材料和试剂

1.果蝇小瓶（化学玻璃生命科学，目录号：CGE-4789-001）

2. Nunc公司TM 96孔聚苯乙烯圆底微孔板（赛默飞世科学，Ç atalog号：168136）

3. 5-米升微量离心管（托马斯科学，目录号：1149Y05）

4.薄壁玻璃毛细管（日本成茂，目录号：G-100）

5.羽毛边缘文件（Hardwick＆Sons，目录号：HWXH952X）

6.薄壁针18G × 1 1/2“（Terumo，目录号：NN-1838R）

7. 22G × 1 1/2“超薄壁针（Terumo，目录号：NN-2238R）

8.透明塑料片。

9. Muscimol（Sigma-Aldrich，目录号：M1523）

10.果蝇（Canton-S株）。蝇是从“京都畜牧中心”购买的

11.式4-24 ®即时果蝇培养基（卡罗琳生物供应公司，目录号：173120）

12.果蝇酵母活性剂（SciMart，目录号：DR-840-25LB ）

13. Agarose ME（和光，目录号：010-13975）

14.艳蓝FCF（TCI，目录号：B0790）

15. 100 mM麝香酚溶液（请参阅食谱）

16. 1 mg / m l亮蓝FCF（请参阅食谱）

17. 5 mM / 2.5 mM / 1 mM麝香酚溶液（请参阅食谱）

18. 1％的琼脂糖溶液（请参阅食谱）

设备

奥林巴斯SZ40显微镜
三脚架支架（科学设备，目录号：TSR13.00.1541）
iPad mini （苹果）
孵化器

软件

Exce l 2013 （Microsoft）
免费的秒表软件

程序

试剂的制备
准备麝香酚溶液
将麝香酚溶解在Milli-Q中以制备100 mM的储备溶液。
d ilute原液到所述目标浓度的5mM，2.5毫米，和1mM的使用Milli-Q水和1毫克/立方米升的亮蓝（工作浓度0.125毫克/立方米升）。
灿烂的蓝色用于监视消耗了麝香酚溶液的苍蝇（苍蝇的肚子变成蓝色）。对照蝇只被喂以Milli-Q水和亮蓝（0.125 mg / ml ）。
制备一个96孔琼脂平板
将0.5 g琼脂添加到50 ml H 2 O中以制备1％琼脂溶液。
用微波炉加热溶液，并在室温（RT）下放置，直到冷却到足以倒入250为止 μ升琼脂到每个孔中的96 -孔平板中。
在行为测试之前将板准备1小时，然后将板放置在室温下。
毛细管准备
用手锯将玻璃毛细管分成两部分（边缘锉）

5 ml管和塑料板的制备
使一个在一个的盖的中心孔5米升使用注射器针头（18G Eppendorf管× 1 1/2 “” ）。接下来，将装满麝香酚的玻璃毛细管中途插入盖子的孔中。使用22G × 1 1/2英寸的针在玻璃毛细管附近再开2个小孔，以利于空气流入管子（图1 A ）。
ü唱剪刀，切割片（8.0厘米× 7.0厘米，从薄的，柔软的塑料文件夹），并用它来覆盖96孔板，以防止苍蝇飞走，因为它们被放置在板（图1乙）。该塑料片是可重复使用的。

图1. 5 ml管和塑料板的实验装置。A.孔在5米制成升使用注射器针管。B.准备一块透明的塑料片（8.0厘米× 7.0厘米）。

行为分析
在二氧化碳麻醉下收集约50只雄性和50只雌性一天大的苍蝇（Canton-S），并将它们放入培养瓶中进行单独检测。养4天苍蝇在培养箱中，12小时：12小时白天：夜循环（在07:00和关灯19:00），在25 ° C和40 - 60％的湿度。ç ommercially可用果蝇的食物建议在此阶段的试验。
谨慎注意：Ť他的行为测试，需要恒定的温度，湿度和光飞饲养孵化器内。此外，重要的是在行为分析过程中保持安静的环境，包括恒定的光照，温度，湿度和一天中的时间。

在实验的当天，分离35 - 40雄性蝇（5用二氧化碳麻醉来自雌性的天龄）在显微镜下和离开他们在饥饿新鲜空小瓶9 - 10 H在培养箱中。雄性果蝇被确定观察下的生殖器官一个显微镜。
后10小时，饥饿的苍蝇都准备好了行为分析。保持在冰飞小瓶申请冷诱导麻醉，并且移动从蝇小瓶5只苍蝇每个5米升使用寒意单元管，它由一个的黄色尖端盒盖填充有冰和覆盖有一个凸玻璃板。冷却装置用于促进果蝇从一个位置移动到另一位置，并应保持干燥。冰用于麻醉以避免行为分析中CO 2的潜在影响。从冰瓶中取出小瓶后，请在1到2分钟内用刷子转移果蝇，因为在此期间果蝇的行为将恢复正常。恒定室温（25 ° C）和湿度（40 - 60％），应严格保持，直到行为人实验。
警示说明：继饥饿，我们使用d冷麻醉，从一个腔室转移苍蝇另一个。在将蝇从培养瓶转移到5 ml管中时，必须用纸巾擦拭玻璃板，以保持冷冻装置干燥。同样，在从5米移动苍蝇当升管到96孔板中，所述冷却单元应保持干燥。

用目标浓度的麝香酚溶液填充90％的玻璃毛细管（Narishige，G-100薄壁玻璃毛细管），并在溶液水平标记毛细管壁。插入玻璃毛细管中途穿过中心孔在盖5米的升含有管的苍蝇。的恰好存在5苍蝇在每5 -米升管允许每个飞消耗相同剂量的目标溶液，这允许š待行为测定进行5次，单一浓度的蝇蕈醇溶液。
允许苍蝇喝的蝇蕈醇（5毫摩尔，2.5毫摩尔，或1mM）或对照溶液（亮蓝含有-Milli-Q水）20 - 30分钟。具体的玻璃毛细管来的蝇蕈醇溶液不同剂量输送到特定组的苍蝇（5只苍蝇在5米升管）。当苍蝇消耗目标溶液时，由于存在亮蓝，其胃会变成蓝色。因此，可以确认果蝇消耗目标溶液。
取下玻璃毛细管，并使用游标卡尺根据毛细管标记来测量果蝇消耗的目标溶液的总量（μl ）。立即麻醉在5-m的苍蝇升通过保持管在冰管几分钟。ü小号Ë冷硬单元仔细MOV È一个飞入每个孔的96孔板中如上所述制备。用镊子（适合握住苍蝇的软镊子）转移所有5只苍蝇后，用透明塑料板覆盖96孔板的孔，以防止它们飞走（图2）。

图2.在96孔板中进行行为分析。A.食用所需的目标溶液后，将果蝇转移到96孔板中。B.绘制一个96孔板以证明果蝇的位置和每次果蝇消耗的目标溶液d 。

将苍蝇放入96孔板后，让其从麻醉中恢复10分钟。放置在一张白纸的96孔板，设置了三脚架与良好视图的适当位置的96孔平板，并放在一个iPad在三角架上，以记录视频3分钟的顶部。
然后，将含有蝇的96孔板在-30 ° C下放置2小时，以使蝇安乐死。注意每个由消耗的目标溶液飞检查的存在亮蓝中的胃使用光学显微镜。排除没有喝任何苍蝇的的从目标解决方案的行为分析。由苍蝇消耗的目标溶液的平均量可以计算通过将总溶液由蝇的数目进气消耗的目标溶液（˚F LY行为可以变化基于量（μ升）喝）。
行为分析的整个过程如图3所示。视频1和视频2用于可视化试剂制备和行为分析。视频3用于显示使用iPad记录的飞行动作。

图3.实验程序概述。雄性苍蝇饥饿9 - 10小时，之后将它们小心地转移到5-m的升管下面通过冷却短暂麻醉。的蝇被允许饮料蝇蕈醇溶液中20 - 30分钟，之后将它们转移红到一个96孔板中用于记录荷兰国际集团的行为activit ý 3分钟。这个数字是从Karim等人修改而来的。（2018 ）。

视频1.试剂的制备。该视频显示了96孔琼脂平板和muscimol溶液的制备。详细的协议在过程A中进行了描述。

视频2.飞行行为分析。该视频详细显示了飞行行为分析的分步过程。该协议在过程C中进行了描述。

视频3.使用iPad录制的飞行动作。该视频显示了控制蝇的追踪运动以及不同浓度的麝香酚的作用。

数据分析

1.飞行行为被描述为“休息”，“修饰”和“行走”。“修饰”和“行走”在一起被认为是活跃状态。“正在静置”表示没有飞动。在我们的实验，苍蝇BEC一个我动不动时消耗立即高浓度的蝇蕈醇溶液（5毫摩尔），这可能影响特定的一组飞行神经元。

2.在我们的实验中，单个飞消耗ð的蝇蕈醇溶液的特定浓度，之后我们quantif组卷手动地从所记录的3分钟的视频其表型行为基于每个飞行所花费的时间“静止”或“美容+行走” （图4）。Google提供了免费的秒表软件，以帮助量化这些行为活动（https://free-stopwatch.com/）。

3.所有值均表示为平均值±SEM学生吨-test被用来评估活性和休息的表型之间的差异。

图4 。蝇蕈醇导致一剂量依赖性的木僵表型。以1 mM至5 mM的剂量喂食Milli-Q水或麝香酚。与对照蝇相比，高剂量的麝香酚会导致完全丧失运动能力，并表现出类似致病性的表型。

局限性

由于苍蝇的嗅觉系统是比较强的，它往往是难以麦é苍蝇喝感兴趣的目标解决方案。需要耐心才能从录制的视频中手动量化行为活动。对实验人员进行全面的培训，以最大程度地减少解释结果时的偏见。如果目标解决方案有影响，则应在飞行行为中清楚地反映出来。
飞行年龄，大小和性别是影响结果可重复性的重要因素。它可以测量，平均，多少目标解决方案由苍蝇的过程中被消耗的行为分析。然而，目标溶液的效果正比于其剂量和体积，和t他金额，必须由每个运行中消耗的目标溶液的是依赖于它的SI泽和模式。此外，升arger苍蝇通常小于活性小苍蝇。当饲养苍蝇在一个培养箱中4天，数小号雄性和雌性蝇应相当于，因为LO的存在WER女性或男性的数量饲养原因期间小号异常增加飞活性。

结论

我们报告了一种简单的果蝇行为分析，用于评估在标准实验室环境中麝香酚的影响。这种技术是有用的用于快速屏幕荷兰国际集团小分子，肽，和植物提取物小号体内使用蝇模型，观察这些化合物是否充当通过特定集合的神经元的。

菜谱

100 mM m uscimol溶液
1.14毫克麝香酚

添加100 μ升的Milli-Q的水

1 mg / m l亮蓝FCF
1毫克Brillia n t蓝色

添加1米升的Milli-Q的水

5 mM麝香酚溶液
2.5μ升蝇蕈醇的（库存100毫摩尔）

6.25 μ升亮蓝FCF（1股票的毫克/米升）

添加41.25 μ升的Milli-Q的水

1％琼脂糖溶液
0.5克琼脂糖

添加50米升的Milli-Q的水

致谢

我们要感谢Juhelee Naznin在录制视频方面的慷慨帮助。我们还要感谢Tanvir Rahman女士进行的视频编辑。这项研究得到了日本科学促进会（JSPS）奖学金（P15394）的支持。该协议是从以前的工作中采用的（Karim MR等人，2018）。

利益争夺

作者声明Ş没有利益冲突。

参考

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