材料和试剂

果蝇小瓶（Kisker Biotech GmbH，目录号：789013）
塞（Flugs宽塑料小瓶，Kisker生物技术公司，目录号：789035）
1.5 ml反应管（Eppendorf 3810X，目录号：0030 125.150）
显微镜载玻片（LABSOLUTE，目录号：7695002）
盖玻片（Roth，货号：H878）
冰和冰桶
果蝇第三研究所幼虫
胎b绵羊小号erum（FBS）（Sigma公司- Aldrich公司，目录号：S0615）
Schneider的我NSECT米edium（西格玛- Aldrich公司，目录号：S0146）
屏蔽件和桑M3我NSECT米edium（西格玛- Aldrich公司，目录号：S3652）
16％多聚甲醛（电子显微镜科学，目录号：15710-S）
小鼠抗Wg （发育研究杂交瘤库，目录号：4D4）
山羊抗小鼠Alexa Fluor 647（1：500，Invitrogen，目录号：A21236）
Hoechst 33342（1：500，Thermo Scientific，目录号：62249）
Mowiol （Calbiochem ，目录号：475904）
玉米米EAL（斯皮尔伯格Mühle的，目录号：SP061388）
大豆粉（SpielbergerMühle，目录号：SP061388）
干酵母（Bierhefe普尔菲，Cenovis ）
麦芽提取物（Lindenmeyer ，Demeter）
甜菜糖浆（Bauckhof ，Demeter）
琼脂-琼脂（Roth，目录号：5210.2）
丙酸（Roth，目录号：6026.3）
尼泊金（700毫升99％乙醇）（Roth，目录号：9065.4）
尼泊金（C 8 H 8 O 3 ）（Fluka ，目录号：54752-1KG-F）
NaCl （Roth，目录号：3957.2）
氯化钾（Roth，6781.1）
Na 2 HPO 4 · 2H 2 O（Roth，目录号：4984.1）
KH 2 PO 4 （Fluka ，货号：15645940）
海卫一X-100（Roth，货号：3051.4）
甘氨酸（Roth，目录号：3908.3）
HCl （Roth，目录号：K025.1）
飞食（请参阅食谱）
P BS （请参阅食谱）
PBTx （请参阅食谱）
甘氨酸-HCl缓冲液（请参见食谱）
Mowiol （请参阅食谱）

设备

果蝇我ncubator（RUMED，类型3201）
刷（例如。，达芬奇，大小2）
镊子（Roth，货号：K342.1）
荧光小号tereo米icroscope（取决于遗传的建立）（例如。，SZX12，配备有U型RFL-T，奥林巴斯）
解剖显微镜如STEMI配备有光源2000（Zeiss）对（例如，KL-200，Zeiss）对
共焦显微镜，例如LSM780共焦激光扫描显微镜（Zeiss），配备了Plan Neofluar 63 × /油NA 1.4和PlanNeofluar 10 × NA 0.3物镜（Zeiss）
Thermoblock （Eppendorf，紧凑型Thermomixer）
摇杆（Heidolph ，POLYMAX 1040）

软件

禅黑色（蔡司），版本14.0.0.0（或替代软件进行图像AQUISITION ）
斐济/ ImageJ的（NIH）（Schneider等人，2012。; Rueden酒店等人。，2017），版本1.53c（用于图像孔定量吨通货膨胀）
Microsoft Excel，Microsoft Office Professional Plus 2016（或用于数据分析的替代软件）

程序

设置果蝇杂交获得第三龄幼虫
选择合适的遗传系统进行感兴趣的基因操作。
注意：我们建议使用UAS / Gal4-系统驱动RNAi或蛋白质与GFP一起在激进的启动子（enGal4，UAS-GFP）下的WID后特异性表达。这样，WID上皮的后半部分（用GFP标记）遭受了所需的遗传操作，而前WID充当了内部对照。使用此设置可以直接可靠地比较同一WID的前控制侧和后处理侧之间的信号强度和分布。它第erefore减少与immunoflu相关的变异性orescence基于检测和孔定量吨在体内模型系统表型通货膨胀。

准备用于果蝇培养的小瓶（请参阅R ecipe s ）。使用前，让蝇瓶达到室温（RT ）。
收集所需果蝇品系的雄性和雌性雌性。
在新鲜食品小瓶中设置20个原始女性和10-20个男性的杂交。
保持杂交在18℃，20℃ ，或25℃。由于UAS / Gal4介导的表达是温度依赖性的，在16°C时具有最小的Gal4活性，在29°C时具有最大的活性，因此可以调节温度以获得所需的表达水平。
每48小时将苍蝇转移到新鲜的食物小瓶中，以获取同步的幼虫种群。
在所需温度下培养小瓶，直到出现三龄幼虫游荡。在25℃下，徘徊第三龄幼虫可以在天收集5和6 。

机翼幻影盘的解剖（第1部分）
用刷子或镊子将所需基因型的三龄幼虫收集在PBS中（请参阅R ecipe s ）。
注意小号：

根据所用的蝇蝇菌株，可能必须根据标记物表达选择正确基因型的幼虫。如果使用EnGal4，UAS-GFP / CyO x UAS-RNAi / UAS-RNAi，则必须使用荧光立体显微镜选择GFP阳性幼虫。
如果需要，可以根据男性睾丸的可见性对幼虫进行性别鉴定。
将幼虫转移到新鲜的PBS中，以洗去食物或残留的污垢。
将幼虫放在冰上的PBS中以麻醉动物并减慢其运动。
将一个幼虫转移到干净的载玻片上的一滴PBS或Schneiders培养基中。
使用解剖显微镜和两对细镊子进行WID解剖。
将幼虫放置在您的视野中，将钩子朝右，将尾巴朝左（图3A）。
注意：以下协议从惯用右手的人的角度描述了一种简单的WID解剖方法。如果你的左手是显性的，镜像以下描述M AY提高精度。

用两对镊子抓住幼虫，使其长在其体长的1/3至1/2处（图3B）。
用力拉住幼虫的后部，将幼虫撕开（图3C）。丢弃幼虫的后半部分，并在视野中重新放置前半部分（图3D）。如果肠道和脂肪体的大器官部位溢出并遮挡了您的视线，请小心将其取下。
坚持到嘴钩用右手用镊子和插入左钳子进入人体开口（图小号3E和3F）。
小心地将左对镊子推向钩子，以将幼虫轻轻滑到右对镊子上，从而将其内外翻（图3G）。前一半幼虫现在应充分倒置并拉到右一对钳子的与内部组织，包括WID露出（图小号3H1和3H2）。
用左对镊子抓住倒钩，然后将其滑出右镊子。小心取出肠，唾液腺，和肥胖的身体（图3I1）。小心不要意外移除WID，尤其是当您移除气管丝时。WID应该保持附着在幼虫上。
注意：此步骤不必完全去除内部组织，因为在安装样品之前将进行第二次解剖。做，但是，确保WID未涵盖的其余的组织部分，以保证均匀染色和固定。

尝试识别两个WID，一个在幼虫的两侧。它们是半透明泪滴形状的结构，并且通常挂在气管，有时浮在距离幼虫主体（图小号3I2和3I3）。

图3.用于WID隔离的前幼虫的解剖。将第三龄幼虫的前半部分隔离（AD）并倒入一对钳子（EH）中。随后，将WID（黄色圆圈）保留在幼虫前半部分，同时去除其他器官部分（I）。在进一步染色和固定之前，将所得样品转移到培养基中。

将倒置的前幼虫部分（包括WID）转移到装有冰上施耐德氏或M3培养基的Eppendorf管中，具体取决于下游应用（图2）。
每个条件至少收集15-20个WID样本。
注意：在进行下一步之前，请勿将WID在冰上放置30分钟以上，以最大程度地减少组织降解。

机翼梦幻碟片染色
稳态细胞外Wg的可视化
将WID样品收集在200μl不带FBS的M3培养基中的E ppendorf管中。
加入100 µl小鼠抗Wg抗体（DSHB 4D4上清液）（对应于1：3的稀释度），并在冰上孵育60分钟。
小心地除去染色溶液，并用1 ml冰冷的PBS冲洗3次。这是最好通过抽吸用1的介质来实现，000微升吸管一倍尖与1 ，000微升和200微升吸管尖。
注意：由于WID样品附着在身体的前部，因此它们会迅速落在Eppendorf杯中，从而可以通过移液去除和交换染色和洗涤溶液。

除去PBS，并在冰上在500 µl 4％PFA的PBS中固定5分钟，然后在室温下轻轻摇动/在摇杆上固定15分钟。
除去固定液，并在1 ml PBS中洗涤3次，每次10分钟。
除去PBS，然后在500 µl PBS + 5％FBS中锁定30分钟。
与稀释于5％FBS的PBS中的二抗在4°C孵育过夜或在室温2 h（anti-mouse-A568 + Hoechst 1：500）孵育。
除去染色溶液，并在1 ml PBS中洗涤3次，每次10分钟。
Wg内吞和贩运的可视化
在200 µl S2培养基+ 10％FCS中收集WID样品。
加入50 µl小鼠抗Wg抗体（DSHB 4D4，稀释度为1：5），并在22°C温和搅拌孵育5-90分钟。
注意：对于内吞池的可视化的Wg结合总的Wg ，内源性标记GFP- Wg的在细胞表面上可以标记由一个抗GFP抗体。用（下C 2-10）的A568标记的第二抗体复染允许之间的后续歧视（双-彩色）GFP- Wg的胞吞作用后和（单-彩色）GFP- Wg的尚未存在于细胞表面上时小号TEP Ç 1。

小心地除去染色溶液，并用1 ml PBS冲洗两次。
除去PBS并用0.1M甘氨酸-HCl缓冲液酸洗WID样品（pH值3.5 ，见配方小号）30秒在RT以除去细胞外结合的抗体。
除去甘氨酸-HCl缓冲液，并用1 ml PBS冲洗3次。
除去PBS，在室温下轻轻摇动/在摇杆上，在PBS中加入500 µl 4％PFA固定20分钟。
除去定影液并用1 ml PBS冲洗一次。
清洗两次，用1毫升15分钟PBTx （见配方小号）透化组织。
注意：此步骤中的通透性可使S tep C 2j中使用的二抗进入细胞并结合到细胞内的抗Wg标记的Wg上，从而被Wg内吞。

取出PBTx并在500 µl 5％FBS的PBTx中锁定30分钟。
与在PBTx中的5％FBS中稀释的二级抗体在4°C过夜孵育或在室温2小时孵育（抗小鼠A568 + Hoechst 1：500）。
除去染色溶液，并在1 ml PBTx中清洗三次，每次10分钟。
可视化的汞回收
在200 µl M3培养基中收集WID样品。
加入100 µl小鼠抗Wg抗体（稀释度为1：3），并在22°C温和搅拌下孵育45-60分钟。
小心地除去染色溶液，并用1 ml PBS冲洗3次。
除去PBS，在室温下轻轻摇动/在摇杆上，在PBS中加入500 µl 4％PFA固定20分钟。
除去固定液，并在1 ml PBS中洗涤3次，每次10分钟。
除去PBS，然后在500 µl PBS + 5％FBS中锁定30分钟。
与稀释于PBS中4％FBS中的二抗一起在4°C孵育过夜，或在RT孵育2小时（抗小鼠A568 + Hoechst 1：500）。
除去染色溶液，并在1 ml PBS中清洗三次，每次10分钟。

翼成虫盘的夹层（部分2）和中号ounting
使用巴斯德吸管将含1-2滴PBS的WID样品转移到载玻片上。
使用解剖显微镜和两对细镊子进行WID解剖。
尝试在样本上找到WID。理想情况下，每个样本可以发现两个WID，大约在预期会出现幼虫“肩”的地方（大约是前样本长度的1/3），有时会附着在气管上（图4A）。
注意：固定后，WID看起来比半透明的更白，通常更容易发现。

小心地将WID与剩余的幼虫前体部分分开。不要用镊子直接抓住WID组织。取而代之的是，用左手镊子抓住主要标本部分，然后找到将WID附着到幼虫上的组织束。然后以类似剪刀的方式将其剪下，或在不直接拉动WID的情况下将其分离。
与所有WID样品进行，然后除去除了WID从载玻片（图所有剩余组织部分小号4B和4C）。

图4. WID的安装剖视图。WID被转移到载玻片上。除去WID以外的所有幼体部分，而不会影响WID组织的完整性。

用薄而柔软的组织的尖端从载玻片上吸收PBS。
注：毛细力米唉移动你的WID朝组织。尽量不要用纸巾捡起WID。

添加60微升的Mowiol （见ř ecipe小号）到载玻片与截止吸管尖。
小心地用盖玻片安装，将盖玻片的一个边缘放在样品上，然后用镊子将其另一侧放下。尽量避免安装气泡。
注意：轻轻施加压力，可以小心地将捕获在盖玻片下面的气泡推开。

让Mowiol在成像前于4°C干燥至少12 h。将载玻片存放在4°C下。

成像一个cquisition
使用配备了10倍和63倍放大物镜的共焦显微镜，这些物镜能够采集z叠层。
使用10 ×目标确定适当的WID 。以一个全貌图像，如果想（不需要孔定量牛逼通货膨胀）。
使用63 ×物镜，以0.5-1 µm的步长从顶WID表面（恰好在周膜下方）获取Z-stack，步长为0.5-1 µm 。
每个条件下的图像至少5-10 WID。保持激光强度和检测器增益不变（所有三种染色方案的代表性示例，请参见图5）。
注意：如果使用enGal4系统，可以调整激光强度和检测器增益以获得最佳照明，因为下游信号分析将涉及WID前后的标准化。

将图像数据保存为与使用Fiji / ImageJ兼容的文件格式（例如。[ Zen（Zeiss）的czi ] 。

图5.实施例一MPL ë Wg的染色使用不同的方法。enGal4> UAS-GFP，UAS-Ykt6 RNAi的细胞外Wg染色（A），以及enGal4> UAS-GFP，UAS-Klp98A RNAi的Wg摄取测定（B）和Wg回收测定（C）。虽然Ykt6敲低会干扰的Wg分泌和第erefore与细胞外的Wg的水平（建筑等人，2012），Klp98A敲低会干扰apicobasal Wg的运输和促进的顶端积累的Wg内内涵体以及心尖的Wg循环（维特等人， 2020）。GFP的共表达标志着后部基因敲除区室。前室用作对照。顶端至基础Z堆栈（A）或WID上皮的单个顶端部分（B，C）的最大强度投影。比例尺，20 μ米。

数据分析

在斐济/ ImageJ中打开WID z堆栈。根据所使用的显微镜软件/图像格式，生物格式插件米AY需要打开你的文件。
注意：以下方案依赖于前后信号强度的标准化，只有在使用enG al4驱动感兴趣的基因操作时，才适用。

转到图像→变换→旋转并旋转z堆栈，直到表达Wg的单元格条纹水平对齐（图6 A）。
绘制一个感兴趣的矩形区域（ROI）（图6 B1），然后转到“编辑” →“选择” →“指定”以将其大小调整为150 × 150像素或其他合适的大小（图6 B2）。
通过转到编辑→选择→添加到管理器将ROI保存到ROI管理器中（图6 B3）。
重复步骤3和4，以创建两个相同的ROI集合。您可以使用管理器的“更多” →“保存”选项来保存ROI集，以供以后分析。
位置上的前侧的一个ROI和对的后侧一个ROI的Wg -表达细胞条纹。如果在后WID中共表达UAS-GFP，则使用绿色通道进行定向（图6 B4）。
注：中号阿克确保“全部显示”在ROI管理选项被选中。

使用通道工具或转到图像→色彩→拆分通道来拆分图像通道（图6 C1）。
在ROI管理器上，转到“更多→多重测量”以同时测量ROI和z堆栈的每个切片中Wg信号的强度（图6 C2）。将打开一个带有数据表的弹出窗口。
注意：测量后，可以在保存图像文件之前使用ROI管理器中的Flatten选项保存包括ROI位置在内的图像。

将多次测量的数据复制并粘贴到Excel工作表（或用于数据处理的替代软件）中。对于每个ROI，将收到关于ROI大小的数据，以及平均，最小，和最大的信号强度为您的堆栈（图中的每个切片6 C3）。
注意：如果数据表中的条目不同，请使用斐济→分析→设置测量来调整测量参数。

图6.孔定量吨的通货膨胀的Wg enGal4驱动基因操作后的信号强度。的Wg的表达细胞条纹被水平（A）对准和适当的前部和被选择的关注区域（ROI）后部区域（B）。然后，针对z堆栈的每个切片分别测量每个ROI中的Wg信号强度，并将其归一化为前野生型对照（C）。

在斐济打开您的原始数据文件，然后选择您感兴趣的切片（例如，周膜下面的3个最顶端的切片，3个最基础的切片，整个堆栈等），然后在Excel工作表中标记相应的切片。
计算相关切片的前后ROI中平均信号的平均强度。
通过除以前信号平均值，将后信号强度归一化为前信号。
注意：由于前WID侧在enGal4驱动的遗传操作设置中充当内部野生型控件，因此可以对后信号强度进行标准化。

使用步骤1-12，至少从5-10 WID收集数据。
在您选择的软件绘制的图形（例如，Excel中，GRAPHPAD ，...）。

菜谱

飞食物
712克玉米粉，95克大豆粉，168克干酵母，450克麦芽提取物，400克甜菜糖浆，50克琼脂，45毫升丙酸，150毫升Nipagin溶液（由300毫升H 2 O + 100克Nipagin（C 8 H 8 O 3 ），用ddH 2 O填充至10L 。
水加热至沸点接近，再加入黄豆粉，干酵母，以及琼脂
搅拌麦芽提取物和甜菜糖浆
搅拌玉米粉
减少热量并在密闭的盖子下煮45-60分钟，偶尔搅拌
将飞行食品冷却至60°C，然后添加丙酸和尼泊金
将果蝇小瓶装满果蝇食品20-30％，并在室温下干燥过夜。然后塞上小瓶并在4°C下储存
PBS
137 mM NaCl ，2.7 mM KCl ，8 mM Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O，1.46 mM KH 2 PO 4

溶于ddH 2 O，并将pH值调节至7.4

PBTx
PBS + 0.1％Triton X-100

甘氨酸盐酸盐缓冲液
ddH 2 O中的0.1 M甘氨酸，用HCl调节pH值至3.5

Mowiol
将0.25 g / ml溶于PBS

致谢

研究在JCG的实验室由德国支持研究联合会资助的研究中心[SFB1324 / 1（331351713）和GR4810 / 2-1]。的研究计划的乔治-奥古斯特安大学哥廷根的大学医疗中心; 和博士后到KL由多萝西娅Schlözer计划，大学医学中心，乔治-奥古斯特安大学哥廷根。该协议基于Witte等人的工作。（2020 ）和Linnemannstöns等。（2020年）。我们感谢Vera Terblanche博士（GAUGöttingen进化发展遗传学系）为她的小组配备摄像头的体视显微镜的使用提供了方便。

利益争夺

作者声明没有任何竞争或经济利益。

伦理

无è thics Ç ommittee批准所需的果蝇的工作。

参考

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