材料和试剂

1. 50毫升隼吨ubes （VWR，目录号：89039-656）

2. 70毫升聚碳酸酯瓶组件，38 × 102毫米（贝克曼库尔特，目录号：355622）

3. 3.5毫升ö笔顶厚壁聚碳酸酯超速离心管小号，13 × 51毫米（Beckman Coulter公司，目录号：349622）

4. Acclaim SEC-1000色谱柱7 µm 4.6×300 mm（Thermo Fisher ，目录号：079724）

5. Acclaim SEC-1000保护柱7 µm 4.6×33 mm（Thermo Fisher ，目录号：082739）

6. Trans-Blot Turbo RTA转移套件LF PVDF（Bio-Rad，目录号：1704274）

7. MultiScreen HTS FC滤板，1.2 / 0.65 µm（Millipore Sigma，目录号：MSFCN6B5）

8. MultiScreen HTS真空歧管（Millipore Sigma，目录号：MSVMHTS00）

9. 6”瓦特OOD ħ andle Ç奥多小号WAB（VWR，目录号：89031-270）

10.动物组织的消化性消化物（M食用蛋白ept；标准，目录号：C7482）

11.酿酒酵母BY4741（ATCC，目录号：201388）

12.酵母提取物（标准，目录号：C7342）

13. d-葡萄糖（VWR，目录号：BDH9230）

14.琼脂（阿克罗斯（Acros），目录号：443570010）

15. 0.5毫米克玻璃珠（科学工业，目录号：SI-BG05）

注意：使用前，玻璃珠应先用漂白剂清洗，浸泡一整夜，然后再用去离子水洗涤，直到根据pH试纸测得的水洗液的pH为中性（通常是在洗涤10次后）。最后，将珠应该两次洗涤我sopropanol并干燥过夜。

16.液氮（空气，目录号：NI 240LT22）

17.乙二胺四乙酸，蛋白质组学等级（EDTA； VWR，目录号：M101）

18.氯化钠（EMD密理博，目录号：SX0420-5）

19.苯甲基磺酰氟（PMSF; Acros Organics，目录号：215740100）

20. Tris base（Sigma，目录号：T6066 ）

21. β巯基乙醇（VWR，目录号：M131）

22.甘油（EMD密理博，目录号：GX0185-6）

23. Pierce 660-nm检测（Thermo Scientific，目录号：1861426）

24. EZQ P rotein Q uantitation ķ它物（Thermo Scientific，目录号：R33200）

25. 3-[（3-氯氨基丙基）二甲基铵] -1-丙烷磺酸盐（CHAPS； VWR，目录号：0465）

26.胆固醇半琥珀酸酯三盐（CHS; Anatrace，目录号：CH210）

27.二硫苏糖醇（DTT； VWR，目录号：97061-338）

28.鸟苷5 ' -[γ-硫代]三磷酸四锂盐（GTPγS ；Sigma，目录号：G8634）

29. 4 – 20％Mini-PROTEAN TGX无污蛋白凝胶，10孔，50 µl（BioRad，目录号：4568094）

30. UDP- [U- 14 C] - d -葡萄糖（UDP- [ 14 C] GLC;美国放射性化学，目录号：ARC0154）

31. UDP- d-葡萄糖二钠盐（UDP-Glc；Carbosynth，目录号：MU08960）

32.十二烷基硫酸钠（SDS； Sigma，目录号：75746）

33.乙醇190证明（Koptec，目录号：V1101）

34.三氯乙酸（TCA； EMD密理博，目录号：TX1045）

35. 50％（w / w）的氢氧化钠溶液（NaOH; Fisher Chemical，目录号：SS254-500）

36. ASTM I类水（里卡，目录号：9150-5）

37.异丙醇（Fisher Chemical，目录号：A416P）。

38. Pullulan标准（昭和电工株式会社，目录号：P-82）

39.一抗：

Anti-Fks1p（J.-PLatgé的礼物，巴斯德研究所的礼物）（Beauvais等人，2001年）
Anti-Rho1p（东京大学Y. Ohya的礼物）（Qadota等人，1996年）
40.山羊抗兔IgG-HRP二抗（Southern Biotech，目录号：4030-05）

41.用于CCD成像的辐射HRP基板（Azure Biosystems，目录号：AC2101）

42. Dionex ED电化学检测器一次性电极，PTFE上的金（Thermo Fisher，目录号：066480）

43. 40％无菌葡萄糖溶液（请参阅食谱）

44.酵母蛋白ept右旋糖（YPD）培养基（请参阅食谱）

45. 0.5 M EDTA储备液，pH 8.0（请参见配方）

46.破损缓冲区（请参阅食谱）

47.膜缓冲液（请参阅食谱）

48. KF M ix（请参阅食谱）

49. 2 ×分析缓冲液（请参见配方）

设备

500毫升带挡板的烧瓶（化学玻璃，目录号：CLS-2044-05）
2.8升带挡板的烧瓶（化学玻璃，目录号：CLS-2022）
-80°C冰柜（VWR交响乐超低温冰柜，型号：DW-86L638H）
-20°C冷冻室（VWR，目录号：82027-388 ）
镊子（VWR，目录号：82027-388）
电磁搅拌棒（VWR，目录号：58948-98）
7毫升Dounce tissu e研磨器，带有A型和B型杵（Kimble，目录号：D9063）
1.5毫升带管样品杵（国际研究产品，目录号：199226）
搅珠器（Biospec ，型号：BeadBeater）
45-Ti型转子（Beckman Coulter，型号339160 ）
贝克曼L7-55超速离心机（贝克曼，型号：L7-55）
TLA 100.3定角转子（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），型号349490）
贝克曼Optima TL-100超速离心机（贝克曼，型号：Optima TL-100）
搅拌板（Labnet Accuplate模拟电磁搅拌器，型号：D0310）
BioVortexer（Biospec，型号：1083）
水浴超声波仪（NEY，型号：ULTRAsonik 28H）
ICS-5000 + DC色谱/检测器系统（Thermo Fisher ，型号：ICS-5000 +）
闪烁计数器（贝克曼库尔特，型号：LS 6500）
馏分收集器（Pharmacia Biotech，型号：FRAC-100）

软件

Microsoft Excel（Microsoft，https://www.microsoft.com/zh-cn/microsoft-365/excel）
Chromeleon 7.2 Thermo Scientific Dionex Chromeleon色谱数据系统（Thermo Fisher Scientific，https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/CHROMELEON7#/CHROMELEON7）
程序

A.酿酒酵母培养

1.条纹酿酒酵母从甘油储存到新鲜YPD琼脂平板（2％琼脂）上并在30℃下孵育板2 - 3天。平板通常持续约2周。

2.在500毫升带挡板的烧瓶中准备2 × 200毫升YPD培养基，在2.8升带挡板的烧瓶中准备12 × 1.5升YPD培养基。

3.从平板上挑一个菌落，并在培养管中接种2 ml YPD培养基。在30°C下以200 rpm摇动孵育培养物约8小时。这通常是在大规模文化之前的清晨执行。

4.一天结束时，将2 × 200 ml YPD培养基接种在500 ml带挡板的烧瓶中，并从早上开始进行1 ml预培养，然后在30°C下以200 rpm摇动孵育过夜。文化应达到OD 600 （10 – 12）。

5. Ť他第二天早上，添加了过夜预培养物的等分试样（30ml）中的每一个含有1.5L的YPD培养基12个培养瓶中，导致在初始OD 600为0.2 - 0.3。孵育以200rpm的速度在30℃下振荡培养直至培养物的OD 600个达到0.8 - 1.2 ; 吨ypically，这需要〜6小时从接种。

6.通过在5,000 × g ，8°C下离心25分钟收获细胞。

7.洗的粒料一次用10mM EDTA缓冲液（pH值8.0 ）（〜30米升每20克细胞糊）。

8.确定湿细胞重量和存储粒料一个-80℃冰箱中直至使用。通常，可获得50 – 60 g的湿细胞糊。

B. GS准备

1.膜级分的制备

一种。在冰上解冻冷冻的细胞沉淀。

b。Resu将细胞沉淀物置于150毫升冰冷破碎缓冲液中。

C。用约150 ml冰冷，干净的0.5 mm玻璃珠将悬浮液转移到搅拌器中。顶部向上腔室用缓冲液以最小化可用空气空间一旦该腔室被组装时，并且确保该室被很好地覆盖由所述冰-水中。溶解细胞，珠磨，用5 × 1分钟的脉冲，具有一10 -每个脉冲之间分钟的休息。

d。在4°C下以1,500 × g离心15分钟以清除裂解液；分离澄清的裂解液。

e。重悬不溶性物质在破碎缓冲液（100毫升）和重复小号TEPS B1 c和B1 d，以确保破坏>细胞的95％。

F。从TW合并澄清的裂解物ø珠磨周期，并转移到70 -毫升超速离心管。

G。将裂解物在100,000 × g下于4°C离心1小时。在试管底部应该可以看到一个棕色的沉淀物。该颗粒包括主要膜蛋白，脂质，和任何其它分子，例如与它们紧密结合聚糖。

H。使用7 ml Dounce匀浆器和松杵（由制造商标记为“ A”）将小丸重悬于〜80 ml膜缓冲液中约10次，或直到不再剩下大块小丸，然后将紧小杵（由制造商标记为“ B”）另外的约10个冲程，以确保彻底重悬膜沉淀。

一世。确定使用的660nm测定蛋白质浓度ķ它和BSA标准根据制造商的方案。为了确保适当的阅读，再悬浮的膜级分我š通常稀释50 - 200 -倍。

j。调节与膜缓冲液再悬浮的膜级分的最终体积至约5毫克/孔的最终浓度毫升蛋白质。通常，18 L培养物产生约100 ml重悬的膜级分。

k。闪光灯-冻结20 ml的等分50 ml的的Falco Ñ吨ubes在液氮中，并储存在一个-80℃冷冻机中直至准备进行到下一个步骤（图2，泳道1）。

注：我们把这种悬浮“膜部分，”它可以冻结，如果存储与活性损失最小的-解冻被最小化。

2.洗涤剂增溶

一种。在冰和转印膜部分的到解冻等分试样的适当尺寸，冷却三角烧瓶含有搅拌棒和地点在冰-水浴中。由于存储纯化GS的能力，我们建议我们荷兰国际集团整个制备的膜部分来获得2.5 -毫升批次纯化GS的。

b。在搅拌融化的膜级分的同时，添加GTPγS（27.5μM最终浓度），DTT（6.88 mM）和NaCl（192 mM）。

C。滴加10％（w / v）CHAPS / 2％（w / v）CHS溶液，以达到0.688％CHAPS和0.138％CHS的最终浓度。

d。使用搅拌棒和搅拌板在冰水浴中将悬浮液搅拌30分钟。重要的是轻轻混合溶液以防止GS失活; 因此，进行搅拌，使溶液表面形成一个小的旋涡，没有任何气泡。此步骤也可以使用旋转器执行。

e。将该溶液转移至70 -毫升离心管中并平衡。

F。在4°C下以100,000 × g离心30分钟。

G。保留上清液为“洗涤剂增溶级分” （图2，泳道2）。如果此溶液不能立即用于产物包封纯化，则可以将其快速冷冻并在-80°C下保存，而活性损失最小。

3.产品截留纯化（该过程的流程图请参见图1）

的图1流程图的GS的产物截留纯化。在协议的步骤和所述图2对应的SDS-PAGE车道parenthes描述ë秒。包含GS的关键部分以粗体显示。

一种。甲DD一个0.125 × KF的体积混合和UDP-GLC（4mM的最终浓度）吨Ô洗涤剂solubiliz编分数。在30°C孵育20 – 30分钟。定期倒转试管以确保充分混合。

b。将反应在冰上冷却15分钟。不溶性葡聚糖应在溶液中可见。

C。通过在4°C下以5,000 × g离心5分钟收集不溶的葡聚糖和结合的蛋白质（有关沉淀的n图像，请参见图3 ）。保留上清液的等分试样（产物截留的未结合部分；图2，泳道3），用于蛋白浓度测定（步骤B 3o）和SDS-PAGE分析（步骤B3 p）。

d。通过resuspen洗涤所得的葡聚糖/蛋白质沉淀锡永于1.5ml洗涤缓冲液和homogeniz通货膨胀使用的7毫升匀化器和紧杵“B”。

e。通过在4°C下以5,000 × g离心5分钟收集葡聚糖/蛋白质沉淀。保存上清液，以备以后表征。

F。再重复三遍步骤B3d和B3e 。

G。如步骤B3d所述，将沉淀物重悬于1.5 ml洗涤缓冲液中，将重悬液转移至3.5 ml超速离心管中，并在400,000 × g ，4°C下超速离心10分钟以收集沉淀物。结合从上清液小号TEPS B3 e和B3克和存储作为所述“产品截留沉淀洗涤级分”（图2，泳道4），用于以后的表征。

H。通过将沉淀物重悬于0.5 ml提取缓冲液中，从不溶性葡聚糖中释放GS，然后使用手持式电子均质器（BioVortexer）均质化〜10 s。

一世。将重悬液在4°C下孵育过夜。

j。在400,000 × g ，4°C下将重悬液离心10分钟，然后分离上清液和沉淀。

k。将S tep B3 j中的沉淀重悬于0.5 ml提取缓冲液中，然后使用手持式电子均质器均质化〜10 s。

l。孵育悬浮液10分钟，在冰上，在400000离心再悬浮×克（使用TLA100.3转子100000转），4℃下10分钟，并分离上清液和沉淀。

米重复小号TEPS B3 k和B3升三多次。

。合并上清液从小号TEPS B3 j和B3升，得到〜2.5毫升“产品截留纯化GS”（图2，泳道6）。

o。重悬沉淀在0.5ml抽提缓冲液如描述在小号TEP B3 k，以及用提取缓冲液调节音量至1.0ml得到的“产品截留的残余葡聚糖结合级分”（图2，泳道5）。

图2. GS纯化的表征。SDS-PAGE（A）和Western印迹使用的抗Fks1p（B）或抗Rho1p（C）抗体。每个车道都装有5.3 μ g蛋白质。泳道：1，膜级分（见“程序” B1k）；2，洗涤剂增溶级分（见程序B2g部分）；3，产品截留的未结合部分（见程序B3c部分）；4，将产品截留的沉淀物洗净（见步骤B3g部分）；5，产物截留残留葡聚糖的结合级分（见步骤B3n部分）；6，产品截留纯化的GS（参见步骤B3m）。红色箭头指示对应于Fks1p带，和绿色箭头表示对应于Rho1p的波段。授权转载来自刹帝利ê t铝，。，（2020年）。

图3.图片产品包封步骤B3C后形成的葡聚糖颗粒。将丸粒从30制备- 40米升产品截留反应（步骤B3A）是一个50 -米升离心管中。

p。在使用EZQ纯化的每个步骤确定蛋白浓度甲SSAY ķ它和BSA作为所述标准。通常，此方案可从18 L酵母培养物中产生0.73±0.12 mg GS。ķ的nowledge的蛋白质浓度是关键执行荷兰国际集团的GS活性分析和determin荷兰国际集团GS的比活性。

q。分析1 -从用SDS-PAGE用4每个纯化步骤10微克蛋白质- 20％，不含染色凝胶（Bio-Rad公司）。确定GS的纯度根据相对于Fks1p频带到另一个频带（光密度小号EE图2A）。我们通常以20 – 30％的纯度获得GS 。蛋白质印迹法也可以用于确保GS的两个已知成分Fks1p和Rho1p的共纯化。

河闪光灯-冻结并存储在纯化GS的liquots - 80℃。

C.典型的酶活性测定

1.准备UDP- [ 14 C] Glc的库存和工作解决方案

一种。要制备放射性UDP-Glc储备液，请用至少3 × 500 µl体积的diH洗涤小瓶，然后用diH 2 O将500 µl UDP- [ 14 C] Glc稀释在70％乙醇中，使其总体积为3.5 ml 。2 O.除以溶液进入4个试管，并冷冻在-20℃。冷冻后，将试管冻干过夜。准备一个50 mM的非放射性UDP-Glc溶液，并向每个试管中加入3 µmol（60 µl ），得到的UDP-Glc溶液约为10,000 cpm / nmol。通常，我们根据实验目的制备具有高放射性并稀释的储备溶液。

b。稀1微升所得溶液1 ，000 ×水。

C。使用261 nm处的吸光度和261 nm（10.1 mM / cm）尿苷的摩尔消光系数（ε），确定在S tep C1 b中制备的稀释的UDP- [ 14 C] Glc的浓度。

d。为了确定稀UDP-的放射性[ 14 C]在GLC使用小号TEP C1 B，调0，2，4，6，8，10，20，40，60，80，100，和200微升稀释的样品到闪烁小瓶，加入3毫升闪烁液，和计数的上液体闪烁计数器（LSC）的放射性。

e。根据每个样品的放射性（cpm）绘制UDP- [ 14 C] Glc的量（nmol）。可以通过线性拟合的斜率（cpm / nmol）来计算比放射性。

F。要准备UDP- [ 14 C] Glc的工作溶液，请用非放射性UDP-Glc稀释储备溶液，并按照S teps C1 b – C1 e确定比放射性。根据我们的经验，UDP- [ 14 C]与GLC〜800 CPM /纳摩尔比放射性允许小号检测从5葡聚糖形成微升的反应溶液与短至一个30-S温育。

2.在冰上解冻储存的GS的等分试样。我们通常用执行活性测定一个30 -在30蛋白的50μg/ ml的终浓度-微升规模。

3.如“配方”部分所述，准备2 ×化验缓冲液。

4.在30 °C水浴中将2 ×分析缓冲液和GS孵育15分钟。

5.准备用于淬灭和过滤不溶葡聚糖的滤板。向每个滤板孔中加入200 µl 10％w / v TCA。每个孔将用于淬灭每个时间点。

6.通过将1体积的GS加到1体积的2 ×分析缓冲液中来启动反应。通过上下吹打以及关闭试管盖混合溶液，然后轻轻摇动并短暂涡旋，然后返回水浴。请注意，这对于可重现的结果很重要，因为GS储存在30％的甘油中，这需要彻底混合以产生均匀的溶液。

7.在30°C下孵育反应。

8.在每个时间点，转印5 -反应的20微升等分试样到含有200μl的10％w / v的TCA（中制备的过滤器板的孔小号TEP Ç 5）。上下吹打混合溶液。

9.淬灭所有时间点后，使用真空歧管施加真空以过滤淬灭的溶液。用3 × 200 µl 10％TCA洗涤过滤器，然后用2 × 200 µl EtOH洗涤以除去未结合的UDP- [ 14 C] Glc。

10.可以让过滤器干燥过夜，或者可以立即进行分析。从板的底部移去塑料支撑，然后将孔放在空的闪烁瓶上。用棉签将过滤器穿过PVDF膜推入闪烁瓶中。打破棉签手柄，以便可以关闭小瓶盖。如果PVDF膜仍然附着在板上，请用镊子将其转移到闪烁瓶中。

11.加入3 ml的闪烁液，紧密地封闭的小瓶中，并涡旋并摇动以确保该过滤器被浸没。

12.确定每个样品瓶的放射性。我们将闪烁计数器设置为3分钟的预设时间，或将％误差设置为5.0，以较短者为准。

D.通过SEC-PAD分析定量检测GS产品

1.解冻的冰冻结GS的解决方案。

2.准备一个2 ×化验缓冲液。

3.预温育两者GS和2 ×在30℃水浴中15分钟，测定缓冲液。

4.准备的过滤板进行淬火并过滤不溶性葡聚糖。在平板的每个孔中加入100 µl或适当体积的10％w / v TCA 。小号EE小号TEP d 7。

5.启动所述通过混合GS等体积和2反应×测定缓冲液中，并通过移液拌匀，轻弹，并简短涡旋返回到水浴之前。请注意，这对于可重现的结果很重要，因为GS储存在30％的甘油中，这可能导致混合不良和不可重现的结果。请参阅步骤C6。

6.在30°C下孵育反应。

7.在定义的时间点，取出两等份并分别淬灭。

一种。通过将5 µl反应混合物与100 µl 10％TCA混合，在一个滤板孔中淬灭第一等分试样。该淬灭的溶液将用于确定葡聚糖的总量。

b。淬灭反应的第二等份混合物（25 - 5 200微升）- 10个当量的2％（W / V）SDS中的单独的孔溶液中。该淬灭的溶液将用于通过SEC确定长度。不要使用酸淬灭来确定长度，因为酸变性的膜蛋白很难去除并且不会干扰SEC分析。

注意：由于滤板孔仅适合〜250 µl体积，对于较大的等分试样，需要在更大的试管中将反应淬灭，然后转移到单个孔中进行后处理。

8.用3 × 200 µl 10％TCA，然后用3 × 200 µl EtOH洗涤S tep D 7a中的孔。

9.从洗井（一个或多个）小号TEP d 7b中，用5 × 200μl的2％SDS，5 × 200微升水中2 ö ，和5 × 200μl的EtOH中。用SDS洗涤是至关重要为祛瘀荷兰国际集团的蛋白质即与葡聚糖相互作用，因为它们与SEC分析干涉。

10.干下过夜孔中的过滤器一真空。

11.将过滤器从S tep D 8转移到用于LSC的液体闪烁瓶中，以确定在每个时间点反应中掺入的葡萄糖总量。请参阅步骤C10。

12.传输滤波器形成小号TEP d 9到1.5 -毫升螺旋盖小瓶中，并添加200微升的1M NaOH。

注意：使用50％w / w溶液中的新鲜稀释的NaOH。

13.短暂离心以确保该过滤器在该溶液中浸没井，然后在冰声处理-水浴中10分钟。

注意：较长的超声处理或在较高温度下进行超声处理可导致葡聚糖聚合物的降解更为显着，并影响葡聚糖产品的最终长度计算和洗脱曲线。

14.简言之离心机再次e是混合物和100微升转移至freash 1.5 -毫升小瓶中。

15.使用宽-孔吸管尖（或常规吸管尖与末端切断，以增加直径），掰开在溶液中的过滤器和再悬浮。

16.简短地离心混合物，再从管中移出约80 µl ，并在S tep D 14中与溶液合并。

17.在4°C下以16,000 × g的离心力将来自S tep D 16的混合溶液离心10分钟，以去除任何颗粒。

18.将150 µl上清液转移到HP LC样品瓶插入物中以进行SEC分析。

19.转移5 -微升的等份上清液到闪烁小瓶中，并且分析由LSC确定葡聚糖回收率。通常，我们可以回收60 ％至90％的放射性。

20.使用装有Acclaim SEC-1000色谱柱的ICS-5000 + DC色谱/检测器系统，在30°C下通过SEC-PAD-RC分析25 µl的每个样品。色谱法是通过用10 mM NaOH以0.3 ml / min的流速等度洗脱进行的，并通过PAD进行监测（金，Carbo，Quad波形）。

21.使用级分收集器，分馏EL ution每0.5分钟期间5 - 15分钟的色谱法，转移120 μl的分数至闪烁瓶中，并通过LSC分析，以确定在每个级分放射性葡萄糖。

22.要确定的标准曲线为calibrat的离子的SEC，注入支链淀粉标准P-82（昭和电工株式会社制），并在相同条件下分析如所描述小号TEP d 20。

23.将色谱数据从Chameleon软件导出到Excel中以计算样品的属性，如数据a分析B中所述。

数据分析

答：美国证券交易委员会的标准曲线

1.确定支链淀粉标准品在最大峰处的保留时间。

2. ü唱最大峰值分子量（Mp）由制造商提供的支链淀粉的标准，绘制日志的的支链淀粉标准的标准相对于保留时间（MP），以产生线性标准曲线（小号Ë E图4 ）。

图4.使用商业支链淀粉作为标准品的SEC-PAD的校准曲线。一。商业支链淀粉标准品P-800，P-100和P-10的代表性色谱图。括号中的数字表示标准的Mp。乙。与支链淀粉的标准曲线的标准相比，与该GS产品。经Chhetri等人的许可进行了修改。，（2020年）。

B. SEC-PAD数据分析

1.以文本格式导出用于GS测定的SEC-PAD数据，并绘制色谱图（图5A）。

2.计算SEC-PAD色谱图中每两个连续数据点之间的平均保留时间（t i ，图5B）。对于我们的实验中，这导致了2 ，400片（PAD数据收集每1/120个或多个）。

3.使用校准曲线d etermined在小号TEP A2，计算分子量（M我在平均滞留时间）（吨我）针对每个切片（图5B）。

4.通过取每个切片中两个PAD数据点的平均值来计算每个切片的平均PAD信号（P i ）（图5B）。

5.使用以下公式确定每个切片的面积（A i ）：A i = M i × P i 。

6.要确定感兴趣峰的总面积（A，图5C），请计算峰中所有切片的A i之和：A = ∑ A i 。

7.要确定感兴趣峰的每个切片i的重量分数（W i ），请将每个切片的A i除以峰的总面积（A）。

8.为了确定重均分子量（Mw），计算M的总和我× w ^我对所有在峰值切片：MW = Σ （M我× w ^我）。

9.要确定数均分子量（Mn），请用1除以峰中所有切片的W i / M i之和：Mn = 1 / ∑ （W i / M i ）。

10.计算样品的多分散指数（PDI）：PDI = Mw / Mn。

11.在MP，Mw和锰可以通过将每个被转化成聚合的最大峰度（XP），聚合（XW）的重均程度，以及数均聚合度（XN）的由聚合的葡萄糖的质量（C 6 H ^ 10 ø 5 ，162.14）。

图5.从SEC-PAD色谱图中确定葡聚糖分子量参数。一。色谱图以保留时间为x轴绘制。乙。分子量为x轴的A中色谱图的放大图。代表切片i突出显示。（C）以分子量为x轴绘制的色谱图。突出显示了用于确定聚合物长度参数的峰面积。

C.分析[R adioactivity数据

1.输入LSC读出用于在MS Excel以cpm的级分。调整RC相对于PAD的保留时间的延迟，该延迟是由PAD和馏分收集器之间的管路引起的。

2.使用UDP- [ 14 C] Glc的比放射性，将cpm转换为nmol，以确定掺入（1,3）-β - d-葡聚糖的Glc的量。切记在每个数据点的处理过程中针对淬灭体积，稀释度和产率回收率之间的差异进行调整。

D. SEC-PAD的覆盖的制备和[R adioactivity色谱

PAD和RC色谱图的叠加有助于对数据进行视觉评估。对于覆盖层，我们建立了一种定量方法，如下所述。

1.按照B节和C节（图6A）所述绘制PAD和RC色谱图。

2.计算RC色谱图每个数据点的PAD值和放射性之间的差（Di）。

3.计算感兴趣峰的Di，∑ （Di）2的平方和。

4.确定的缩放因子为最小化的PAD色谱Σ （Di）和2 。例如，5的缩放因子被确定为图6A中，因为5 ×放大率的PAD色谱最小化的Σ （Di）和2 。

5.使用比例因子，在PAD色谱图中调整y轴比例（图6B）。

图6.使用最小二乘函数近似法制备SEC-PAD和RC色谱图的叠加图。一。未经修改的原始PAD（实线）和RC（钻石）色谱图。D i代表数据点i处PAD和RC值之间的差。乙。PAD（实线）和RC（钻石）色谱图的比例调整重叠图。通过最小化（A）中的∑ （D i ）2来调整PAD色谱图的y轴。

笔记

制备2 ×检测缓冲液时，请记住将UDP-Glc与GS混合稀释2倍。
储存50％（w / w）的NaOH溶液，并使CO 2的暴露量最小，以最大程度地减少碳酸钠和碳酸氢钠对PAD分析的污染。
用脱气的ASTM I型水制备SEC-PAD-RC洗脱液，以最大程度地减少可能影响PAD响应本底信号的离子污染。

菜谱

40％无菌葡萄糖溶液
400 g（40％w / v）d - g葡萄糖

用diH 2 O调节至1 L

过滤-消毒

是的蛋白P右旋糖（YPD）培养基
2 0克p动物组织的eptic消化（肉蛋白胨）

10克ÿ东提取

对于固体培养基，添加20克一个GAR

用diH 2 O调节至950 ml

高压釜

加入50 ml （2％w / v）40％无菌葡萄糖溶液（过滤器灭菌）

0.5 M EDTA储备液，pH 8.0
186.12 g EDTA二水合二钠盐

用diH 2 O调节至800 ml

在冰水浴中将溶液冷却至4 °C

用NaOH调节pH值到8.0

调整体积至1 ，000个ml的与DIH 2 ö

破坏缓冲区
29.22克（0.5M）小号裂果Ç hloride

20 ml （10 mM）0.5 M EDTA储备液，pH 8.0

调整体积至1 ，000个ml的与DIH 2 ö

立即在使用前添加10 ml （1 mM）100 × PMSF的2-丙醇储备溶液（可在-20°C储存）。

膜缓冲液
50 mM Tris ，pH 8.0

10 mM EDTA ，pH 8.0

333.3 ml的（33％V / V）克lycerol

调整体积至1 ，000个ml的与DIH 2 ö

添加70.92 μ升（1毫摩尔）β巯基乙醇并冷却至4之前℃至使用

KF中号IX
200 mM Tris储备液，pH 8.0

4 mM EDTA储备液，pH 8.0

871.5毫克（0.3百万）KF

用diH 2 O将体积调节至50 ml

10％CHAPS，2％CHS期权
5克（最终含量的10％w / v）

超声处理溶于40 ml diH 2 O

加入1 g（最终2％w / v）CHS Tris盐

注意：发现CHS Tris盐比CHS更可溶。

超声处理约1小时，然后在室温摇动过夜

用diH 2 O将体积调节至50 ml

储存在-20°C

提取缓冲液
48 ml膜缓冲液

2 ml 10％CHAPS （最终含量0.4％）和2％CHS储备液（最终含量0.08％）

1毫米DTT

加入终浓度为4μM的GTPγS储备溶液

洗涤缓冲液
50 ml的È xtraction缓冲

5毫米UDP-Glc

2 ×检测缓冲液
10 mM（或任何合适的浓度）UDP- [U- 14 C] Glc（比活度约为800 cpm / nmol，或根据实验需要进行调整）

150 mM Tris ，pH 7.5

1.5毫米EDTA

1.5％（w / v）BSA

50毫米KF

0.04毫米GTPγS

10％三氯乙酸
100克TCA

加入diH 2 O至1 L

2％SDS
2克（2％w / v）SDS

加入diH 2 O至100 ml

致谢

这项工作WA Š资助的杜克大学医学中心和部分在普通医学科学格兰特R01 GM115729研究所（至KY）。美国国家过敏和传染病研究所（T32AI052080）的三机构分子真菌学和发病机制培训计划为AL提供了支持。作者感谢东京大学的Yoshikazu Ohya博士的抗Rho1p抗体和巴斯德研究所的Jean-PaulLatgé博士的抗Fks1p抗体。

该协议是在所使用的协议的详细版本一个最近的出版物由作者（刹帝利等人，2020 ）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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