材料和试剂

核孔径迹蚀刻亲水膜过滤器，3.0 µm 孔径（VWR，目录号：28158-624）带过滤器支架（Fisher Scientific，目录号：SX0002500）
15毫升聚苯乙烯锥形管（VWR，目录号：10026-084）
1.5 ml Eppendorf 微量离心管（VWR，目录号：89000-028）
黑1.5 ml离心管小号（VWR，目录号：47751-688）
10毫升注射器小号（VWR，目录号：BD309646）
钝-端针（麦克马斯特-卡尔，目录号小号：75165A761 [ 20G ] ; 76165A759 [ 25G ] ）
蜂星®黑色96孔板无盖小号（VWR，目录号：82050-732）
1,000 ml玻璃烧杯（VWR，目录号：10754-960 ）
5毫升和10ml血清移液管（VWR，目录号小号：89130-896，89130-898 ）
20微升，200微升，和1 ，000微升微量提示（VWR，目录号小号：76322-134，76322-150，76322-138 ）
弓形虫RHΔ Ku80蛋白Δ HXG应变缺乏荷兰国际集团的ķ U80和次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因。该菌株由密歇根大学医学院的 Carruthers 实验室提供。大号的ACK的Ku80蛋白在寄生虫基因提升同源-依赖性重组（黄长发和Carruthers的，2009年）。大号次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXG）的OSS允许该菌株进行基因修饰，通过携带外源DNA的载体的HXG基因。该菌株作为野生型亲本菌株广泛用于弓形虫研究领域。
RH∆ ku80 ∆ hxg ∆ cpox应变（缩写为 ∆ cpox ）。在已生成血红素缺陷寄生虫株一个先前的研究（贝格曼等人，2020）。该菌株缺乏可催化寄生虫血红素生物合成途径中倒数第二次反应的粪卟啉原-III 氧化酶 ( TgCPOX ) 。
RH∆ ku80 ∆ hxg ∆ cpoxCPOX应变（缩写为 ∆ cpoxCPOX ）。甲TgCPOX在产生互补应变一个先前的研究（贝格曼等人。，2020）。在该菌株中血红素缺乏得以恢复。
人包皮成纤维细胞（HFF）（美国典型培养物保藏中心（ATCC），目录号：SCRC-1041）
康宁® Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（VWR，目录号：45000-304）
100×青霉素-链霉素（VWR，目录号：45000-652）
200 mM L-谷氨酰胺（VWR，目录号：45000-676）
1 M HEPES游离酸（VWR，目录号：45000-696）
Hyclone ® Cosmic Calf Serum（Cytiva ，目录号：SH30087.03）
HyClone ® Dulbecco 磷酸盐-缓冲盐水（DPBS）粉末，不含钙和镁（粉末）（Cytiva ，目录号：SH30013.04）
猪血红素粉（VWR，目录号：BT138155-1G）
草酸一个CID二水合物（VWR，目录号：97064-978）
异丙醇（VWR，目录号：BDH11744）
DPBS（小号EE食谱）
D10培养基（小号EE食谱）
1mM的血红素溶液（小号EE食谱）
2 M草酸溶液（见配方）

设备

的Eppendorf CellXpert ® C170 Ç ELL Ç ulture我ncubator（Eppendorf）中
Eppendorf 冷冻离心机（Eppendorf ，型号：5810R ）
Branson Analog Sonifier超声波细胞破碎仪 S-250A（VWR，目录号：33995-309），带有锥形 1/8 英寸微尖端（VWR，目录号：33996-163）
Biotek的协同H1混合多模式米icroplate ř EADER（Biotek的仪器）
微量移液器套装（P-1000、P-200 和 P-20）（VWR，目录号：75788-456）
血细胞计数器（VWR，目录号：15170-168）。说明可以在http://www.hausserscientific.com/products/reichert_bright_line.html中找到
热板（VWR，Advanced Hot Plate，目录号：97042-642）

软件

BioTek ® Gen5 数据分析软件
微软Excel
的GraphPad Prism（V版为9）

程序

请参见图 1了解整个过程的示意图。

图1.基于荧光的血红素孔定量的示意性轮廓TA在灰弓形虫。请参阅正文以获取更多详细信息。

在这个协议中，野生型（RH Δku80Δhxg ），Δ CPOX （一个血红素缺陷型菌株），和Δ cpoxCPOX （一个TgCPOX互补株）菌株一个包括作为例子重。如果寄生虫菌株储存在-80 ° C，它们必须在 37 °C下解冻，并立即传递到含有完全融合的人类包皮成纤维细胞 (HFF) 细胞的 T25 组织培养瓶中。后的寄生虫裂解的宿主细胞中，约300μ升充分裂解野生型和Δ cpoxCPOX寄生虫传递到涂有HFF细胞用于一个T25组织培养瓶一个2天的通年龄。对于所述Δ CPOX株，接种物增加至2μm升，以补偿其严重的生长缺陷。1 - 2 T25每株寄生虫的烧瓶需要根据它们的生长表型。由于 Δ cpox表现出严重的生长缺陷，因此在该测定中使用了两个 Δ cpox寄生虫烧瓶。将野生型和ΔcpoxCPOX菌株传递到一个 T25 烧瓶中。
在冰上预冷 DPBS并将感染的细胞保持在冰上。刮的感染HFFS和注射器他们三次使用一20号针，随后三次使用一个25号针。将裂解物穿过一个3.0微米的过滤器以除去完整的宿主细胞和宿主大细胞碎片。用 5 ml 冰冷的DPBS冲洗烧瓶并通过过滤器进行洗涤。
将水装满 1,000 毫升玻璃烧杯，并在加热板上保持沸腾以加热样品。沸水将在步骤16中使用，以加热所述样品。
在 4 °C 下以1,000 × g离心寄生虫10 分钟。离心后，寄生虫沉淀在预期的底部待观察的离心管中。
小心吸上清，重悬寄生虫沉淀在10毫升冰冷DPBS。重复小号TEP 4.检查在继续之前沉淀。
小心吸出上清液，将沉淀重悬在10 ml 冰冷的 DPBS 中。
孔定量泰特纯化寄生虫的产量使用下列供应商的说明血球。
在 4 °C 下以 1,000 × g 的速度将寄生虫颗粒化10 分钟。
吸出上清液，将寄生虫重悬在1 ml 冰冷的 DPBS 中，然后转移到 1.5 ml 微量离心管中。
在 4 °C下以5,000 × g 的速度旋转寄生虫5 分钟。
吸出上清液并将剩余的沉淀重悬在400 µl 冰冷的 DPBS 中。
使用带有锥形 1/8 英寸微尖端的Branson Analog Sonifier超声波细胞破坏器 S-250A ，使用以下设置对生物安全柜内的每个纯化寄生虫菌株进行超声处理：输出强度 = 3 和占空比 = 20%。对每个纯化的寄生虫菌株进行超声处理 10 秒并重复 4 次。等待的每个重复之间30秒，并保持在冰样本，以避免过热。
需要用于甲氯化血红素标准曲线的每寄生虫绝对血红素丰度的测量。氯高铁血红素的库存最初稀释在DPBS至1200纳米，接着一个3倍连续稀释，以产生5个在附加浓度400，133.3，44.4，14.8，和4.9 nM的。DPBS单独也作为一个空白为0纳米血红素。
将100 µl每种样品或氯化血红素标准品加入黑色 1.5 毫升离心管中。每个菌株或氯化血红素标准品准备两套；一个将被煮沸，另一个将保持在室温。
向每个样品中加入900 µl 2 M 草酸并涡旋以完全混合。
在室温下将一组样品和氯化血红素稀释液放在架子上，并将另一组样品放在管架中煮沸30 分钟。
放置在冰上煮沸的样品5分钟，然后让它们在室温下搅拌10分钟。通过涡旋混合所有样品。
移液管将200μl各寄生虫污渍或氯高铁血红素标准到每个孔中的一个黑色96孔平板中，一式三份。
读取使用样品一个BioTek的协同H1混合多模式酶标仪使用以下设置：激发：400纳米，发射：608纳米，光学：顶部，增益：135，读取速度：正常，延时：100毫秒，测量/数据点：10，读取高度：7 毫米。导出的采集的数据的Excel电子表格。
在至少三个生物学重复中重复该测定以进行统计显着性比较。

数据一nalysis

的计算的归一化血红素丰度弓形虫寄生虫（图2 ）：

图2.实施例的数据和分析基于PPIX血红素孔定量吨通货膨胀在弓形虫寄生虫。一个。从血红素的一种生物复制的原始数据的Excel表格孔定量吨通货膨胀在野生型，Δ CPOX ，和Δ cpoxCPOX寄生虫。乙。数据分析的标准化血红素丰度弓形虫的寄生虫。野生型寄生虫的血红素丰度设置为 100%，用于其他菌株血红素量的标准化。

计算每个煮沸和未煮沸的样品的平均读数。
从相应煮沸样品的信号中减去每个非煮沸样品的荧光。
减去该空白值（0 nM的从每个寄生虫株氯高铁血红素样品）。
除以平均值为在通过计算寄生虫数量个别样品通过了血球计数。
注：二十分之一的纯化寄生虫被包括在每个孔中孔定量吨血红素丰度（四分之一的通货膨胀的总纯化寄生虫沸腾之前与草酸混合，五分之一的煮沸混合物移液到每个孔用于荧光测量的96 孔板）。

分割的每寄生虫平均荧光值用于从每个样品由与野生型菌株进行归一化。野生型寄生虫的归一化值设置为 100%，以便与其他菌株进行比较。

的计算的绝对丰度血红素在弓形体寄生虫（图3 ）：

图 3. 计算弓形虫寄生虫的绝对血红素丰度。一个。Ť能够荧光的（AU）信号氯高铁血红素标准的每个浓度下。乙。ģ绘制的氯高铁血红素的标准曲线的线性回归的拍摄和。Ç 。线性回归分析，以发电机密封e为方程为CALCULAT荷兰国际集团中纯化寄生虫溶胞产物血红素浓度。d 。用于计算每个寄生虫的血红素量的分步数据分析。

如果需要每个寄生虫的绝对血红素丰度，则需要标准血红素曲线，通过替换血红素标准曲线方程中每个菌株的荧光值来确定超声处理的寄生虫裂解物中的血红素浓度。血红素的各寄生虫溶胞产物的总量是由含多处确定颖通过每个样品的浓度血红素的体积（400 μ升）和DIVID荷兰国际集团由寄生虫的总数，得到每寄生虫的绝对丰度血红素。

要生成氯化血红素标准曲线：

平均每个浓度的血红素标准的煮沸和非煮沸样品的荧光强度。
减去的平均荧光值用于所述从相应的煮沸的样品个别非煮沸样品。
减去空白值（0 nM的从氯高铁血红素）的个体氯高铁血红素浓度。
绘制针对减去荧光值的个别氯高铁血红素浓度4.9，14.8，44.4，133.3，400，和1 ，200 nM的。
上进行线性回归的绘制的数据点进行曲线拟合，以产生血红素标准曲线方程，这将被用于计算丰度血红素在所述测试寄生虫溶胞产物。

食谱

DPBS
添加9.6克HyClone公司Dulbecco氏p hosphate -b uffered小号在1次艾琳粉末大号去离子水。该溶液在使用前进行高压灭菌。

D10 中号
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中补充有10mM HEPES，10％（V / V）宇宙Ç ALF小号erum，2mM的L-谷氨酰胺，100IU / ml青霉素，和100μg/ ml链霉素。

1 mM 血红素溶液
将 32.6 mg 氯化血红素溶解在 50 ml 20 mM NaOH 中。

2M草酸溶液
将 126.07 克二水草酸加入 500 毫升去离子水中。将水加热至~ 50 °C以进行溶液制备。溶液过饱和，当溶液冷却至室温时溶质会沉淀。在测定中使用上清液。

致谢

作者想感谢卡拉瑟斯博士分享了RHΔ的Ku80 Δ HXG弓形虫株这项研究。这项工作得到了克莱姆森启动基金（对 ZD）、圣殿骑士眼科基金会儿科眼科职业启动研究补助金（对 ZD）、NIH COBRE 赠款 P20GM109094（对 ZD）和 NIH R01AI143707（对 ZD）的试点资助）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。该协议是从以前出版的基于PPIX血红素孔定量改性吨通货膨胀阿萨ý （辛克莱等人，2001）用于在哺乳动物细胞中血红素定量。

利益争夺

作者声明没有冲突或竞争利益。

参考

Bergmann, A., Floyd, K., Key, M., Dameron , C., Rees, KC, Thornton, LB, Whitehead, DC, Hamza, I. 和 Dou, Z. (2020)。弓形虫需要其类似植物的血红素生物合成途径进行感染。PLoS病原体16(5)：e1008499。
Hanna, DA, Harvey, RM, Martinez-Guzman, O., Yuan, X., Chandrasekharan, B., Raju, G., Outten , FW, Hamza, I. 和Reddi , AR (2016)。基因编码的荧光血红素传感器揭示的血红素动力学和贩运因素。Proc Natl Acad Sci USA 113(27): 7539-7544。
Huynh, MH 和 Carruthers, VB (2009)。标记在一个内源基因的弓形虫弓形虫应变缺乏Ku80蛋白。真核细胞8(4)：530-539。
Krishnan, A., Kloehn , J., Lunghi , M., Chiappino -Pepe, A., Waldman, BS, Nicolas, D., Varesio , E., Hehl , A., Lourido , S., Hatzimanikatis , V.和 Soldati-Favre, D. (2020)。功能和计算基因组学揭示了阶段特异性弓形虫代谢前所未有的灵活性。细胞宿主微生物27(2)：290-306 e211。
菲利普斯，JD（2019 年）。血红素生物合成和卟啉症。Mol Genet Metab 128(3): 164-177。
Ponka , P. (1999)。血红素细胞生物学。Am J Med Sci 318(4): 241-256。
Sinclair, PR, Gorman, N. 和 Jacobs, JM (2001)。血红素浓度的测量。Curr Protoc Toxicol第 8 章：第 8 单元 3.
Song, Y., Yang, M., Wegner, SV, Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C. 和 Chen, PR (2015)。用于细胞内血红素的基因编码 FRET 传感器。ACS 化学生物学10(7): 1610-1615。
Tjhin , ET, Hayward, JA, McFadden, GI 和 van Dooren , GG (2020)。弓形虫中顶质体定位酶 TgUroD 的表征揭示了顶质体在血红素生物合成中的关键作用。J Biol Chem 295(6): 1539-1550。
Yuan, X., Rietzschel , N., Kwon, H., Walter Nuno, AB, Hanna, DA, Phillips, JD, Raven, EL, Reddi , AR 和 Hamza, I. (2016)。亚细胞记者揭示的细胞内血红素运输的调节。 Proc Natl Acad Sci USA 113(35)：E5144-5152。