材料和试剂

适用于SARS-CoV-2的个人防护设备（PPE）
0.2毫升低-轮廓PCR管条带与盖（生物- - [R广告，目录Ñ棕土小号：TLS0851和TCS0903）
1.5 ml微量离心管（Axygen ，目录号：MCT-150-CS ）
0.5-10 µl，0.5-50 µl，1-200 µl，100-1和000 µl过滤的移液器吸头（Axygen ，目录号s ：TF -400-RS，TF-50-RS，TF-200-RS，TF -1005-WB-RS ）
Geneaid病毒核酸提取试剂盒（Geneaid Biotech，目录号：VR300）
Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen，目录号：69506）
具有Platinum TM Taq DNA聚合酶的SuperScript TM III一步式RT-PCR系统（Invitrogen，目录号：12574-026 ）（等分并在-20°C储存）
DNA酶-和核糖核酸酶-游离水（集成DNA技术，目录号码：11-05-01-04）（分装成干净1.5 -毫升微量离心管）
SARS-CoV-2的引物（整合DNA技术）（表1）

表1.干扰RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP ），SARS-CoV-2检测的引物和探针

目录号

寡核苷酸

顺序b

CV001

RdRp_SARSr -F

5'-GTGARATGGTCATGTGTGGCGG-3'

CV002

RdRp_SARSr -R

5'-CARATGTTAAASACACTATTAGCATA-3'

CV101

RdRP_SARSr-P1

5'-FAM-CCAGGTGGWACRTCATCMGGTGATGC-BBQ-3'

CV102

RdRp_SARSr-P2

5'-FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BBQ-3'

一个寡核苷酸序列是从WHO-适于查理特协议（科尔曼等人，2020）。

b W是A / T；R为G / A；M是A / C；S是G / C。FAM：6-羧基荧光素；烧烤：黑莓淬火器。

底漆混合物（请参见食谱）

设备

1微升10微升，10微升-100微升，20微升-200微升，100微升-1 ，00 0微升移液器仪（Eppendorf，目录号小号：3123000020，3123000047，3123000055，3123000063）
CFX96实时系统（Bio -R广告，米Odel等：C1000触摸）
热铝熔池（精细PCR，米Odel等：ALB128）与其一起使用的Qiagen公司的DNeasy血液和组织试剂盒
5425离心机（Eppenddorf ，目录号：5405000417）

程序

所有程序在阳性样品池，（C）的（A）的样品池，（B）制备- [R ibonucleic酸（RNA）提取，和（d）定量逆转录聚合酶链式反应（RT- q PCR）分别进行在不同的生物安全柜内。在将所有临床废物和消耗品送入焚化炉之前，先对其进行高压灭菌。

样品池（见图1）
由于我们实验室的阳性检出率低于2％，因此我们选择了10个样品池。您可以根据实验室y中的阳性检出率优化样品池大小（Abdalhamid等，2020）。
移液管60微升的每个的10个临床NP / OP拭子成一个单一的1.5 - ml离心管。Ť他吨otal体积为600微升。标本的原始体积为1毫升至3毫升。
等分试样300微升汇集拭子至每2清洁1.5 - ml离心管S和L具有相同的样本ID阿贝尔。

图1.合并10个单独的样本

制备阳性样品池
识别一个positiv Ë具有NP / OP拭子ç Ť值≥15.00但≤36.00（参考到表S2中廉等人，2020）。
分装鉴定出的阳性NP / OP拭子，并保存在-20°C 。
制备的阳性样品池accordin g至小号通过混合1个正依照步骤A2-A3与9个未知样品。

RNA提取
选择以下任一试剂盒进行RNA提取
Geneaid病毒核酸提取试剂盒
添加400μl的VB裂解缓冲液到每个1.5 -毫升微量离心管中。剧烈摇动试管10秒钟。
在室温下孵育10分钟。
添加450微升缓冲液AD（确保该乙醇ħ作为被加）到各1.5 -毫升微量离心管中。剧烈摇动管子进行混合。
转移700微升溶胞产物混合物到VB Ç olumn在2 -毫升ç ollection吨UBE。以14,000 × g离心30 s 。丢弃流出液并放置在VB柱回至2 -毫升ç ollection吨UBE。重新泥炭步骤（iv），直到所有的混合物（2个1.5 - ml微量制备管步骤A3 ）已经完全通过VB柱流动。
微升W1缓冲区添加400到VB Ç olumn和在14,000离心×克30和小号。丢弃流出液和放置VB Ç olumn回到2 -毫升ç ollection吨UBE。
加入600微升洗涤液（确保了乙醇^ h作为被添加的）VB Ç olumn。以14,000 × g离心30 s 。丢弃流出液并放置VB Ç olumn回到2 -毫升ç ollection吨UBE。
以14,000 × g离心3分钟以干燥色谱柱基质。
放置干燥VB Ç olumn在一个干净1.5 - ml离心管。添加35微升DNA酶不含RNase的瓦特亚特到VB的中心Ç olumn矩阵和我ncubate 3分钟在室温下（15 - 25°C）。
以≥6,000 × g的速度离心1分钟以洗脱纯化的核酸。
Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒
移液管20 μ升蛋白酶K到每个1.5 -毫升微量离心管中。
加入200 μ L缓存AL和M用力摇晃九彻底。
在56 °C下孵育10分钟。
加入200μl乙醇（96 - 100％）和米剧烈振摇IX彻底。
吸取忒700μl的混合物制成的DNeasy置于2赠送离心柱-毫升收集管中。离心≥6 ，000 ×克1分钟。重复步骤（v），直至所有的混合物（2个1.5 - ml微量制备管步骤A3 ）已完全通过旋转柱流动。丢弃流通液和收集管。
放置所述旋转柱为干净2 -毫升收集管中。
加入500μl缓冲液AW1和c entrifuge在≥61分钟，000 ×克。
丢弃流通液和收集管。
放置旋转柱在一个干净的2 -毫升收集管中，加入500μl缓冲液AW2 ，与离心3分钟，在14000 ×克。
丢弃流通液和收集管。
传递所述旋转柱为干净1.5 - ml离心管。
洗脱通过加入35微升RNA DNA酶-和RNA酶-游离水到离心柱膜的中央。孵育3分钟在室温下（15 - 25°C）。
离心1分钟，在≥6 ，000 ×克洗脱纯化的核酸。

RT- q PCR
1.准备所述的RdRP -Primer /探针混合物（10μM）（见ř ecipe）。

2.准备3个测试：（1）阳性样品池；（2）非模板控制（NTC）；和（3）未知样本池。

3.准备的RT- q使用PCR混合物的的SuperScript TM III单步RT-PCR，用系统铂TM Taq DNA聚合酶，如表2中所述。

表2 。RT- q PCR混合物的制备

试剂

最终Ç oncentration

一个反应的体积（微升）

2 ×反应缓冲液

1 ×

10.0

SuperScript TM III RT /白金TM Taq混合物

--

0.5

的RdRP -Primer /探针混合物（10μM）

2微米

1.0

纯化的核酸（10样品池）一

--

8.5

总容积

20.0

一个替换纯化核酸与DNA酶-和RNA酶-游离水为NTC。

4.运行的RT- q如下所述PCR循环：

55°C 15分钟

95°C 2分钟

95°C持续15 s和56°C持续30 s进行50个循环

数据分析

解读为此并记录结果使用以下标准（见备注说明）：
如果C T值≤14.00，则视为污染。重复合并的纯化核酸的RT- q PCR。当检测到相同的C的Ť在值的重复RT- q PCR，解卷积正池（多个），并重复所述核酸提取和RT- q从正池（一个或多个）在个别样品PCR。测试结果由确认一个常规RT- q上的单个样品PCR临床试验。
如果C Ť值是> 14.01但≤45，记录Ç Ť值，并考虑SARS-CoV的-2的阳性检测的合并样品英寸解卷积阳性池，并对来自阳性池的单个样品重复核酸提取和RT- q PCR。测试结果由确认一个常规RT- q上的单个样品PCR临床试验。
如果Ç Ť值是≥45.01或没有C Ť值我š检测，记录汇集样品为阴性。在该池中，每个单个样本都报告为阴性。
电子分析xample被示于表3 ，4 ，和5（提取数据集S1从林等人。，2020）。在这里，我们简要描述表3-5中显示的数据。
2020年4月6日，要提取的标本总数为101个（包括内部阳性对照）。我们根据执行的示例池小号TEP小号A1-甲3.群组AI是池10 ，而组J和K分别为分别为5（总体积300微升）和6（总体积360微升）的池，。所述RNA瓦特作为提取从所述每作为合并样品小号TEPS C1a.i-IX。的RT- q PCR是按照执行小号TEPS D1- d 4.汇集测试结果一重新表3所示SARS -CoV-2中检测ģ roups I和J.个人从两组再次被单独提取样本根据该制造商的方案和RT- q PCR是按照执行小号TEPS D1- d个别测试的结果4.一个再在表4和5所述的用于ģ分别roups I和J，。

表3. 2020年4月1日。IMUCOVID-19汇总的测试结果

没有。

团体

合并样本（10个样本），IMU参考号

合并样品的实时RT- q PCR结果（C T值）

进行个别测试

1个

一种

1276年- 1285年

没有检测到

不

2个

乙

1286年- 1295年

没有检测到

不

3

C

1296年- 1305年

没有检测到

不

4

d

1306年- 1315年

没有检测到

不

5

E

1316年- 1325年

没有检测到

不

6

F

1327年- 1336年

没有检测到

不

7

G

1337年- 1346年

没有检测到

不

8

H

1347年- 1356年

没有检测到

不

9

我一个

1458年- 1466年

（9个样本+内部+ ve控制）

检测到COVID19（23.71）

是的

10

Ĵ b

1467年- 1471年

检测到COVID19（40.16）

是的

11

ķ b

1472年- 1477年

没有检测到

不

一个的Grou p我制备按照步骤B3，与一个内部阳性对照（9个样品+ 1掺入内部+已经控制）。

b组J和K分别为5个（总体积为300 µl）和6个（总体积为360 µl）的池。150微升（J组）和180微升（组K）的等分试样移液到2个1.5 -毫升微量离心管中按步骤A3。

表4 。合并组I的单独测试RT- q PCR结果

第一组

IMU参考号

C T值

合并测试（第1步qRT -PCR）

个体（第二次qRT -PCR）

1个

1458

检测到COVID19（23.71）

没有检测到

2个

1459

没有检测到

3

1460

没有检测到

4

1461

没有检测到

5

1462

没有检测到

6

1463

没有检测到

7

1464

没有检测到

8

1465

没有检测到

9

1466

没有检测到

10

我nternal +已经控制

检测到COVID19（23.23）

表5.单独测试RT- q PCR结果池编J组

J组

IMU参考号

C T值

合并测试（1 ST RT- q PCR）

单个（第二次RT- q PCR）

1个

1467

检测到COVID19（40.16）

没有检测到

2个

1468

没有检测到

3

1469

没有检测到

4

1470

没有检测到

5

1471

没有检测到

笔记

ç牛逼v ALUE ：我们选择了Ç牛逼v ALUE切-关闭基于我们的初步数据所获得optimiz荷兰国际集团的池。我们注意到，合并后较弱的正C T值38可能增加到40 ; 吨HUS，我们建议Ç Ť值切-关闭的45维护的检测方法的准确性和精确度。考虑任何合并的样品为阳性，与Ç Ť值来检测低于45 ，将需要为准确的报告被单独测试。请参阅表3中提供的示例。

配方小号

底漆混合
准备每条引物和探针的浓度为100 µM
底漆/探针混合物（100 µl）：
RdRp_SARSr -F 10 µl（最终浓度10 µM）

RdRp_SARSr -R 10 µl（最终浓度10 µM）

RdRP_SARSr-P1 10 µl（10 µM最终浓度）

RdRp_SARSr-P2 10 µl（10 µM最终浓度）

DNA酶-和核糖核酸酶-游离水60微升
分装并储存在-20°C

致谢

这项研究得到了马来西亚国际医科大学（IMU）的资助（IMU 477-2020）。我们感谢国家公共卫生实验室（NPHL），闵我ST [R健康马来西亚的Ÿ的慷慨和共享所必需的试剂进行实验室测试支持。该协议源自我们先前的工作（Lim等，2020）。

利益争夺

作者声明在本文的研究，著作权和/或出版方面没有潜在的利益冲突。进行这项研究时，没有公司投资研究，也没有商业化的打算。

伦理

这项研究获得了国际医科大学联合研究和伦理委员会的伦理许可（EC / IRB参考号4.41 / JCM-196 / 2020）。在这项研究中使用的所有临床标本完全anonymi ž编辑和分配新的实验室参考号码deidentified小号之前访问被赋予给研究人员。研究人员对患者的信息视而不见。

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