14.将浮游植物转移到100％的树脂中，并在室温下在设定为60个循环/分钟的定轨振荡器上放置过夜（14h至16h）。

15.第二天早晨，用新鲜准备的100％树脂代替隔夜树脂，然后立即进行下一步。

16.用剃刀刀片切开Beem胶囊的底部；打开胶囊的盖子并弯曲铰链，使盖子平放在表面上。将刮板样品一面朝上，并在Beem胶囊盖的内部放几滴树脂。小心地将胶囊封闭在盖子上，使切板样品的一面朝上。带有切口孔的胶囊底部应朝上。通过此开口用100％树脂填充胶囊（请参见图s 9a- 9 i），然后将其烘烤以在75°C的烤箱中固化60 h至65 h。

17.一旦固化，用剃刀切断塑料光束胶囊（参见图小号9j- 9米）。现在，在解剖范围内，小心地去除金属平板周围的所有树脂。重要提示：请确保完全除去侧面的所有树脂-切板侧面的发亮金属应完全暴露（请参见图s 9o -9 p）。现在，快速将Planchette的裸露金属基底浸入LN 2中，直至达到低温，然后用吹风机加热，直到所有冷凝物消失并且Planchette变热。根据需要多次重复冷/热循环，直到由于金属和树脂之间的热膨胀差异而导致切板或金属载体弹出并掉落。这将使树脂包埋的样品完好无损（图9r）。不要用武力松撬扶乩，因为这种风险小号压裂树脂而使树脂包埋样品仍处于腔。在切片进行成像（TEM或vEM）切片之前，您可以在室温下在防尘存储容器中放置有或没有附有刮板的树脂嵌入样品多年。

注意：此处描述的QFS协议足以用于我们手中的FIB-SEM成像和阵列层析成像。对于常规的TEM成像，可以将样品切开并通常进行后染色以增强对比度（Hayat，2000）。对于其他体积EM方法，例如串行块面SEM，用户可能希望通过适应室温整块染色规程（Hayat和Giaquinta，1970; Hua et al。，2015）来进一步增强样品的金属化能力，以进行高分辨率工作。。

图9.树脂嵌入和样品处理。交流用剃刀刀片切开Beem胶囊的底部。德弯曲铰链，使盖子平放在表面上。放置扶乩（从QFS小号TEP Ç 15 ）样品的一面朝上，并添加树脂几滴用巴斯德吸管。fg。小心地完全合上盖子上的胶囊，保持平板的样品面朝上。你好。用100％树脂填充Beem胶囊，然后转移到烤箱中（请参阅S Cep C 16）进行固化。固化后，将染色的样品是在所述胶囊（9底部Ĵ ，后视图）。K-米。使用剃须刀卸下Beem胶囊。np。ü的nDer解剖范围使用小心除去树脂剃刀刀片以暴露扶乩。q。一旦扶乩暴露多次，沉浸在它LN 2 ，接着加热以一个吹风机，直到金属载体弹出。河去除木板或金属载体后，将暴露的样品包埋在100％的树脂中。

笔记

使用液氮可能存在危险。必须使用适当的个人防护设备（PPE）保护您的眼睛，面部和裸露的皮肤。另请参阅您所在机构的安全程序。

s是重金属，如果吸入会危害健康。你必须戴上口罩，并准备将在连接到排气系统的化学罩冷冻替代鸡尾酒组合。

菜谱

改良的Youngren's，仅BACTO-蛋白p（MYOB）板用于蠕虫维护
Bacto琼脂20克

氯化钠（NaCl ）2克

盐酸Trizma 0.55克

Trizma-OH 0.24克

Bacto P蛋白one 3.1克

去离子水至1升

高压灭菌20分钟（液体循环），使其冷却
甲DD1.6毫升胆固醇从库存soluti上（见下文）
中号有磁力搅拌器之前彻底IX至倒入35mm组织培养皿中，大约每盘5 ml（约每升200个板）
琼脂平板凝固并干燥后，应用约200 µl大肠杆菌OP50培养物（见下文），在室温下静置两天，直到细菌溶液干燥并形成细菌草皮为止（Church等， 1995）
胆固醇储备液
胆固醇5毫克

乙醇（200标准）100毫升

使用小型磁力搅拌棒溶解胆固醇（慢速约2小时）

大肠杆菌OP50库存
从冷冻原液中，在琼脂平板上划线细菌（不使用任何抗生素），并在37°C下孵育过夜（〜14-16 h）。将少量分离的菌落接种到100 ml LB培养基（不含任何抗生素）中，并在37°C孵育6-7小时，不要摇晃。种子MYOB板用200μl的培养（Stiernagle，2006）。适当处置未使用的细菌培养物。

纤维素毛细管附着
参见图10

图10.用于样品收集的纤维素毛细管附件。用锋利的剪刀将纤维素毛细管切成约4厘米的碎片。下一个解剖范围，推动或拉动穿过1个微升移液管尖端（无毛细一个屏障），直到毛细管的边缘接近尖的边缘。适用指甲油粘上毛细管的移液管尖端的前端，并允许它在室温下为一小时干燥（穆勒-赖克特等人，2003）。确保毛细管的另一端打开。如果不是，请用锋利的剪刀（s箭头）将其切开至边缘附近。

20％BSA解决方案
牛血清白蛋白10克

M9缓冲液至50毫升

准备在多个步骤中的溶液，即，各添E添加少量BSA的成35毫升的M9缓冲液（在50毫升蓝帽管）
中号轻轻IX上的桌子顶部轨道摇床在低速，以避免产生气泡
一旦BSA完全溶解，使其体积达到50 ml 。轻轻混合至均质，并以小等分试样在4 ° C或-20 ° C下保存（长期保存），最多可保存一年
25 mM左旋咪唑溶液
在10 ml的20％BSA溶液中添加0.051 g左旋咪唑
在台式轨道振动器上低速缓慢混合，以免产生气泡
注：钍é解决方案可用于高达两到三个月。

快速冻结替代（QFS）鸡尾酒
注意：必须准备一个化学防护罩。使用硼硅酸盐玻璃移液器测量丙酮和甲醇。请跟随机构人处理锇和铀化合物化学品安全管理条例。这些都是剧毒的。安全至上。

OsO4颗粒0.1克

丙酮13.5毫升

在室温下搅拌至完全混合约10-15分钟。一旦看不到残留物，则从新打开的小瓶中添加：

0.75毫升甲醇中的2％乙酸铀酰（UA）

蒸馏去离子水（DD2）0.75毫升

在室温下完全混合并通过0.22 μ醋酸米纤维素过滤器，以除去任何残留的未溶解的元素。甲liquot1毫升成单独的冷冻管中，在LN闪光冷冻2和储存在- 80℃ （拉赫曼。等人，2020）

聚/ B ed 812树脂混合物
聚/ B ed 812 14.6克

十二烯基琥珀酸酐（DDSA ）8.4克

纳迪克甲酸酐（NMA ）7.0克

DMP-30 0.42毫升

用磁力搅拌器轻轻混合直至均匀。从试剂盒中准备新鲜食物，其中包含上述所有化学物质（Rahman等，2020）

致谢

我们感谢希瑟·贝伦斯曼（Heather Berensmann）对手稿的认真阅读和摄影方面的帮助。

MM Rahman和O. Cohen-Fix得到了美国糖尿病与消化与肾脏病研究所的资助（校际资助DK069012）。IY Chang和K. Narayan得到了美国国家癌症研究所（合同号75N91019D00024 ）的支持。根据合同号75N91019D00024，该项目已全部或部分由美国国立卫生研究院国家癌症研究所的联邦资金资助。本出版物的内容不一定反映卫生和公共服务部的观点或政策，也没有提及商品名称，商业产品或组织，这暗示着美国政府的认可。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争性的经济利益。

伦理

危险化学品是根据机构设置人的指导方针。

参考

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