材料和[R eagents

1.5毫升塑料管（Bio-bik，目录号：CF-0150）
27 G注射针（Terumo，目录号：NN-2719S）
1毫升注射器（Terumo，目录号：170215）
50 ml离心管（Greiner，目录号：227261）
铁氟龙管（Chiyoda，目录号：TF-4-10）
KimWipes（Crecia，目录号：S-200 ）
棉芽（Suzuran，目录号：102046 ）
牙签（Yanagi，目录号：J-613）
一次性平衡托盘（Bio-bik，目录号：AS-DS ）
水泥溶液（GC，产品名称：Unifast II 液体 100 g ）
水泥粉（GC，产品名称：Unifast II Powder A3 35 g）
盐水（大冢，目录号：3311401A7028）
氯胺酮（Daiichi-Sankyo，目录号：S9-019780 ）
甲苯噻嗪（拜耳，商品名：甲苯噻嗪2％w / v的小号olution用于我njection 25ml）中
凡士林（Wako，目录号：227-01211 ）
70％乙醇（Shinwa，目录号：WK2-75 ）
强力胶（Sankyo，产品名称：aron alpha A 0.5 g × 5）
Kwil-sil（WPI，目录号：KWIK-SIL）
戊醛（东京化学工业，目录号：V0001 ）
矿物油（Sigma，目录号：M5310-500 ML ）
磷酸盐缓冲盐水 (PBS )

鼠标：

的OSN-特异性G CAMP转基因小鼠品系，OSN-GCaMP3（OMP-tTA的; TRE-GCaMP3复合杂细菌人工染色体的转基因小鼠，8 - 16周龄）瓦特为使用（岩田等人，2017 ;稻垣等人. , 2020) 。OMP-tTA（登录号 CDB0506T）和 TRE-GCaMP3（登录号 CDB0505T）可从 RIKEN ( http://www2.clst.riken.jp/arg/index.html ) 获得。

注意：可以使用表达任何指标的转基因小鼠系，但首选稀疏和明亮标记的系，以便您可以轻松区分 OSN 响应。在OSN-GCaMP3小鼠，GCaMP3在57.9％表示的总的OSN （岩田等人，2017）。基于所述的Tet-系统米鼠标线AY适合用于标记密度和荧光强度方面OE成像。

设备

微量移液器（Gilson，型号：P200 和 P1000）
加热垫（Natsume，目录号：KN-475-3-40）
镊子（KFI，目录号：1-9749-32）
细镊子（Ideal-tek，目录号：91-2427 ）
细剪刀（Mizuho，目录号：04-001-13）
荧光立体显微镜（徕卡，型号：M205 C）
注意：一个落射荧光显微镜是有用用于评估荷兰国际集团的OE（下面详细说明）上面的头骨的厚度。

用于荧光激发的外部光源（Leica，型号：EL6000）
滤光片（徕卡，型号：GFP）
手术用头部支架（Narishige，型号：SG-4N）
定制铝制鼻梁（图1 ）
注意：我们为 Narishige SG-4N （图 1A）安装了一个定制的鼻梁，因为原始鼻梁太长并阻止了手术进入 OE。尺寸应根据您的头部支架进行调整，并使手术过程中可以接触到 OE 上的头骨（图 1C ）。只要 OE 可用于手术，就可以使用任何头部固定器。

图 1.将定制鼻梁安装到头架上。A. 头部固定器的原始鼻梁。B.该ð ESIGN一个特制的鼻子吧。C. 将定制的鼻梁安装到 SG-4N 中。

定制铝头条（4 × 22 mm）
注意：头杆是为定制的头架设计的，如先前的研究（Guo 等人，2014 年）所述。

用于成像的定制头架
注意：头部固定器的构建如前所述（Guo 等人，2014）。如果 OE 可用于体内成像，则任何头部固定系统均可用于该协议。

Φ 1毫米d细沟尖端（Meisinger，目录号：ST1 HP010）
牙钻（Leutor，型号：LP-120）
除尘器（UN，目录号：UN-1321）
双光子显微镜（奥林巴斯，型号：FV1000MPE）
Fluoview 软件（奥林巴斯，型号：FV10-ASW）
25 ×物镜（奥林巴斯，型号：XLPLN25XWMP）
定制的嗅觉计
注意：所述的设计的olfactometers已经别处描述（Slotnick和雷斯特雷波，2005 ; Burton等人，2019 ）。简而言之，嗅觉计由一个气泵（AS ONE，目录号：1-7482-11）、活性炭过滤器（Advantec，型号：TCC-A1-S0C0 和 1TS-B）和流量计（Kofloc，型号：RK -1250)]

程序

准备一个头部支架进行手术。我们结合使用商业头架和定制的鼻梁，使 OE 区域可用于手术（图 1）。
使用盐水中的氯胺酮/赛拉嗪鸡尾酒麻醉小鼠（氯胺酮和赛拉嗪分别为 80 毫克/千克和 16 毫克/千克）。注射氯胺酮/赛拉嗪腹膜内鸡尾酒使用一个1 -毫升注射器和27号针。手术过程中，需要通过脚趾捏反射来评估麻醉深度，必要时应给予补充剂量。
使用头部支架将头部固定在荧光立体显微镜下。
用棉签用凡士林盖住眼睛以防止干燥。
在头部涂抹 70% 乙醇。
注意：此步骤需要对手术部位进行消毒并在下一步中去除毛发。

使用剪刀和镊子去除头皮和头发（图 2A ）。
注意：头皮需要大量去除到头后部，以便在后面的步骤中连接定制的头条。

注意：头发可以事先用剃须刀剃掉。

用镊子小心地从头骨上取出骨膜。
强力胶应用到手术部位的周边，以防止头皮被卷入由钻头的旋转。
注意：当覆盖 PBS 时，强力胶会迅速硬化。使用过的钻头可用于涂抹强力胶和 PBS。

使用牙钻（Φ 1 毫米钻尖，5,000 - 10,000 rpm）小心地将 OE 上的头骨变薄（图 2A - 2 D，视频 1 ）。
注：背侧和喙部小号的d区（区域1）和V区域（区域4）的背外侧部分的可成像（图2B ）。由于存在大量血管，其他部分难以钻孔。为避免过热，不要连续变薄头骨的同一区域。见杨等人。( 2010 年)有关薄化颅骨制备的其他提示。

视频 1.用于 OE 成像的薄化颅骨准备。钻尖轻轻接触头骨并水平移动。

用鼓风机吹掉头骨屑（视频 1 ）。
在变薄的头骨上涂抹少量 PBS，检查是否可以清楚地观察到 OSN 胞体的血管和荧光（图 2D -2 F ）。
继续稀释，直到观察到 OSN 胞体的荧光（图 2F ，箭头）。
注意：您还可以根据刚度估计头骨的厚度。如果它足够薄，用镊子轻轻接触时，头骨会下沉一点。

图 2. 用于体内成像的薄化头骨制备。A. 从头部去除背部头皮。B.该背侧和喙部小号在OE的d区（区域1）和V区的背外侧部分（4区）可以是我马吉德阿卜。C. OE 区域 1 上成像区域的特写照片。（A颅骨中方框区域减薄- C，3 -从嗅球的在12的前边缘6毫米-周龄雄性小鼠）。D. 通过变薄的头骨拍摄的右侧 OE 区域 1 的明场图像。如果颅骨足够薄 (白色箭头), 应清楚地观察血管。乙。右侧 OE 区域 1 的荧光图像由荧光立体显微镜拍摄。F. (E) 中所示方形区域的特写图像。箭头表示来自 OSN 胞体的荧光。

调整头部角度，以确保其在OE的背表面垂直于光路。
在成像区域外的头骨表面涂上强力胶，为定制头杆的附件制作支架。
将约 0.3 克水泥粉放入一次性平衡托盘中。使用微量吸管将 ~0.3 ml水泥溶液倒入粉末中。立即用牙签将粉末和溶液混合，制成牙科水泥（图 3A ）。
注意：较大的溶液量可以溶解的塑料托盘。在这种情况下，您可以使用一个小的硅胶碗代替。

使用牙科水泥（图 3B ）将定制的头条与光路垂直。
在成像区域的外围应用 Kwik-sil。PBS 可以保留在这里使用浸水物镜进行成像(图 3C ) 。
使用头杆和定制的头部支架（图 3D ）（Guo等人，2014 年）将头部固定在双光子显微镜下。

图 3.双光子显微镜下的头部固定。A.用牙签混合之前（左）和之后（右）的牙科水泥。B. 一个定制的头杆与牙科水泥垂直于随后的体内成像的光轴。C. Kwik-sil 应用于成像区域的外围以在成像过程中保留 PBS。D.成像区域WA S置于使用定制的打印头保持器的物镜下。

使用定制的嗅觉计对 OSN 胞体中的气味诱发反应进行双光子成像（图 4；视频 2 ）。在这个例子中，戊醛在稀释一浓度的0.5％体积/体积在1ml的矿物油，并在50浸泡在的Kimwipe -毫升离心管中。离心管中的饱和气味蒸汽通过特氟龙管以 1 L/min 的速度输送到鼻子。
注意小号：

在50 -毫升离心管中并特氟隆管应该每次更换第ë气味被改变，以避免气味的交叉污染。
我们从未进行慢性成像，但它中号AY是可能的（小号EE也扎克等人，2020）。

图 4. OSN 胞体的双光子钙成像。A. 在气味刺激之前（左）和期间（右）来自 OSN 胞体的 GCaMP3 荧光。乙。OSN 胞体响应 0.5% 戊醛的伪彩色 F/F 0图像（参见视频 2）。

视频 2. OE 中 OSN 胞体气味反应的体内双光子成像。0.5% 戊醛在 10 到 15 秒内被输送到鼻子。灰度图像显示荧光（像素强度）。

致谢

这项工作是由从PRESTO的资金支持和CREST程序小号的日本科学技术振兴机构（JST），日本（TI）的JSPS KAKENHI，日本（授权号的小号JP23680038，JP15H05572，JP15K14336，JP16K14568，JP16H06456，JP17H06261 ，和JP21H00205到TI ，JP15K18353到RI ，并JP21H02140到SI ），牛逼他持田纪念基金会的医学和药物研究，从理化学研究所发育生物学中心（TI）校内津贴和格兰特在急救的JSPS研究员，日本（JP15J08987 到 RI 和 JP18J00899 到 SI）。我们感谢 MN Leiwe 对手稿的评论。该协议已用于我们的研究（Iwata等人，2017 年；Inagaki等人，2020 年）。

利益争夺

这里是没有冲突小号的利益或竞争经济利益小号。

伦理

所有的动物实验是由九州大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）（＃A19-054，Appro公司批准v版从19年4月1日至21年3月31日）。

参考

Burton, SD、Wipfel, M.、Guo, M.、Eiting, TP 和 Wachowiak, M.（2019 年）。一种用于有效和灵活传递气味的新型嗅觉计。化学感官44（3）：173-188。
Cygnar, KD, Stephan, AB 和 Zhao, H. (2010)。使用气相嗅觉电图记录分析小鼠嗅觉感觉神经元的反应。J Vis Exp (37)：1850 年。
Guo, ZV, Hires, SA, Li, N., O'Connor, DH, Komiyama, T., Ophir, E., Huber, D., Bonardi, C., Morandell, K., Gutnisky, D., Peron , S., Xu, NL, Cox, J. 和 Svoboda, K. (2014)。头部固定小鼠的行为实验程序。PLoS 一号9(2)：e88678。
Inagaki, S.、Iwata, R.、Iwamoto, M. 和 Imai, T. (2020)。体内小鼠嗅觉感觉神经元的广泛抑制、拮抗和协同作用。细胞代表31(13)：107814。
Iwata, R.、Kiyonari, H. 和 Imai, T.（2017 年）。嗅球中气味特性的基于机械感觉的相位编码。神经元96(5)：1139-1152 e1137。
Jarriault, D. 和 Grosmaitre, X. (2015)。完整神经上皮中小鼠嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录：表达已识别气味受体的神经元的功能分析。J Vis Exp 101：e52652。
Maue, R. A. 和 Dionne, VE (1987)。离体小鼠嗅觉受体神经元的膜片钳研究。J Gen Physiol 90(1): 95-125。
Slotnick, B. 和 Restrepo, D. (2005)。用小鼠进行嗅觉测量。Curr Protoc Neurosci第 8 章：820 单元。
Yang, G., Pan, F., Parkhurst, CN, Grutzendler, J. 和 Gan, WB (2010) 。用于活小鼠皮层长期成像的薄颅骨颅窗技术。纳特Protoc 5（2）：201- 20 8。
Zak, JD、Reddy, G.、Vergassola, M. 和 Murthy, VN (2020) 。嗅觉感觉神经元中的拮抗气味相互作用在自由呼吸的小鼠中很普遍。国家通讯社11(1):3350。
张 C. (2018)。来自完整嗅觉鼻甲的个体嗅觉感觉神经元的钙成像。分子生物学方法1820：57-68。