材料和试剂

100毫米的文化培养皿（例如，Corning，目录号：353003）
0.2 -微米˚F ilters一个ND 50个升注射器（例如，GVS，目录号：FJ25ASCCA002DL01）
Ñ O操作。22 d ISP奥萨卜莱手术刀片（例如，斯旺-莫顿，目录号：0508）
50 -毫升（管例如，康宁，目录号：352070）
15 -毫升管（例如，康宁，目录号：352096）
10 -毫升d isposable塑料移液管（例如，康宁，目录号：357551）
25 -毫升d isposable塑料移液管（例如，康宁，目录号：357535）
24孔吨问题培养板（例如，Corning公司，目录号：353047）
30 ģ我nsulin小号yringes（例如，BD微细，目录号：324826）
塑料组织学模具（例如，Thermo Scientific，目录号：1830）
塑料包埋盒（例如，Simport ，目录号：M492-2）
组织学组织模具（例如，Simport ，目录号：M474-3）
用于组织学的显微镜载玻片（例如，Thermo Scientific，目录号：J1800AMNZ）
小鼠：v irgin雌性，7 - 10周龄，近交系C57BL / 6J（例如，Jackson实验室，目录号：000664）
乙醇（EtOH中），70％，95％，和100％（例如，VWR，目录号：83813）
磷酸盐-b uffer ED小号艾琳（PBS）（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：D1408）
Dulbecco氏米odified鹰米edium（DMEM）/ F12（例如，Gibco公司，目录号：21331-020）
牛小号erum一个lbumin（BSA）（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：A3608）
胎b绵羊小号erum（FBS）（例如，。Sigma-Aldrich公司，目录号：F0804）
胶原酶A（例如，Roche，目录号：11088793001）
胰蛋白酶（例如，Dutcher Dominique，目录号：P10-022100）
胰岛素（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：I6634-100MG）
庆大霉素（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：G1397）
谷氨酰胺（例如，Gibco公司，目录号：35050-061）
DNA酶I（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：D4527-40KU）
分散酶II（例如，罗氏，目录号：13 75 2000）
增长˚F演员-r得出基质胶® （例如，康宁公司，目录号：354230）
胰岛素吨ransferrin-小号elenium（ITS）（例如，Gibco公司，目录号：41400-045）
青霉素/链霉素（例如，Gibco公司，目录号：15140-122）
FGF2 （例如，Gibco公司，目录号：PM60034）
催乳素（例如，Sigma-Aldrich ，目录号：SRP4688）
氢化可的松（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：小号H6909）
催产素（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：O3251）
的RNeasy Micro试剂盒（例如，Qiagen公司，目录号：74004）
β-中号ercaptoethanol （例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：M6250 ）
磷酸酶抑制剂混合物II（例如，Millipore公司，目录号：524625）
RIPA缓冲液（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：R0278）
蛋白酶抑制剂混合物I（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：539131）
皮尔斯考马斯（布拉德福德）P rotein甲SSAY ķ它（例如，热科学，目录号：23200）
32％的多聚甲醛（PFA）（例如，电子显微镜科学，目录号：15714）
低胶凝温度的琼脂糖（例如，Sigma-Aldrich，目录号：A9414）
二甲苯（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：534056）
石蜡（例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：1071642504）
解离解决方案（请参阅食谱）
BSA解决方案（请参阅食谱）
基础ø rganoid米edium（BOM）（见配方）
形态发生培养基（请参见食谱）
泌乳培养基（请参见食谱）
PFA为4％（请参阅食谱）
RNA裂解缓冲液（请参阅食谱）

设备

手术工具
镊子（例如，Phymep ，目录号：11050-10和11051-10）

剪刀（例如，Phymep ，目录号：14088-10）

解剖板（例如，Thermo Scientific，目录号：36-119）
P1000移液器
层流罩
冰箱4°C（例如，利勃海尔（Liebherr），目录号：7083 001-01）
冰柜– 80°C （例如，Thermo Scientific，目录号：88400V）
液氮罐（例如，Air Liquide Espace 151，目录号：2433867）
在37°C下摇动培养箱（例如，Infors HT Multitron ）
离心机（例如，热电三英tific ，型号：SORVALL ST40）
用于细胞培养的培养箱，37°C，5％CO 2 （例如，Thermo Scientific ，型号：HERAcell 150i）
在37℃下加热板（例如，Techne公司DRI-块DB-2A）
显微镜和照相机（例如，奥林巴斯型号：CKX41）
纳米d ROP ™ （例如，Implen Nanophotomoter NP80）
超声仪（例如，Diagenode Bioruptor Pico）
培养箱中在65℃（例如，Memmert培养箱I）
嵌入工作站（例如，Leica EG1150C）

程序

乳腺主要类器官的分离
处女亩的夹层本身收获乳腺（SE ë V记意1）。

视频1.收集乳腺。该视频是在巴斯德研究所制作的。根据从指引的规定研究所巴斯德动物保护委员会（CETEA）。。在动物保健的批准，符合欧共体理事会指令（A 75-15-01-3法国立法）。

使用符合道德规范的方法（例如，颈脱位）安乐死供体小鼠，并立即进行乳腺收集。
注意小号：

颈椎脱位是一种常见的方法对动物实施安乐死，并提供š快速，无痛的死亡。使用这种方法，如果立即收集，则不会改变培养物中细胞/组织的存活率。
在处理多个小鼠的情况下，一个安乐死动物和搜集的腺体立即，然后继续到下一个动物。
通过在皮肤上喷洒70％的乙醇对动物的腹侧进行消毒。
注意：消毒后，请在层流通风橱内工作以保持无菌状态。的无菌工作程序的应用程序，与存在一起抗真菌剂和抗生素补充（在消化溶液庆大霉素;青霉素和链霉素中培养MEDI微米）将防止污染的发生。

销通过它的四只爪子鼠标到夹层板，与腹部朝上病房（见图1A，销1 - 4）。
使用镊子，紧紧GRA用上皮肤ø ˚F一半的宽度腹部的下部（参见图1A，点A）。
用手术剪，使第一切口我ñ在A点的皮肤
注意：小心只切开皮肤，不要使下面的腹膜破裂。

继续从动物的喉咙开颅切开皮肤（参见图1A，从A点到B点）。
从该中间线，使用镊子GRA SP皮肤和切口朝向四个爪的（参见图1A，用切口加入所述中间线来分C，d，E或F ，分别）。
用镊子和棉签轻轻地将动物的一侧的皮肤与腹膜分开。用三个销钉将皮肤连接到解剖板上（请参见图1B，销钉5 – 7）。
对动物的另一侧重复步骤8（见图1B，销8 - 10）。第m ammary腺现在露出。
鉴定乳腺的淋巴结腺＃4（一个小的致密结构，圆在形状;参见图1B，包围）。ř EMOVE淋巴结使用镊子和剪刀和废弃都腺体。
继续收获＃3和＃4乳腺。使用弯钳，克锉刀乳腺，轻轻地分隔符从皮肤和其他组织机智Ë他们ħ剪刀。
注：仔细分离乳腺＃3（发白和光泽）从肌肉（浅棕色棱纹的结构），因为该协议并没有防止肌肉污染。

P花边在相同的无菌皮氏培养皿含有冷PBS所有收集的腺体（一个pproximately 3 ml的，先前存储在4℃下）为洗荷兰国际集团之前组织处理。
正确处置动物尸体，并继续进行乳腺的机械和酶解。
机械和酶解离
提醒：在层流罩内工作以保持无菌状态。

新鲜制备出10 ml的解离溶液的四个压盖小号从一只小鼠收集，传递通过0.2 - μ在37微米的过滤器，并预热℃。
注意：不要超过最大30毫升中分离溶液一个50 -毫升管，以确保正确解离。

将新鲜收集的乳腺转移到新的无菌培养皿中。
用三个手术刀将乳腺切碎，并均匀切碎1 - mm 3的乳腺碎片（见图1C）。
转移剁碎到50 -毫升包含预温热解离溶液管。
放置管我Ñ在37℃，100rpm下进行30分钟的振荡培养箱中。
笔记：

除与分散酶孵育外，以下所有步骤均在室温下进行。
从这里开始，用2.5％BSA溶液预涂所有移液器，吸头和试管。制备BSA溶液，在50 -毫升管和抽吸/删除从每消耗品以下涂层; Ť他将防止粘性和组织体的损失。所述然后BSA溶液可以被过滤，储存在4℃下，并重新使用。
温育后，重悬由离解的乳腺进行10向上和向下运动，用10 -毫升移液管。以400 × g离心10分钟。
甲压脚提升离心，手柄50 -毫升管小心，以防止三个分离层的干扰（浏览F igure 1C）。保持上皮沉淀完整和中间水相和顶部脂肪层转移到干净的15 -毫升管中。
重悬沉淀上皮5 ml的DMEM / F12和设置它放在一边。
着眼于脂肪和水溶液š在15 -毫升：管再悬浮通过执行10向上和向下运动，用10 -毫升移液管TE。以400 × g离心10分钟。
注意：该步骤允许恢复Y的EP ithelial片段被困在脂肪层。

再次，把手15 -毫升管小心以避免扰乱三个分离层。丢弃脂肪层和水层。
采取第E（5）毫升ř esuspended粒料从50 -毫升管以重悬浮在15沉淀-毫升管中。
洗50 -毫升用5管毫升DMEM / F12 ，池在15悬浮液-毫升管，并混合。
以400 × g离心10分钟。
丢弃上清液。用4 ml DMEM / F12重悬沉淀。随后，加入80微升DNA酶在100 I微克/毫升并搅拌5分钟通过手或上以100rpm的轨道摇床。
加6毫升DMEM / F12和重悬由溶液进行5向上和向下运动，用10 -毫升移液管。
以400 × g离心10分钟。
丢弃上清液。使用4 ml DMEM / F12重悬沉淀。接着，添加150 μl的分散酶以0.5mg / II毫升孵育为5分钟，在37℃。
加6毫升DMEM / F12和重悬由溶液进行5向上和向下运动，用10 -毫升移液管。
以400 × g离心10分钟。
丢弃上清液。将沉淀重悬于9 ml DMEM / F12中。
执行差异离心分离的乳腺上皮细胞从基质部分：Ç entrifuge悬浮液15秒，在室温下，400 ×克。丢弃含有上清液的基质部分，重悬沉淀上皮9 ml的DMEM / F12。
注意：将离心机上的时间设置为1分钟。一旦达到400 × g的速度，则精确计时15 s，并手动停止离心机。

重复上一步骤（t）4次，总共进行5次差异离心，以有效去除基质污染。
将最终沉淀重悬于1 ml基础类器官介质（BOM）中，并置于冰上。邻rganoids是现在准备要凑nted和培养。
注意：甲djust重悬浮的体积根据粒料尺寸。从2的池- 3只小鼠，将最终的沉淀重悬于1 ml的基肥类器官培养基，为3的预期范围，000 - 6 ，000类器官。调整BOM的体积为resuspen的锡永根据汇集的小鼠的数目沉淀。

图1.用于类器官分离和3D培养的乳腺采集的关键步骤。A ，B 。图片鼠标清扫访问牛逼他乳腺。A.针1 - 4代表点š处到引脚鼠标。针5 -图7和8 - 10代表点小号处到引脚的小鼠的皮肤。带蓝色虚线的字母A – F表示切口。B. ģ颖虚线表示的乳腺。淋巴结用红色表示，必须将其切除。C.乳腺前（左面板），并用切碎后（中图）腺一个手术刀。转让后乳腺组织体以解离MEDI微米（右图）。D.乳腺类器官计数的例子。左侧面板：直径：rganoids包围由虚线表示。星代表神经。右图：Ø在嵌入后rganoids中号ATRIGEL ® 。箭头表示的边缘的中号ATRIGEL ®圆顶。比例尺= 500 μ米。E.新鲜分离的主要类器官。左侧面板：图像乳腺组织体上每天1后的隔离。中图：苏木和伊红染色的一类器官在第1天后隔离。右图：我mmunofluorescen CE染色显示出荷兰国际集团的肌上皮（角蛋白5的分布+ ，绿色）和管腔细胞（角蛋白8 +在类器官，红色）上天1后的隔离。赫斯特，蓝色（原子核）。比例尺= 100 μ米。

类器官计数
提醒：在层流罩内工作以保持无菌状态。

d生两个大杂交用标记ö Ñ显微镜载玻片。
采取类器官悬浮液，并使用P 1000移液器执行五次上下运动以使其均质化。
在玻片的背面，在每个十字的中心周围散布10μl溶液。
注：使用20 -微升尖或切10的末端-微升提示，以避免大的组织体进行来临被困。

算机关ø IDSù的nDer显微镜在4 ×放大倍数（见图1D）。
注意小号：

以交叉的每个季度的一个里程碑，以避免重复-同一个组织体计数。
类器官呈圆形结构，周边光滑。偶尔和事无巨细，神经和血管内皮细胞都还存在。神经小号出现如绳索状结构，并且可以在束被组织（参见图1D）。内皮有一个比较有点衣衫褴褛的外观与光滑的外观类器官。初级神经和内皮细胞的少量存在不会干扰类器官的泌乳或退化。
只计算了一个直径类器官伟大超过30 ER - 50微米，因为在较小的中号AY不能正常发育。
计算平均值两者的计数在10微升溶液中，乘法根据VOLU BOM的我用于重悬沉淀，以获得所述类器官的总数。
注意：将新鲜分离的有机anoids可以在FBS中的溶液被可行地冻结含10％DMSO的长-在LIQ长期储存UID NITR蛋白原和以后使用。

B.乳腺类器官的3D培养

嵌入在基质胶®
提醒：在层流罩内工作以保持无菌状态。洗冰桶和加热板用70％彻底EtOH中之前PLAC EMENT在层流罩。

解冻的基质胶®在冰上或4℃。
笔记：

基质胶®凝固的真快于室温。在使用前和电镀过程中，请始终将其放在冰上。
请记住，基质胶®解冻需要时间; 吨herefore，开始解冻之前的步骤（对于1 2小时-毫升等分试样，对于10 6小时-毫升瓶）。
将24孔板放在冰上。计算所需井和蔓延20号-微升基质胶在每个孔的底部一个圆形贴片® 。
注：开始通过将尖端含基质胶®在井的中心并朝向井的边缘圆扩大，而不触及他们。

在细胞培养箱（5％CO 2 ）中于37°C孵育24孔板15分钟。
同时，将加热板预热到37°C 。
制备的中类器官悬浮的基质胶® ：Ç alculate类器官悬浮液的体积需要获得的类器官的期望数量。吸管这个体积悬浮液的到新鲜1.5 -毫升管中并离心3分钟，在400 ×克。
注意：调节类器官的每取决于实验的类型以及数量：每孔200类器官用于形态学和组织学，400为基因表达，和1000瓦特西部时代印迹廷分析。

小心除去上清液，然后将试管放在冰上。随后，小心地重新悬浮在冷的所需体积颗粒基质胶® （50微升每孔），避免气泡形成。保持冰上。
从细胞培养箱中取出24孔板，放在37°C的加热板上。
在每一个基质胶® -预涂井，谨慎种子类器官的悬浮液（在基质胶®）作为一个拱顶之上的固化的基质胶®补丁。
放置24孔板回到细胞培养箱（5％CO 2 ）30分钟，在37℃以固化该基质胶® （见˚F igure 1D）。
同时，在37°C下预热BOM。
以下温育后，小心地加入1毫升预热BOM至在37℃，5％CO每个孔中并培养在细胞培养箱2 。
注意小号：

添加mediu中号对井的边缘的圆顶避免影响。
可以执行类器官的表征使用常规的组织学染色剂（例如，苏木精和曙红）或免疫染色在一天1后在BOM恢复（参见图1E和步骤的程序的B2）。
FGF2的形态发生
提醒：在层流罩内工作以保持无菌状态。

注意：过量回收对于类器官培养是最佳的；然而，FGF2治疗可以施用立即电镀后的Ò rganoids。

将BOM预先加热到37°C。
添加新鲜FGF2在一个终浓度的2.5 nM的至预加热的BOM ，得到形态发生平台。
从吸孔中的介质不接触的Matrigel ®圆顶，并用800替换微升新鲜形态平台。
每3天用新鲜的形态发生培养基更新所有培养基，共6天。
催乳素的致乳剂分化
将BOM预先加热到37°C。
将1μg / ml催乳素和1μg / ml氢化可的松添加到预热的BOM中以获得泌乳培养基。
从吸孔中的介质不接触的Matrigel ®圆顶，并用800替换微升新鲜泌乳平台。
每两天用新鲜的泌乳培养基更新所有培养基，共进行4天的治疗。
催产素使肌上皮细胞收缩
准备新鲜的泌乳培养基，过滤，并在37°C下预热。
向泌乳培养基中添加40μg / ml重组催产素。
从吸孔中的介质不接触的Matrigel ®圆顶，并用800替换微升补充有催产素新鲜泌乳平台。
使用活细胞成像，每秒记录收缩图像120秒钟。
通过荷尔蒙戒断模仿内卷
将BOM预先加热到37°C。
从吸孔中的介质不接触的Matrigel ®圆顶，并用800替换微升新鲜BOM。
每两天用BOM更新所有培养基，共处理8天。
重装
注意：使用预先涂有2.5％BSA的吸头。

Aspir吃的上清液和洗各孔用800两次微升冷PBS。
添加1 ml的冷PBS中，并破坏基质胶® d OME使用向上和向下运动有P 1000移液管。
检查为成功瓦解的基质胶®在显微镜下。
传送该悬浮液以15 -毫升管中并添加冷PBS至总体积10毫升。
以400 × g离心3分钟。
小心取出的上清液，重悬的器官样沉淀在新鲜的基质胶®如B1所述和板。
C.类器官处理以作进一步分析

注意：我们建议您仔细以下之前，在显微镜下组织体的发展更新的媒体。形态与FGF2应当诱导后3支化-处理4天后，同时与BOM培养类器官只，作为所述阴性对照，应保持圆形。生乳分化Ç的确认通过CSN2 mRNA的分析使用前和治疗催乳素（D6与D10）后的qPCR，比较类器官。第i nvolution处理c的也可以确认使用qPCR的通过检测以下催乳素戒断（D10 CSN2 mRNA的表达减少与D18），或者在形态学水平通过分支的逐渐消失（参见图2B和图3B）。

Figu重新2.建模泌乳和复古样在原代乳腺类器官的过程。一。方案d总结了实验设计。B.泌乳和类似内卷过程中主要乳类类器官的形态。类器官形态的亮场图像以下形态发生和生乳的刺激和天4或8激素停药后。比例尺= 100μm。

图3. Passag Ë复旧状的类器官。A.描述实验设计的方案。PRL：催乳素；BOM：基础类器官介质。B.在泌乳和内卷样过程中传代的类器官的形态。明通道1（上图）和通道2（下图）的图像类器官以下形态发生和生乳的刺激和对天4或8激素停药后。比例尺= 100μm 。

RNA分离
注：嵌入在基质胶®不提取RNA的质量干扰。

吸出培养基。
甲DD 350微升RLT缓冲液（RNeasy试剂Micro试剂盒）contiaining 3.5微升β-巯基乙醇至各孔中。
用p崩解在裂解缓冲液的器官样培养erform荷兰国际集团10向上和向下运动有P 1000移液管。
Transfe r是溶液至新鲜的1.5 -毫升管中并涡旋良好。
注意：样品可以在– 80°C下保存，直到提取RNA。要进行RNA提取，请在冰上解冻样品，然后按照以下说明进行操作。

均化RNA裂解物通过执行10向上和向下以运动的单个-使用为30G胰岛素注射器。
从S tep C1 b开始，按照RNeasy Micro Kit手册中所述处理样品。
测量的使用RNA浓度纳米d ROP ™ 。
2.蛋白质提取

注：嵌入在基质胶®干扰小号与西方印迹婷分析。请按照以下步骤删除的基质胶®之前蛋白提取。

吸培养基和离解与800 3D培养微升冷PBS补充有磷酸酶抑制剂混合物II。
转移悬浮液到一个干净1.5 -毫升在400管和离心3分钟×克，4℃。
用补充有磷酸酶抑制剂鸡尾酒II的PBS冲洗两次。
丢弃上清液，然后将沉淀重悬于100μl冰冷的即用型RIPA缓冲液中，该缓冲液中添加了蛋白酶抑制剂鸡尾酒I和磷酸酶抑制剂鸡尾酒II。
注意：小号amples可以储存在- 80℃直至蛋白质提取。要进行蛋白质提取，请在冰上解冻样品，然后按照以下说明进行操作。

超声处理的样品小号两次用60在4℃ -千赫超声波频率程序（30秒开/ 30秒关）。
涡旋样品，在冰上冷却，并重复在根据超声处理小号TEP C2即
在> 10,000 × g ，4°C下离心20分钟。
转移的上清液到一个干净的1.5 -毫升管中。
测量的使用的蛋白质浓度考马斯P rotein甲SSAY ķ它。
3.组织学的固定和嵌入

吸出培养基和冲洗培养用800两次微升冷PBS 。
与800μl4 ％PFA孵育30分钟。以下祛瘀的人的4％PFA，用PBS洗两次。
笔记：

解决方案应完全覆盖圆顶。如果需要，可以增加更大的音量。
固定的培养物可在4°C下保存在PBS中直至包埋。
制备3％的低胶凝温度琼脂糖在PBS中并在微波中慢慢融化为1.5 - 2分钟一吨1000 W（均质化每30秒通过手旋转）。
用刮刀的平坦侧面分离固定培养物，转移到含有融化的琼脂糖的塑料组织学模具中。O含更多琼脂糖。
琼脂糖固化后，unmold块。使用手术刀去除的前塞斯琼脂糖周围的基质胶® d OME在塑料包埋盒的组织学和地点。
前进到样品脱水：我ncubate在连续的1个的包埋盒- 70％H浴的EtOH ，95％EtOH中，100％的EtOH （两次），二甲苯（两次），50％二甲苯50％熔化的石蜡，和100％熔化的石蜡。
在100％熔融石蜡的第二个浴中于65°C孵育过夜。
嵌入在一个使用一个嵌入工作站组织学组织模具。
Unmold的凝固的24小时后的石蜡块。
切5 -微米的部分，并在显微镜玻片上蔓延。保持在室温下滑动，直到进一步的分析。
除去所述石蜡之前通过连续5任何染色-二甲苯的分浴池（两次），100％EtOH中（两次），95％的EtOH ，70％EtOH中，和H 2 O.

菜谱

解离溶液
注：T他的解决方案是在层流罩内准备在无菌条件和并不需要是过滤-消毒。

2 mg / ml胶原酶

2 mg / ml胰蛋白酶

5微克/毫升胰岛素

50微克/毫升庆大霉素

5％FBS

2 mM谷氨酰胺

在DMEM / F12中

BSA解决方案
注：T他的溶液可以是过滤器-消毒和当储存在4℃下重复使用多次。

PBS中2.5％的BSA

3.基底ø rganoid米edium（BOM）

注：T他的解决方案是在层流罩内准备在无菌条件下，并不需要为过滤-消毒。

1 ×我nsulin -转铁蛋白-硒（ITS）

100 U / ml青霉素

100微克/毫升链霉素

2 mM谷氨酰胺

在DMEM / F12中

4.形态发生培养基

注：T他的解决方案是在层流罩内准备在无菌条件下，并不需要为过滤-消毒。

BOM中的2.5 nM FGF2

5.泌乳培养基

注：T他的解决方案是在层流罩内准备在无菌条件下，并不需要为过滤-消毒。

1微克/毫升的催乳素

1微克/毫升氢化可的松

在物料清单中

6. 4％PFA

注：T他的解决方案是一种化学罩内准备并不必是过滤-消毒。

PBS中4％的对甲醛

7. RNA裂解缓冲液

注：T他的解决方案是一种化学罩内准备并不必是过滤-消毒。

10微升β-巯基乙醇每1 ml的RLT裂解缓冲液（来自所述的RNeasy微型ķ它;这个解决方案可以被存储为长达一个月在室温下）。

8.磷酸酶抑制剂混合物II

注：T他的解决方案是一种化学罩的长凳内或准备，也不需要将过滤-消毒。

2 mM咪唑

1 mM氟化钠

1.15毫钠钼酸

1个mM的钠原钒

4 mM酒石酸钠二水合物

在RIPA缓冲区中

9.蛋白酶抑制剂鸡尾酒I

注：T他的解决方案是一种化学罩的长凳内或准备，也不需要将过滤-消毒。

500 μM AEBSF盐酸盐

150 nM抑肽酶

1 μM蛋白酶抑制剂E-64

0.5毫米EDTA

1 μM亮肽素半硫酸盐

在RIPA缓冲区中

致谢

在HL的实验室工作是由巴斯德资助，中心国家倒拉RECHERCHE的法新社国立德拉RECHERCHE （ANR-10的LabX-73和ANR-16 CE13-0017- 01），基金会ARC（PJA 20161205028和20181208231 ），计划Barrande ，以及AFM-马拉松式节目基金会。AC由Revive财团的博士后研究金资助。EC由一位博士资助。来自索邦大学的研究金。ZK是由马萨里克大学（MUNI / G /二千〇一十八分之一千四百四十六），移动性补助由教育部的资助局资助和青年和体育，并从医学MU的学院资金的初级研究员ROZV / 28（/ LF / 2020）。JS由P-Pool（MU大学医学院）和Masaryk University的Grant Agency（MUNI / A / 1565/2018）资助。

该方案源自原始研究论文“泌乳和复旧的原始乳腺类器官模型” （Sumbal等人，2020b）。

利益争夺

作者宣称他们没有竞争利益。

伦理

动物研究是审查和符合欧共体理事会指令（A 75-15-01-3）和规定法国法律认可的研究所巴斯德动物保护委员会（CETEA）。

参考

Artegiani，B.和Clevers，H.（2018）。 3D类生物技术的使用和应用。哼哼Mol Genet 27 ：R99-R107。
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