材料和试剂

1. T-75细胞培养瓶

2.血清移液器（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-676-10F和13-676-10M）

3.隼TM锥形离心管小号（赛默飞世尔科技，产品目录号：14-959-53A）

4. 1立方厘米Exel的我nsulin小号yringes（28克，1毫升，费舍尔，目录号：14-841-31）

5. BD 1米升我nsulin小号yringe与小号唇吨IP（费舍尔，目录号：22-253-260）

6.无菌过滤器吸头

7. Eppendorf TM管（各种尺寸）

8.盖玻片

9. 31 G一次性胰岛素注射器（BD ，目录号：324921）

10. Parafilm TM M PM996通用实验室胶片

11. MilliporeSigma TM小号利卡克EL 60G TLC p酸酯，克小姑娘-b被ACK （MilliporeSigma ，目录号：1.00384.0001）

12. 26 G × ¾”鼠尾静脉Mon oject IV导管（帕特森兽医，目录号：07-836-8403）

13. BALB / c小鼠：女性，4 - 6周龄（Invigo或Ť他杰克逊Laborator Ý ）或另一应变适合于所选癌细胞系

14.鼠三重-阴性的乳腺癌细胞系表达荧光素酶：4T1-GFP-吕克（ATCC）或其他癌细胞系

15.盘状多孔硅颗粒（iNPG ）和pDox纳米颗粒（内部制备）或其他选择的胺改性纳米颗粒（Xu等人，2016）

16. 2-S-（4-异硫氰酸根合苄基）-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（p-SC-Bn-NOTA）（Macrocyclics ，Dallas，ID：B-605）

17. 0.9％小号裂果Ç hloride我njection USP，将100ml ˚F生病在150ml PAB ® （贝朗，NDC号码：00264-1800-32）

18.无菌去离子水

19.磷酸盐-b uffered小号艾琳（PBS）溶液，pH 7.4（赛默飞世尔科技，产品目录号：10010023）

20. 100毫升˚F ILTER -灭菌的50mM EDTA溶液

21. N，N'-二甲基甲酰胺（DMF; MiliporeSigma，目录号：227056-100ML）

22.二甲基亚砜（DMSO; MiliporeSigma ，目录号：317275-100ML）

23.二异丙基乙胺（MiliporeSigma，目录号：387649-100ML）

24.异丙醇

25. 0.1 M醋酸钠溶液

26. 0.1 M HCl溶液

27. Copper-64（64铜；圣路易斯华盛顿大学）

28. AlexaFluor TM 647 NHS酯（Thermo Fisher ，目录号：A20006）

29.小鼠血清（MiliporeSigma ，目录号：M5905-5ML）

30. OCT ˚F reezing Ç ompound（组织-Tek的® OCT化合物，樱® Finetek ; VWR ，目录号：25608-930）

31.组织-Tek公司® Cryomold ®米孩子/一个dapters（樱® Finetek ）

32. 4'，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI; Thermo Scientific，根据供应商说明制备；目录号：62247）

33.的ProLong TM Gold抗淬灭封固（的ProLong ，目录号：P36930）

34. RPMI-1640米edium（ATCC ，目录号：ATCC ® 30-2001 TM ）

35.胎儿b绵羊小号erum （FBS）（Gibco公司TM ，目录号：10-082-147）

36. Pencillin -s链霉素抗生素（Gibco TM ，目录号：15-640-055）

37.异氟烷（MiliporeSigma，目录号：Y0000858）

38.铝存根（PELCO ®销安装启动套件; PELCO ，目录号：76250-10）

39.重组抗CD31抗体[EPR17260-263 ]（Abcam ，目录号：ab222783）

40.山羊一个nti- ř abbit的IgG H＆L（FITC）（Abcam公司，目录号：ab6717）

41.完整的文化性ë培养基（参见食谱）

42. 50 mM EDTA解决方案（请参阅食谱）

设备

Inveon TM PET / CT（西门子医疗公司，INVEON，目录号：138757）
IVIS ®谱在体内成像系统（珀金埃尔默，目录号：124262）
Bioscan AR-2000 Radio-TLC成像扫描仪（埃克特和齐格勒，巴伦西亚，加利福尼亚）
扫描电子显微镜（Nova NanoSEM 230，美国赛默飞世尔科技公司）
Zetasizer Nano ZS（英国伍斯特郡马尔文仪器有限公司）
紫外可见近红外分光光度计（Synergy H4 Hybrid ，美国BioTek ）
向导2 2检测器伽玛计数器（PerkinElmer ，目录号2470-0020）
EVOS Auto FL System（Thermo Fisher Scientific，美国）
尼康Eclipse Ti显微镜
离心机（Beckman Coulter公司，型号：阿凡提® J-26 XPI，目录号：393127）
组织培养培养箱（Sanyo Scientific，目录号：133060）
生物安全柜（The Baker公司，SterilGARD ，目录号：101951）
Fisherbrand TM等温TM热板搅拌器，环境温度540 °C，陶瓷（Fisherbrand ，目录号：SP88854200）
PCR热循环仪（Bio-Rad Laboratories，型号：T100 TM ，目录号：1861096）
Braintree科学多样性合作伙伴鼠标尾部照明约束器（Fisher ，目录号：NC0772753）
Simport TM Scientific StainTray TM幻灯片染色系统（Fisher ，目录号：22-045-035）

软件

Inveon研究工作场所（INVEON，西门子）
实时影像软件（PerkinElmer）
Nikon Elements软件（Nikon）
斐济（NIH）
Microsoft Office套件
GraphPad棱镜

程序

动物模型pulmo三重进制转移-阴性乳腺癌
成长并根据扩增细胞的推荐条件。通常，在补充有10％FBS和1％Pencillin - s链霉素的RPMI-1640培养基中培养4T1-GFP-Luc细胞。
收获细胞，而在该指数生长期（约80 -使用胰蛋白酶或90％汇合）的针对特定细胞系合适的酶。RES uspend介质中的细胞含有血清。
计数细胞。
在225 × g ，4°C下将细胞离心5分钟。将细胞重悬于1 × PBS中，浓度为1 × 10 5细胞/ 200 µl。
地方细胞上的冰和运输的动物饲养。
将鼠标约束在约束器中，并放置尾巴，使静脉朝上。
第200期将μl细胞放入28 G一次性胰岛素注射器中，然后轻轻注入尾静脉。针头中的内含物应易于注射而不会产生阻力。
通过生物发光成像定期监测肿瘤的发展。通常，4T1-Luc细胞需要10天才能发生肺转移。

iNPG-pDox或其他胺改性的纳米/微粒的表面改性
关于iNPG-pDox载体的结构和化学的详细信息，读者可参考以下参考文献（Goel等，2020； Xu等，2016）。
将3 ×10 9胺改性INPG （或选择的其它纳米颗粒）在0.5ml DMF中，在1.5 -米升的Eppendorf TM管。轻轻摇动。
将0.8 mg p-SCN-Bn-NOTA溶解在0.5 ml DMSO中，然后添加到iNPG溶液中。
超声处理混合物直至形成均匀溶液。
加入20 µl二异丙基乙胺，在700 rpm剧烈振摇下，将反应混合物在25°C孵育4小时。该步骤可以在热板上搅拌器或进行在热循环仪。
后的4小时温育后，冲洗INPG以5,000rpm离心-NOTA缀合物5分钟用DMSO作为所述溶剂。简要地说，将缀合物旋转下来，小心弃去上清液，然后通过超声将沉淀的纳米颗粒重悬于0.5 ml DMSO中。用DMSO重复洗涤步骤（共2次），然后用0.5 ml异丙醇（一次）和0.5 ml去离子水（一次）重复洗涤步骤。离心的速度和时间可以根据所使用的纳米颗粒进行调节。
后的最终洗涤步骤中，重新悬浮在INPG在DI水中和FR -NOTA粒料EEZE在- 80℃或冷冻-DR ý （取决于所使用的纳米颗粒）以供进一步使用（用于最多至1周）。
使用S火焰处理以获得INPG-AF647通过缀合的荧光染料（例如，的AlexaFluor TM 647用于光学成像NHS酯）。

iNPG -NOTA的无线电标记
RES uspend INPG -NOTA于0.5ml的0.1M乙酸钠溶液。
甲djust使用0.1M HCl中的溶液的pH至5.5。
将37 MBq 64 CuCl 2添加到纳米颗粒溶液中。放射性同位素和放射性标记溶液的所有处理均应根据机构的放射安全指南，在通风橱中的铅屏蔽罩后面进行。
小心地将封口膜缠绕在瓶盖上，并在37 °C下轻轻摇动将试管孵育1小时。该步骤应在热循环仪中或在铅防护罩后面的热板搅拌器中进行。
除去的过量的未螯合64通过以铜〜1 ，610 ×克5分钟。用去离子水洗涤两次，以获得最终的放射性标记的构建体（[ 64 Cu] NOTA - iNPG ）。所有放射性废物均应适当丢弃。
为了计算放射性标记收率，无线电薄-层色谱法（TLC无线电）被执行（图1）。简短地说，在硅胶TLC板的一端（起点）滴2 µl [ 64 Cu] NOTA - iNPG 。垂直于2M浸条升的50mM EDTA溶液，在50 -毫升锥形管中。

图1.用于计算放射性标记收率的无线电TLC程序示意图

溶液将通过毛细管作用缓慢向上传播。溶液向上移动2 – 4厘米（或距离试纸顶部1厘米；溶剂前面）后，将其从EDTA溶液中取出并使其干燥。
扫描上的Bioscan的AR-2000带无线电b TLC根据成像扫描仪的供应商的指令。
使用该程序的典型放射标记收率范围为50 ％至70％，放射化学纯度> 99％。

大号oading PDOX到[ 64的Cu] NOTA - INPG或INPG-AF647
暂停3个毫克聚合物PDOX单体在DMSO（70毫克/毫升），并将该溶液添加到该[ 64的Cu] NOTA - INPG或INPG-AF647缀合物。
室温下剧烈摇动将混合物孵育3小时。该步骤可以被执行我n中的THERMA升循环仪。
删除卸载PDOX通过洗涤聚合物利用离心DI水两次，如上述B中描述的，以获得所述最终构建体：[ 64的Cu] NOTA - INPG - PDOX用于PET / CT成像和INPG-AF647-PDOX邻ptical成像和共聚焦显微镜。RES uspend于1ml PBS中的最终缀合物。
绘制200 μ升[ 64的Cu] NOTA - INPG - PDOX （〜60 - 80 μ次每只小鼠）溶液中，以1 -毫升注射器用于在下一步骤中注射。

小一个nimal PET / CT成像
在2％异氟烷（在100％O 2气体中）下麻醉4T1荷瘤小鼠。
将每只鼠标转移到鼠标固定器上，小心放置鼻锥以保持麻醉。
插入微导管到尾静脉中，并用冲洗50 μ升PBS。保留注射器与PBS附着在导管上的状态。
在通过鼻锥歧管进行2％的异氟烷麻醉下，将鼠标固定到microPET / CT扫描仪床上。为了最大程度地减少运动，可以用胶带将四肢固定到床的侧面。
切换PBS注射器在cathete随r的注射器含有[ 64的Cu] NOTA - INPG - PDOX 。
获得一个整体-小鼠的全身CT校准图像。
的PET / CT采集协议将取决于在特定的实验和所述研究者的要求。
对于动态PET扫描，30 -分钟动态PET模式中，数据被使用采集的3D-OSEM迭代算法使用256 × 256 × 256体素体积。
在开始动态PET扫描后，立即在30 s内以单次大剂量缓慢注入放射性标记的纳米颗粒溶液。
继续动态PET采集。
如果在更多的时间，PET图像点，数据被使用获取的所述标准3D PET获取协议。为了说明放射性衰变，可能需要更长的扫描时间。
数据集的获取方式为：具有6 × 300 s帧的标准静态3D PET重建和动态3D PET重建。CT衰减校正适用于所有PET图像。

离体伽玛计数
当PET / CT扫描是在所述最后的时间点，根据机构协议安乐死的动物。
收获和权衡的主要器官，包括对荷瘤肺。
根据制造商的说明，使用伽玛计数器测量器官中的放射性。

离体全-器官光学成像
在4T1的一个单独的队列-荷瘤小鼠，注射200 μ升INPG-AF647-PDOX在部分d经由制备的尾静脉（在A节中所述）。
在注射后所需的时间点，根据机构规程安乐死鼠标。
收获肺部并将其放在IVIS Spectrum Scanner中的黑色薄板上。
获取复用离体荧光图像使用供应商的预设过滤套包围的为GFP（肿瘤）的激发和发射光谱，d oxorubicin（PDOX ）和AF647。对于荧光团的这种组合，当使用过滤器18个集自动选择的IVIS光谱系统。
设置视野，采集时间和装箱数量。数据获取设置因用户而异，但在整个实验研究中应保持恒定。
图像获取后，冲洗在PBS组织，保存在在cryomolds OCT化合物，并储存在-80℃用于切片。

免疫荧光米icroscopy
低温部分的冷冻组织中，以6 -μ米-使用低温切片机厚的切片。
将切片的组织在冷丙酮中孵育10分钟。在本节染色和培养的所有步骤应当以染色托盘来执行，或者类似地塑成光-阻挡装置。
准备的封闭溶液如下：混合马和山羊血清以1：1的体积/体积比率，并添加0.1％（按体积）的Triton X-100。
注意：封闭血清的选择（种类）取决于初级和次级antibod的主机上IES用于染色。

添加100 μ升阻断每组织部分的解决方案。在4°C孵育1小时。
制备的第一抗体的溶液100的总体积μ升每组织切片。在一个NTI-CD31抗体可以在使用一个200稀释：1。对于其他的初级抗体，是指将供应商的指令，用于所述建议的稀释度。
1小时后，轻拍侧面的玻片以弃去封闭液。
100添加μ升一级抗体鸡尾酒到每个组织切片，并培育过夜，在4℃。
过夜孵育后，在PBS中轻轻清洗组织切片。对于每次洗涤，孵育在PBS将组织切片3分钟，吨AP在其一侧以排出溶液中的滑动，和一个DD新鲜的PBS。重复洗涤步骤3次。
制备所述第二抗体在封闭液中在供应商的推荐稀释度。对于该克燕麦抗兔FITC二抗，建议使用1:50稀释。
将切片在二抗溶液中于4°C孵育1小时。
如步骤H8所述，用PBS洗涤二抗。
添加50 μ升DAPI溶液到组织切片并孵育10分钟。
如步骤H8所述，用PBS洗涤两次。
清洁和干燥邻近组织滑动的部分，注意不要到干扰或逐出组织。
添加一滴（或5 μ升）金甲NTI衰落中号ounting中号edium并轻轻放置在组织切片盖玻片。必须注意防止气泡的产生。
ð RY滑动通过轻敲与轻轻的Kimwipes和保持在一个黑箱或载玻片盒用铝箔覆盖避光。建议在染色的一天内进行共聚焦显微镜检查。
通过在阶段安装观察和照片免疫滑动一个根据共焦显微镜的供应商的说明，使用的合适的目标。通常，10倍和40倍物镜足以进行纳米颗粒吸收研究。拍摄图像的5 - 10个字段的每组织切片视图分布在整个截面。
防止曝光过度或漂白污渍的样品。所有图像都是在相同条件下采集的。
FITC和DAPI可以通过其专用过滤器集进行观察。为了oberve INPG-AF647，使用的Cy5的普通过滤器设置。从观察荧光PDOX纳米颗粒，所述可用于RFP公共过滤器。

数据分析

MicroPET / CT分析
PET / CT分析因用户实验系统以及机构软件和硬件设置而异。在这项工作中，将遵循以下步骤：
输入的注射剂量放射性，注射的时间，同位素的名字，和扫描时间到软件。
分析使用鼠标的全身PET图像的Inveon工作站软件（西门子医疗公司）。
手动绘制该区域的利益（ROI）为中心的周围的兴趣（器官例如，肺，肝，脾，肾，骨骼，肌肉，上和心脏）的共同配准的PET / CT图像（图2）。所述d ecay -在每个ROI校正放射性由软件自动计算的百分比的的每克器官（％ID / g）与注射剂量。

图2. PET图像的实施例孔定量吨通货膨胀使用的Inveon工作站软件（西门子医疗公司）。的冠状视图的全-体[分布64的Cu] NOTA - INPG - PDOX在一个鼠标轴承肺4T1肺转移。白色箭头表示不同的器官，而ROI轮廓以绿色表示。

使用动态3D数据集绘制每个ROI的动态时间-活动曲线。
要保存图像，请选择一个冠，轴，或矢状面和出口为.TIFF文件。也可以使用该软件获得3D最大强度投影（MIP）重建。

光学成像分析
复用光学成像的分析会有所不同从用户到用户的实验和硬件/软件设置小号。在F ollowing步骤，使用在此协议。
使用LivingImage TM软件（PerkinElmer）分析数据。
使用自动模式进行四成分主成分分析，执行光谱分解。自体荧光我■从所有图像分析中扣除。
绘制体积-和区域匹配的ROI上的每个分量，其频谱的未混合图像（GFP用于所述肿瘤，AF647为INPG ，和d oxorubicin为PDOX ）（图3）。

图3的实施例体外复用光学成像（IVIS ®描绘成像系统）的分布的AF647 -iNPG-PDOX在使用珀金埃尔默生活4T1肺转移图片TM软件。显示了来自Dox的荧光信号（激发：535 nm，发射560 nm）。

的ROI自动计算和被表示为所述平均辐射效率[单位：（P / S /厘米2 / SR ）/（μW /厘米2 ）。
像素线分析也可以使用该软件进行。
将数据导出为.TIFF文件。

共聚焦显微镜分析
在本工作中，使用Nikon Elements（图4）和FIJI软件对图像进行了分析。

图4.使用尼康NIS- Elements TM软件进行的多重共聚焦显微镜免疫荧光成像分析的例子。合并（第一面板）和单- DAPI（蓝色）的信道的图像，血管（CD31，绿色），AF647 -iNPG（品红色），和PDOX在（红色）4T1转移轴承肺部。比例尺如图所示。

在整个研究过程中使用恒定设置进行图像分析。
应用高斯模糊和自动阈值，以段为孔定量图像吨通货膨胀。
执行逐像素孔定量TA通过绘制荧光强度和面积分数覆盖的灰一个以上ROI的整个器官或个体的肿瘤结节。
一般地，孔定量吨通货膨胀之上的每污点视图5个随机视野进行。

菜谱

完整的文化性Ë媒体鼠4T1三重-阴性乳腺癌细胞系：
500毫升RPMI 1640培养基

50毫升1:10 Gibco公司˚F等人b绵羊小号erum，特优

5.5毫升1:100青霉素-链霉素（青霉素/链霉素）抗生素小号

笔记：

我们建议等分˚F BS和Pen / STR ë峰值到50 5.5 -毫升批（足以使一个一批500毫升完全细胞培养medum ）反复防止冻结的组分/解冻。
预先完全培养基可以预先准备好并存储在4℃的延长的时间。
我们建议变暖在完全细胞培养基一水浴在37℃使用前。
100 ml过滤器-灭菌的50 mM EDTA溶液：
1.87克EDTA（乙二胺四乙酸二钠· 2H 2 O）

d电子离子水

添加无菌去离子水至EDTA粉末一个100ml的最终体积
通过经过该溶液一个0.2 -微米Nalgene瓶中顶部无菌过滤器单元
储存在4℃的长时间

致谢

该协议描述的这项工作是从衍生的原始研究的出版物，科学进阶。2020 Jun 24; 6（26 ）：eaba 4498 （Goel et al。，2020）。这项工作是由部分支持了美国国立卫生研究院授予U54CA210181，R01CA193880，并R01CA222959，除了与美国国防部的拨款W81XWH-17-1-0389。

利益争夺

毛罗·法拉利是从得克萨斯州休斯敦大学的美国专利（专利号US 8920625 B2，授予30的发明者个月，2014）。莫罗法拉利和海法沉是没有的发明者Ñ从休斯敦公会医院（PCT / US 2014/0010879 A1）-provisional专利申请。两项发明都与本文所述的科学研究有关。最近，毛罗·法拉利（Mauro Ferrari）成立了一家公司（BrYet LLC），并获得了上述专利的某些商业权利。尽管不是执行官，但他仍然是公司的大股东，董事和科学顾问。所有其他作者声明他们没有竞争利益。

伦理

所有动物研究均根据休斯顿卫理公会科学研究所的机构动物护理和使用委员会（IACUC ID：IS00004452;有效期：01 / 02/2018-01/01 / 2021 ）的指导进行。

参考

Bianchini ，G.，Balko，JM，Mayer，IA，Sanders，ME和Gianni，L.（2016）。三阴性乳腺癌：异质性疾病的挑战和机遇。Nat Rev Clin Oncol 13（11）：674-690。
Blanco，E.，Shen，H.和Ferrari，M.（2015年）。纳米颗粒设计的原理克服了药物传递的生物学障碍。Nat Biotechnol 33（9）：941-951。
Goel，S.，England，CG，Chen F.和Cai，W.（2017）。正电子发射断层扫描和纳米技术：癌症治疗学的动态二重奏。先进药物递送评论113：157-176。
Goel，S.，Zhang，G.，Dogra，P.，Nizzero ，S.，Cristini ，V.，Wang，Z.，Hu，Z.，Li，Z.，Liu，X.，Shen，H.和Ferrari，M.（2020年）。转移性乳腺癌中复合药物转运的顺序解构。科学进展6（26）：eaba4498。
Michor ，F.，Liphardt ，J.，Ferrari，M。和Widom ，J。（2011）。物理学与癌症有什么关系？Nat Rev Cancer 11（9）：657-670。
埃利亚，I.，罗西，M.，Stegen ，S.，Broekaert ，D.，Doglioni ，G.，面包车Gorsel ，M.，皇家，R.，埃斯卡洛纳-Noguero ，C.，Torrekens ，S.，Verfaillie ， C.，Verbeken ，E.，Carmeliet ，G.和Fendt，SM（2019）。乳腺癌细胞依靠环境丙酮酸来塑造转移性利基。自然568（7750）：117-121。
徐荣，张庚，麦洁，邓小霞，塞古拉-伊巴拉，V.，吴，S.，沉J.，刘海，胡，Z.，陈L. 。，Huang，Y.，Koay ，E.，Huang，Y.，Liu，J.，Ensor，JE，Blanco，E.，Liu，X.，Ferrari，M.和Shen，H.（2016）。可注射的纳米颗粒产生剂增强了癌症治疗剂的递送。Nat Biotechnol 34（4）：414-418。