材料和试剂

1. 100毫米TC-处理的培养盘（Corning公司，目录号：430167 ）和TTP 6 -孔板（西格玛，目录号：Z707759 ）

2. 8 -以及IbiTreatμ-幻灯片（ibidi ，目录号：80826）或8 -以及聚赖氨酸-涂覆的小号大环内酯类（ibidi ，目录号：80824）

3. 96孔透明底部白色微孔板（Grein er ，目录号：655098）

4. 1.5毫升和15 ml的吨ubes

5. C2C12米乌斯成肌细胞系（ATCC，目录号：CRL-1772）

6. AIMTOR质粒DNA T757（Addgene公司ID 140828）和非phosphoryla TA竹叶提取A757突变体（Addgene公司ID 140829），储存在-20℃下

7. Dulbecco改良的Eagle的培养基（Sigma，目录号：D5796 - 500 ml的），存储吨4℃

8. Dulbecco氏改良的Eagle的培养基（Gibco，不含酚红，谷氨酰胺和葡萄糖A1443001-500毫升），贮存于4℃下

9.葡萄糖20％（1 。11 M），过滤器ED和灭菌储存在4℃。葡萄糖20％被用于补充酚红-FR EE和不含葡萄糖的DME中号用25mM葡萄糖。

10.胎牛血清（Dominique Dutscher，目录号：S1810-500），储存在-20°C

11.谷氨酰胺的200mM（Sigma，目录号：G7513 - 100 ml的），储存在-20℃下

12.娜p yruvate 100mM的（Sigma，目录号：S8636 - 100 ml的），保存于4℃下

13.抗生素p enicillin一个d小号treptomycin ，10 ，000 û /毫升（Sigma，目录号：P4333），储存在-20℃下

14. HEPES缓冲液（1 M），过滤并灭菌（Sigma，目录号：H3662），储存在4°C下

15. PBS（西格玛，目录号：D8537-500 ml），在室温下保存

16.胰蛋白酶/ EDTA（Sigma，目录号：T4049-100ml），在4°C下储存

17. Furimazine（Promega，Promega，纳米-Glo荧光素酶测定，目录号：N1120），在-20°C下储存

18. JETPEI（Polyplus T ransfection R eagent，货号：101-10N ），在4°C下储存

19. Helix-IN DNA转染试剂（OZBiosciences，目录号：HX10100 ，在-20°C储存）或任何可有效转染您感兴趣的细胞而不影响细胞表型和活力的试剂

20. DMEM常规生长培养基（包含酚红）（请参阅食谱）

21. DMEM生长培养基和读取培养基（请参见食谱）

设备

微管
多管移液器（10-200 µl ）和/或带500 µl -10 µl吸头的移液器（Eppendorff）
水-夹套CO 2培养箱
II级生物安全柜
托马斯计数室或其他细胞计数装置
离心机（SIGMA，型号：3-16KL）与转子（SIGMA ，目录号：11222），其适于6 -孔板（用于JETPEI转染）
用于BRET人口测量
协同TM 2 BioTek微孔板阅读器（或等同酶标仪）使460nm附近的生物发光滤发射光的灵敏度的测定（Ë的任务峰Ñ anoluciferase诱导˚F urimazine）和530纳米（Ë YPET的任务峰）
发射滤光片：485/20 nm（Biotek，目录号：7082221）和530/25 nm（Biotek，目录号：7082223）
标配Gen5 TM阅读器控制和数据分析软件编程的读板儿并产生原始数据文件（在Excel中的Microsoft Office TM ）
用于BRET成像
带有滑动陷阱的自制暗盒（图1A）
具有Metamorph软件的计算机（图1B）
从倒置荧光显微镜（Carl Zeiss，Axiovert 200M）定制的生物发光专用显微镜设备（Coulon等人，200 8 ； Perroy，2010）（图1C）。请注意，由于NanoLuc的强亮度，现在可以使用经典的倒置显微镜（Kim和Grailhe ，2016年）
配备有EMCCD检测器，背照式且具有片上乘法增益（光度法）的Evolve相机（图1D）
多位置平台控制（Marzhauser Wetzlar，Tango 2 Desktop，目录号：00-76-150-1802）（图1E）
光源：Lumencor（Gataca，Spectra X光引擎）（图1F）
Plan-Neofluar 40 × / 1 。3油镜M27 （卡尔·蔡司）
发射滤光片：450/70 nm（Semrock，目录号：FF01-450 / 70-25）和HQ535 / 50nm（Chroma，目录号：63944）

图1.显微镜BRET成像设置。A.暗盒。B.计算机。C.显微镜。D.相机。E.多工位控制。F.光源。

软件

用于Biotek微孔板读取器的Gen5 TM读取器控制和数据分析软件
变形图像采集软件（分子设备）
斐济（Schindelin et al。，2012）
BRET分析仪FIJI插件（Chastagnier等，2018）https://github.com/ychastagnier/BRET-Analyzer
Graphpad Prism 7软件（GraphPad Software Inc.）

程序

C2C12细胞系的维护和播种
维持培养d C2在100个C12细胞毫米培养板在37 ℃的培养箱中5％CO 2和分裂细胞汇合时达到上课80 - 90％。使用红色定期含苯酚培养基（见ř ecipes部分）。
两到3天前BRET测量，胰蛋白酶化，根据收集和种子细胞的板，用于垫（见是低）。通常情况下，150 × 10 3个细胞/孔在6 -调度在白色96之前孔板-在细胞群孔板BRET S，和10 × 10 3到15 × 10 4中的用于BRET成像IbiTreatμ-滑动。

C2C12转染
对于细胞群中的BRET ，我们常规用JETPEI转染，但可以使用任何其他有效方法。
天1，种子150 × 10 3个细胞/孔在6 -孔板中。
第2天，以下量和卷给出转染一个孔中的6 -井板：在1.5米升微量离心管中一个：混合50用100 AIMTOR DNA的纳克微升无菌的NaCl （150mM的）。使用非编码质粒（pBluescript或其他）将DNA量标准化为1 µg。
在1.5 -米升微量离心管B，结合4微升的J ETPEI转染试剂（4微升的DNA /微克）用100微升无菌的NaCl （150mM的）。涡流的管为10秒。
添加JETPEI试剂混合物在微量离心管中乙滴在以微量甲（含有该DNA混合物）。涡流的管为1 0秒和短暂离心。
在室温下孵育20分钟。
将合并的JETPEI-DNA混合物的内容滴加到孔中。
离心6 -孔板为5分钟，在280 ×克。
在37°C的5％CO 2中孵育细胞24小时。
第三天
W¯¯灰每孔用1 ml的PBS。
甲DD 300微升胰蛋白酶/ EDTA。
我ncubat E（5）-在37℃下10分钟。
甲DD1米升的完全培养基无酚红。
ř esuspend细胞与一个1 -毫升微量并收集它们在15 -毫升管。
Ç entrifuge细胞为5分钟（500 ×克）。
甲spirate上清，重悬细胞在2.5ml培养基中的
d ispatch细胞在一个96 -孔平板：100微升/孔，一式三份孔×的每次转染条件的数量。
我ncubate为24 -在进行到板BRET读数之前48小时。
对于单-细胞BRET成像经由显微镜
注意：瓦特E使用HelixIN转染方案，但是可以使用任何其他有效的转染协议。

第1天：种子10 × 10 3到15 × 10 3中的每个细胞孔的8 -井ü ntreated或聚赖氨酸-处理ibidi滑动。
解冻HelixIN和H B100X股票试剂小号和涡他们简要介绍。
在Milli-Q无菌水中将HelixIN试剂稀释5倍（1 µl HelixIN + 4 µl H 2 O）。
对于一个单一的孔8 -瓦特ELL ibidi滑动，并结合在1.5 - ml离心管：1微升（50纳克）AIMTOR DNA（股票50纳克/微升），1.5微升的非编码的质粒（250毫微克）（储备液200 ng / µl ）和30 µl无血清DMEM。
加入3.5 µl稀释的HelixIN。
轻轻混合，但不要涡旋！
在室温下等待30分钟。
添加总量36 -微升滴加到一个阱的一个8 -瓦特ELL ibidi滑动。
加入3.3 µl HB100 × 。
孵育细胞为24 - 48小时在37℃的培养箱中5％的CO 2 。
通过显微镜进行BRET成像（见下文）。

细胞群中的BRET监测
打开Synergy 2（或同等功能）印版阅读器，然后打开Gen5 TM Reader软件。
编程的用于BRET板读数协议：
选择要在“板读取模式”下读取的行，以允许多次读取板（持续20分钟至1小时）。
˚F或各板读数，p rogram 2连续1 -的阅读小号在波长S的485nm和530nm处，允许BRET强度的计算基于所述光单元的比例ë任务在530nm到所述光单元È任务在485 nm处
根据读板器设置动态范围和其他参数。
制备10 × ˚F urimazine [200μM]在1.5 -米升管通过稀释˚F在BRET urimazine库存读取介质。
删除的96 -从CO表达AIMTOR孔板含有细胞2培养箱中培养。
吸出培养基，并在读数前立即用90 µl新鲜的BRET读数培养基（不含酚红）替换。
加入10微升的˚F urimazine （200μM ）在BRET稀释读取介质（20μM终浓度），以使用多通道移液管或repipetor（Eppendorf）中每个孔含有细胞。
进行板读取的时间最长为1小时（允许连续读取每个孔，具体取决于要读取的孔的数量和板读取器的速度）。
导出一个Ë的Xcel文件与所述原始实验数据示出光部Ë在530nm和每个孔随时间485nm的任务。

BRET成像经由米icroscopy
打开显微镜系统，然后打开Metamorph图像采集软件（图1）。等待约1小时，直到相机温度达到-80°C。
在此期间，采取一个8 -瓦特ELL μ-滑动出培养箱并删除从要图像的孔中的培养基中不干燥的细胞。洗细胞一次用300微升PBS中，并填充每个孔用200微升的BRET实验培养基（见ř ecipes部分）。成像前至少30分钟更换培养基，因为此过程可能会影响mTOR信号传导。
将培养皿放在显微镜载物台上并固定，使其不能移动。
使用与成像相同的实验条件收集背景暗图像。对于您的第一次采集，您将必须在BRET记录后执行此步骤，并且不要洗碗。
着眼于使用落射荧光照明来检测Y型PET和细胞的场的图像采集的图像捕捉的定位的AIMTOR生物传感器（图2A）。
如果你的设置配备有一个多工位级，保存的位置，然后重复此步骤位置的数量，您希望在使用。请注意，保存的位置越多，每个字段的连续时间点之间的延迟就越长。
制备由以下组成的新鲜混合3微升的˚F urimazine与57微升的BRET实验培养基。小心地加入50微升细胞上的顶端的该混合物以达到50μM的最终浓度˚F urimazine 。等待1分钟到允许˚F urimazine到弥漫性Ë在井中。
确保关闭所有显微镜照明和室内照明。关闭暗框。
图像在信道波长的460和530nm（Ð etermine合适的曝光时间，以使没有信道是过度曝光）。

图2的mTORC1的BRET成像activit ÿ 。A.实施例- [R eporter表达AIMTOR转染C2C12细胞用Y-PET表达检测。NLuc发射（B，EM 460）和Y-PET发射（C，EM 530）通过后的能量的非辐射转移从NLuc发起˚F urimazine加成。D. Em 530和Em 460图像的逐像素划分产生伪彩色的BRET图像（Em 530 / Em 460）。比例尺：20 µm。

数据分析

A.在细胞群BRET的数据分析，小号

导出与原始数据的Excel文件为每个孔示出的光单元ë在任务波长小号的530纳米和485纳米以上20到60分钟（该板的几个连续的读数）（图3，表A）。
排除BRET测量小号时供体发射的光的荧光的线性范围的出或当NanoLuc饱和或发出小于6000光单元š在Em485nm 。Ť他的最小值被确定使用Biotek的协同2读写器通过表达NanoLuc验证读取器的线性度/精度，并确定最低细胞的连续稀释阈值允许精确测量BRET。该阈值取决于每个酶标仪的特性（酶标仪的灵敏度和范围）。
计算每个孔和每个时间点的BRET强度（BRET比= Em530 / Em485）。
计算平均值BRET强度比为一式三份孔在每个读取时间点（图3;表A）。
计算在20或60分钟内积分的BRET强度，并平均给定条件的BRET强度，至少进行3次独立转染（每份均一式三份）（图3，表B）。确定随时间变化的AIMTOR BRET强度（图3C）。
在GraphPad软件中合并平均BRET强度数据，并执行适当的统计分析。

图3.在典型AIMTOR BRET分析的实施例一使用板读数器C2C12细胞群。表A：一次用AIMTOR转染的一式三份孔中的BRET强度（BRET比Em530 / Em485）随时间的变化（蓝色列）和一式三份孔的所得平均BRET比（黄色列）。表B：AIMTOR（T757）的3次独立转染和其非磷酸基在有效对照突变体（A757）上3次独立转染随时间的BRET强度。每个黄色列表示在平均强度BRET时间从一式三份孔计算出的单次转染（未示出）和b ottom绿色通道显示每个转染积分的平均强度BRET一个20 -分钟读数。曲线C和d示出了的AIMTOR T757和其3个独立转染C2C12 BRET强度非phosphorylaた竹叶提取A757突变体; 期间BRET强度的20 -分钟，m onitoring期间（C）及积分读板（d）的20分钟平均BRET强度。

B.通过显微镜对BRET成像进行数据分析

排除其中NanoLuc信号使相机饱和的单元格。
重复该实验中的细胞至少有三个不同的批次，每状态至少十场收集。根据实验的可变性增加这些参数。
如果要评估动力学，请将图像保存为每个波长和位置采集的堆栈，以方便进一步分析（步骤4）。如果不是，请忽略此步骤。
使用我们先前发布的斐济开源插件（Chastagnier et al。，2018）对每个细胞/亚细胞区室（https://github.com/ychastagnier/BRET-Analyzer）进行分析。简要地说，它执行4个关键步骤：
我映射背景减法。
我会随着时间调整对齐方式。
Ç图像的omposite阈值处理。
P由图像的像素分割并在伪彩色尺度的比率强度分布ixel。
在GraphPad软件中合并平均BRET强度数据，并执行适当的统计分析。

笔记

事实和提示考虑选择是ST为您的实验发射过滤器：
如果是最佳光检测，则发射滤光片应以染料的发射峰为中心。但是，根据发射滤光片的带宽，即使发射滤光片不是完全以发射峰为中心，也可以为BRET实验收集足够的光。例如，在本研究中，我们分别使用微孔板读取器和microscop e使用[485 / 20nm]和[450 / 70nm]发射滤光片监测n萤光素酶的发射。两个滤光片都不能精确地定位在460 nm （正荧光素酶发射波长的峰值）的中心，但是它们使我们能够收集足够的信号。但是，由于这些原因，无法正式比较基于这两种方法计算出的BRET比值的绝对值。

选择n AIMTOR BRET读取介质时要考虑的事实和提示：
Ç omparing BRET强度数据可以是无意义的，当BRET记录小号是不与相同的读介质和条件下进行，作为mTOR活性（和AIMTOR）是许多参数和监视条件潜在的敏感，如细胞汇合和所述板的晃动。因此，在比较各种实验条件时，使用独特的读取缓冲液和方案至关重要。由于mTOR的亲属酶激活尤其取决于ö Ñ氨基酸，血清和其它化合物的存在/缺少的一种或多种这些化合物的可ALTE期间监视řBRET强度和它的稳定性周期持续20至60分钟。对于AIMTOR BRET强度记录，读板可以以几种进行类型的MEDI微米，提供所选择的介质不含苯酚红消除与BRET监测任何不利的干扰。但是，也可以将含有0.1％葡萄糖的简单PBS缓冲液用于AIMTOR BRET细胞群体读数。有趣的是，我们注意到悬浮的贴壁细胞（在PBS中洗涤，胰蛋白酶消化，通过离心收集细胞并在BR ET阅读缓冲液中重悬后）也可以用于测量AIMTOR的BRET强度。然而，在这种情况下，重新悬浮的细胞的BRET强度较低比的相同的细胞类型，如果它被保持在粘附状态BRET读取期间。细胞融合是另一个可以改变mTOR活性的参数，因此在比较条件时应仔细考虑。最后，刚过板的晃动˚F urimazine另外也有可能对AIMTOR BRET强度的影响，我们不建议使用在平板阅读协议的晃动一步。

随着时间的推移，可以连续进行采集以监测mTOR动态（Bouquier等，2020）。

菜谱

用于C2C12细胞生长和维持

DMEM常规生长培养基（含s酚红）
DMEM（10％FBS + 1个mM的丙酮酸钠+ 1/100 p enicillin和小号treptomycin ）

为C2C1 2分割婷在96 -孔平板用于BRET监测细胞群小号或在8 -井ibidi处理幻灯片BRET成像

DMEM生长培养基和读取培养基
DMEM （无酚红）

的25mM克lucose

2毫米克谷氨酰胺

10％FBS

1 mM丙酮酸钠

1/100 p enicillin和š treptomyci Ñ

在进行平板读数或BRET成像实验之前，立即用BRET读取介质替换培养基。

为了控制的可能的pH下降可能发生的成像期间，HEPES （15mM的，pH为7.4 ）加入到BRET读数基于无酚红的DMEM一式平台。我们在阅读的时候BRET没有发现任何显著差异一与DMEM细胞群-基于介质配方基础上是否做了或没包含HEPES 。

含0.1％葡萄糖的PBS也可用于细胞群BRET读数（贴壁或重悬细胞）。

致谢

这项工作得到了INRAE（VO）和欧洲研究理事会（ERC）在欧盟Horizon 2020研究与创新计划（JP，拨款协议编号646788），ANR Lanthslider（JP，ANR-17-CE11-0046）的支持下）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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Chastagnier，Y.，Moutin，E.，Hemonnot，AL和Perroy，J.（2018 ）。生物发光共振能量转移测量-BRET-分析仪的图像处理。前端计算神经科学11：118。
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