材料和试剂

1.猎鹰5 ml流式细胞仪管（STEMCELL Technologies，目录号：38057）

2.康宁细胞培养烧瓶，25厘米2 ，通气盖（默克，目录号：CLS430639-200EA）

3.接种环（VWR，目录号：SIMPL200-2）

4.无菌棉签（VWR，目录号：HERE1030619）

5. Easystrainer 70 µm过滤器，用于50 ml试管（Greiner Bio-One，目录号：542070）

6.康宁50毫升离心管（默克，目录号：CLS430828-100EA）

7. 1.5毫升Eppendorf管（VWR International，目录号：0030125150）

8.显微镜载玻片和盖玻片

9. 96孔板，光学透明底部µ-Plate ，96孔黑色（Ibidi ，目录号：89626）

10.移液器过滤嘴

11. 10毫升移液器（VWR，目录号：BURK7550-0010）

12. 4峰珠子（Spherotech ，伊利诺伊州森林湖，目录号：RCP-35-5）。在4°C下存储长达1年

13. Accudrop珠（BECKTON迪金森Biosciences公司，目录号：345249）。在4°C下存储长达1年

14.钙- /镁-免费p hosphate缓冲的盐水（PBS ）片剂（赛默飞世科学，Gibco公司，目录号：18912014）

15.乙醇（Fisher Scientific公司，目录号：12468750）稀释到70％V / V与中号ILLI -Q水。在室温（RT）下存储长达1年

16.次氯酸钠（Fisher Scientific，目录号：11448842）。在室温下储存最多1年

17.马铃薯d extrose一个GAR（默克，目录号：1.10130.0500）

18.荧光增白剂28二钠盐溶液（Calcofluor白色溶液），25％（Merck，目录号：910090-20ML，CAS号：4193-55-9）。在4 °C下存储长达1年

19.鞘液（请参阅食谱）

20. 50％葡萄糖溶液（请参阅食谱）

21.最小米edium（MM）（见配方）

22.磷酸盐-缓冲盐水（请参阅食谱）

23.盐水补间溶液（ST）（请参阅食谱）

24. Calcofluor白色工作溶液（请参阅食谱）

25. Vishniac解决方案（请参阅食谱）

设备

血细胞计数器（VWR，目录号：BRND718905）
微量移液器一套
BD涌入细胞分选仪（Becton Dickinson公司）与100 -微米的喷嘴尖
超声水浴（格兰特仪器有限公司，型号XUBA3）
高压灭菌器（Prestige Electrolysis + Spa Supply，型号：MED 2100，目录号：SAP2100）
温度-控制的孵化器（活页夹，BD系列经典线路，型号：BD 400）
光学显微镜（蔡司，型号：Axiolab 5）
荧光显微镜（蔡司，Axio Observer Research倒置显微镜）
移液管控制器（VWR，型号：吸管男孩，目录号：612-0928）
台式离心机（Fisher Scientific公司，米Odel等：的Eppendorf TM台式微量离心机，目录号：10216522）

软件

Sortware版本1.2.0.142（Becton Dickinson公司）
FlowJo版本10.7（Becton Dickinson）（https://www.flowjo.com/）
Rstudio版本1.3（可选）（https://rstudio.com/products/rstudio/）

程序

注意：所有步骤都必须在II级生物安全柜中执行。

用于流式细胞仪分析的生长细胞
吸取10米升的高压灭菌的4％p otato d extrose一个GAR在中号ILLI -Q水（PDA）到25 -厘米2个排出细胞培养瓶中，并允许固化。
要获得休眠孢子（图1A），请从带有无菌环的冷冻甘油原液中提取孢子，并将孢子均匀地铺在琼脂培养基上。
在最佳生长温度（烟曲霉为37°C ）下孵育3天，具体取决于种类。
通过吸取10收获孢子米升在培养ST，关闭所述盖，并通过振荡培养剧烈混合从一边到另一边。
如果孢子难以从菌落中分离出来，请在琼脂培养基上铺满ST时，用无菌环或棉签将其刮下。
放置一个70 -在50微米的过滤器-米升管并通过过滤器倾总培养。
计数孢子在滤液（股票）使用血细胞计数器后制作在ST 1/100稀释，和稀从库存到5 × 10 6个/孢子毫升（总1使用ST毫升在一个1.5 -毫升Eppendorf管）。保持在冰上，直到执行荧光标记。绝不能将孢子解决方案在冰箱中的时间超过1的一天，因为孢子倾向于聚集，这阻碍了单-细胞分析。
为了获得各向同性生长的孢子（图1B），接种20毫升用5个MM的× 10 6孢子/毫升于25从新鲜孢子溶液-厘米2排出细胞培养瓶。
暂停孢子吹打的解决方案上下。
孵育为6为H 37 ℃下作为一个稳定培养，在所述的情况下，烟曲霉。使用常规培养会限制细胞聚集。
为了获得幼体（图1C），接种20毫升的MM用5 × 10 6孢子/毫升于25从新鲜孢子溶液-厘米2培养烧瓶中。

图1.可以使用流式细胞仪分析并通过FACS选择的细胞类型。A.休眠孢子; B.各向同性生长的孢子；C.盖林（C. Germling）。比例尺代表10 µm。

暂停孢子吹打的解决方案上下。
孵育为在30℃为16小时一个稳定培养，在所述的情况下，烟曲霉。
第二天，从常规培养物中收获各向同性生长的孢子和种苗。
V igorously混合的文化摇晃从他们一边到另一边。
P花边70 -在50微米的过滤器-毫升管中并通过过滤器倾总培养。保持在冰上，直到荧光标记。

真菌细胞的荧光标记
准备工作浓度为s的ST或PBS中的染料溶液。例如，真菌细胞壁可以用钙荧光白标记。特定工作浓度（25 nM的- 1 μ M）必须通过实验来确定，并且可以使用荧光显微镜进行检查。可替代地，细胞器，如米itochondria可以进行荧光标记，以评估它们的活性。另一种选择是使用基因编码的荧光团（Bleichrodt and Read，2019）。作为一个例子，我们在这里描述了使用钙荧光白结合细胞质的荧光标记。
吸取1毫升，从所述收获的培养产生如描述的上述（小号TEP A7或A14）到1.5 -毫升Eppendorf管中。
在室温下以6,000 × g的转速将样品旋转10分钟以沉淀细胞。
用移液器吸头除去上清液。
向沉淀中加入1 ml的Calcofluor白色工作溶液（250 nM ），并通过涡旋悬浮。
在室温下孵育10分钟，然后在室温下以6,000 ×g的速度离心沉淀细胞10分钟。
用移液器吸头除去上清液。
加入1 ml ST并涡旋洗涤细胞。
在室温下以6,000 × g的速度旋转样品10分钟以沉淀细胞。
用移液器吸头除去上清液。
加入1毫升ST并涡旋。
将细胞放在冰上，直到流式细胞仪分析为止。

初始化的流式细胞仪
检查的废物箱是空的，足够的鞘液可用。
之前，要启动的细胞分选仪，用于含钙最近填充的鞘罐交换乙醇关闭罐-free和镁的PBS（鞘流体）。
清空废物容器，然后向槽中添加50毫升未稀释的次氯酸钠溶液。
打开PC和细胞分选仪，以及所有用于激光器的电源。
开始的流式细胞仪软件。
声处理100 -在声处理水浴中5分钟，得到控制而微米陶瓷喷嘴尖端Ë所述系统中的现有的乙醇溶液进行冲洗和用鞘液代替。
超声处理后，将喷嘴插入流通池组件并运行流。
在校准和校准之前，让水流运行并沉降至少45分钟（步骤D和E）。

对准和校准
使用4峰彩虹校准颗粒（Spherotech ）荧光珠对准激光。
通过将1滴珠子（〜60 µl ）加到2 ml的M illi -Q水中来制备4峰的彩虹校正颗粒。第r emaining珠可以被存储在4℃下并且对于高达稳定1一个月。
在BD Influx上，使用千分尺沿3轴e手动将激光对准流。当清楚地解析了4个总体时，可以实现正确的比对，并且用最亮的峰的方差系数（CV）测得的展宽小于6％，如软件所示。
记录的通过绘制门，用于每个的激光功率4个4峰彩虹校准颗粒的荧光群。
停止运行。
将门保存在流式细胞仪软件中。
开始一个新的实验前，校准的通过运行4峰彩虹校正粒子激光功率，并调整其在4个事件分别装门。这可以通过在软件中单独调整激光器的电压来完成。此程序可确保可以绝对比较各个实验之间的荧光标记。
对齐后，使用Accudrop磁珠（Beckton Dickinson）设置下降延迟。
将一滴Accudrop珠子（〜60 µl ）加到1 ml的M illi -Q水中。
以使每秒2,000 – 3,000个事件在软件上可视化的流速运行磁珠。
在软件中设置一个排序门，以确保将所有珠子分配到排序流中。
调整滴落延迟，以确保分选流中存在> 95％的Accudrop珠粒。所述d ROP延迟是所述时间段（微秒）需要对感兴趣的粒子（例如，细胞或孢子），以从行进的识别点由软件与完整流的末尾。为了确保该时间设置是否正确，我们利用6 -μ米直径Accudrop荧光珠和调整液滴延迟时间，直到珠粒> 95％存在于所述侧（排序）流和废物流中不再。
注意：在整个分选过程中，均会目视监控物流的稳定性和断开点的相对位置。

设置索引排序
索引排序是单-细胞或颗粒的技术，其中每个单独排序颗粒的相对光散射和荧光可追溯到原始数据。索引排序所述内执行Sortware通过选择单一软件-分选和检查所述适当的索引整理箱的细胞模式。
在分选之前，通过调整偏转板的电压使分选流与捕获板对齐，并确保测试分选液滴在每个孔的中心。这个过程将确保单个液滴，其含有单独的孢子，被引导到正确的以及沿整个96 -孔平板中。每个分类的粒子在板上都分配有其自己的唯一X和Y坐标s ，并且此信息记录在数据集中以供稍后在分析期间调用。

对单个细胞进行排序以确定门控策略（对每种新真菌和细胞类型仅执行一次此步骤）
吸取1 ml的所述的样品中，以5 -毫升流式细胞术管和负载在所述流式细胞仪的样本。
绘制一个新的流式细胞仪数据图。
运行样品和调整数据图的轴线SSC（小号IDE散射）和FSC（˚F orward散射）（图2A）。
休眠孢子，各向同性地生长孢子，和GER毫升英格斯通常位于在图中示出的母栅极小号分别2A，2C和2E，。相应地绘制门。
选择从母亲栅中的数据（图小号2A，2C或2E），并使用一个新的数据图绘制此吨起重工p ulse瓦特IDþ（TPW）和FSC上的轴。在没有TPW设置的流式细胞仪上，绘制FSC-Width与F SC -Area的关系。对于圆形细胞，例如休眠和各向同性生长的孢子，位于主要对角线细胞群体外部的少数细胞是聚集体。
要选择单细胞，吸取单元的主对角线人口（图女儿栅极小号2B和2D）。
对于GER毫升英格斯（图2F），绘制子栅极只是细胞的主要对角线以上人口，但是从FSC信号只取人口的左侧，和只到含有大部分细胞的TPW（绿色区）。
要测试这些门是否具有真菌种类，请在每个子门的载玻片上对细胞进行分类，盖上盖玻片，并在光学显微镜下观察细胞，以确定您是否可以主要看到所需细胞类型的单个细胞。
如果不是这种情况，则需要进行一些优化。
在流式细胞仪的分选室中放置一个96孔板，底部具有光学透明的底部，适合显微镜检查。
现在，使用索引排序从子门对每个孔排序1个单元格。
使用显微镜查找孔中的每个细胞，并对其中的孔仅包含所需类型的单个细胞进行评分。
在流式细胞仪软件中，选择包含单个细胞的所有孔并绘制此数据。
现在绘制在初始门事件在一个新的窗口，并在此数据中得出一个女儿大门，让所有的事件落在新的大门。
步骤˚F 10- ˚F 14应当被重复用于每个小区类型单独地（例如。，休眠孢子，各向同性地生长孢子和GER毫升英格斯;图1）。
特定的门可以存储在流式细胞仪软件中，并在每个新的会话之前加载。
校准的每次运行（之前激光功率步骤d）是必需的，以确保准确门控。

用于测量和/或分类其他样品
在样品管中反冲先前的样品，然后加载新的样品。
使用步骤F中实验确定的门来分析或分类单个单元格。
为了分析，绘制子门的所有事件（参见女儿栅极图小号2B，2D和2F）是一个新的构思，并选择适当的轴（例如，SSC对FSC为未标记的细胞或荧光强度（激发/发射）相对应的细胞的荧光标记）。
在软件中选择适当的停止（子门）和存储门（所有事件）并获取数据。此过程可确保测量所需的特定细胞类型的单细胞数量，并且还存储来自总细胞群体的所有事件。
用于分拣，地点5 -毫升排序管或一个多孔的特定样本保持器板。最好根据计划的下游实验，用一些ST或MM预填充试管/孔。

图2.门控策略进行分析和分选3种细胞类型：休眠孢子，各向同性地生长孢子和GER毫升英格斯。（A）休眠孢子，（C）在37°C下孵育6 h的孢子和（E）在30°C下孵育16 h的孢子的总样品显示出通过对玻片进行分选确定的门（黑色形状）。彩虹的颜色渐变表示小号的事件发生率，蓝色表示最低利率和红色表示最高水平。在一个XES显示的S IDE小号catter（SSC）和˚F orward小号的信号的catter（FSC）。所述d aughter栅极（B，d，F）的所述的（A，C，E）中所示门，如通过索引排序确定，含有（B）休眠孢子，（d）的主要是单细胞各向同性生长的孢子和（ F）GER毫升英格斯示。在一个XES显示的吨装配工p ulse瓦特（TPW）和IDþ小号IDE小号catter（SSC的信号）。在p从总人口（A，C，E）或母亲细胞群ercentages（B，d，F）落在在特定栅极在每个面板的右下角所示。

清洁程序
按照每个分析或分类程序，建立并运行有效的去污协议非常重要。我们测试了孢子存活的各种方案，并且在这些分选实验中实施了最有效的方案。
反吹系统与鞘液样品线，以确保一个最小的数目的孢子保持在采样线。
使用5 ml管，将4 ml 70％的乙醇倒入样品管线中5分钟。
停止运行，让管线在乙醇中浸泡15分钟。
取出5 ml乙醇试管，换成10％v / v次氯酸钠试管，重复上述步骤，即，将溶液运行5分钟，然后沐浴15分钟。
最后，使用5 -毫升管，运行3毫升的中号ILLI通过系统-Q水20分钟，以冲洗掉漂白剂。
收集1 ml液体，将其添加到液体生长培养基中，并孵育3天。没有孢子长出应该是可见的。

关掉
关闭后的细胞分选的净化过程。
停止流并取出水管。
将鞘罐换成70％乙醇的罐，然后开始物流。
在系统的所有部分中运行乙醇15分钟。
关闭流并将细胞分选器留在乙醇中。
用M illi -Q水反冲洗喷嘴，然后将喷嘴浸没。
关闭所有激光器，然后关闭系统。
拆下废液箱。d O不可空废物箱，直到第二天，以确保该没有生物可以生长在废弃。

数据分析

导出的流式细胞术数据文件可以在FlowJo中打开和可视化，并作为csv文件导出。对于细胞亚群及其异质性的可选统计分析，我们请读者参考Bleichrodt等。（2020年）（请参见材料和方法部分和文本S1）。R中用于统计分析的代码可以从https://github.com/rbleichrodt/Conidial-heterogeneity获得并在Rstudio中运行。

笔记

原则上，该协议可与任何允许索引分类的流式细胞仪一起使用。
对于烟曲霉，我们一般获得的排序〜98的效率％，91 ％和休眠80％和各向同性生长的孢子和GER毫升英格斯（图1），分别。
应针对每个单独的物种测试去污程序。本协议中的净化程序仅作为烟曲霉的指南。

菜谱

注意：除非另有说明，否则所有配方均应使用M illi -Q水配制。

鞘液
钙-free /镁-溶解于无PBS片剂中号ILLI -Q水和高压灭菌

在室温下存放最多2周

50％葡萄糖溶液
500 g / L d-葡萄糖过滤灭菌

在RT储存长达1年

MM，pH 6.0
6克/ L的NaNO 3 ，1.5克/升KH 2 PO 4 ，0.5克/升的KCl ，0.5g / L的硫酸镁4 ·7H 2 ö和0.2 ml的/ L Vishniac溶液（彭特克沃等人，1953; Vishniac和桑特（1957年）
高压灭菌
冷却并添加20 ml / L 50％葡萄糖溶液，以获得1％葡萄糖的最终浓度
在RT储存长达1年

Vishniac溶液，pH 4.0
10 g / L乙二胺四乙酸（EDTA）

4.4克/升ZnSO 4 · 7H 2 O

1.0 g / L MnCl 2 · 4H 2 O

0.32 g / L CoCl 2 · 6H 2 O

0.32 g / L CuSO 4 · 5H 2 O

0.22 g / L（NH 4 ）6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O

1.47克/升CaCl 2 · 2H 2 O

1.0 g / L FeSO 4 · 7H 2 O

通过过滤灭菌，并在4 °C下保存长达1年

盐水吐温溶液（ST ）
0.9％（w / v）氯化钠

0.005％（v / v）吐温80

通过高压灭菌器灭菌，并在室温下保存长达1年

PBS pH 7.4
氯化钠8克/升

氯化钾200 mg / L

Na 2 HPO 4 1.44克/升

KH 2 PO 4 245毫克/升

通过高压灭菌器灭菌，并在室温下保存长达1年

钙荧光白（荧光增白剂28 ）工作溶液
从25％（w / v）的库存中稀释至ST中的最终浓度为250 nM

过滤灭菌，并在4°C下保存长达1个月

致谢

该项目收到来自欧盟的展望2020研究和创新资助计划下的玛丽罗多夫斯卡-Curie赠款协议FUNFIT没有。659003。这项工作源自Bleichrodt等人。（2020年）。一些数字合并并面板文本进行了修改，并且所述的主体的文本已被修改。知识共享署名4.0国际许可https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

Bleichrodt ，RJ，面包车Veluw ，GJ，Recter ，B.，丸山，J.，北本，K。和Wösten ，HAB（2012）。米曲霉中菌丝的异质性是Woronin体动态封闭隔垫的结果。摩尔中号icrobiol 86（6）：1334至1344年。
Bleichrodt ，RJ，Vinck ，A.，Read，ND和Wösten ，HAB（2015）。通过质膜衬里隔壁异构菌丝隔室之间的选择性传输黑曲霉。真菌ģ ENET乙IOL 82：193-200。
Bleichrodt ，RJ和Read，ND（2019）。流式细胞仪和流式细胞仪应用于丝状真菌。Fungal Biol Rev 33（1）：1-15。
Bleichrodt ，RJ，Foster，P.，Howell，G.，Latgé ，JP和Read，ND（2020）。烟曲霉中单细胞之间的细胞壁组成异质性导致抗真菌治疗和吞噬作用期间的异质行为。mBio 11（3）：e03015-19。
庞特科沃（G. Pontecorvo ），罗珀（Roper），JA，汉蒙斯（Hemmons），LM，麦克唐纳（Macdonald），KD和巴夫顿（Bufton），AW（1953）。构巢曲霉的遗传学。进阶ģ ENET 5：141-238。
Vinck ，A.，Terlou ，M.，Pestman ，WR，Martens，EP，Ram，AF，van den Hondel ，CAMJJ和Wösten ，HAB（2005）。菌丝分化的探索菌丝黑曲霉。摩尔中号icrobiol 58（3）：693-699。
Vinck ，A.，de Bekker ，C.，Ossin ，A.，Ohm，RA，de Vries ，RP和Wösten ，HAB（2011）。在的周边基因的异种表达了编码分泌蛋白黑曲霉菌落。ENVIRON中号icrobiol 13（1）：216-225。
Vishniac ，W。和Santer ，M。（1957）。硫杆菌。Bacteriol R ev 21（3）：195-213。