材料和试剂

1. 35毫米克小姑娘底菜ES （马蒂克公司，目录号：P35G-1.5-14-C）

2. 100毫米吨问题培养皿ES （TPP，目录号：93100）

3.注射器过滤器单元，0.45 μ m （Millipore Sigma，目录号：SLHV033RS）

4.定时怀孕 Sprague Dawley 大鼠（用于 E15-16 DRG 解剖）

5. 293FT 细胞（Thermo Fisher，目录号：R7007）

6.改良的pSLIK （Addgene #25737；Shin等人，2006）（储存在 -20 °C）

7.改良的pFUGW慢病毒载体 ( Addgene #14883; Lois et al ., 2002)（储存在 -20 °C）

8.的pCMV -VSV-G（礼物从J. Milbrandt ，华盛顿大学）（存储于-20 ℃）

9.的pCMV- Δ 8.9（礼物从J. Milbrandt ，华盛顿大学）（存储于-20 ℃）

注意：pSLIK被设计为去除潮霉素抗性和 IRES 序列，以提供额外的空间来容纳各种货物的更大的 cDNA（Zhang 等人，2012）。pFUGW被修改为缺少 GFP 报告基因并添加了一个独特的克隆位点（Dzhashiashivili等，2007）。

10. Gateway LR Clonase II Enzyme Mix（Thermo Fisher，目录号：11791020）（储存在- 80 °C ）

11.聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P5899）（- 80 °C储存）

注：ü sed的用于293FT细胞培养。

12.聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P1274）（- 80 °C储存）

注：ü用sed到外套玻璃底菜。

13.天然米乌斯升aminin（Invitrogen公司，目录号：23017-015）（在-80存储℃下）

14. Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（Lonza，目录号：17-512Q）（室温储存）

15. LipoD293 DNA转染试剂（Signagen ，目录号：SL100668 ）（4 ℃保存）

16. 0.25% 胰蛋白酶（Thermo Fisher，目录号：15050065）（-20 °C储存）

17.胎牛血清（Thermo Fisher，目录号：16000-044）（- 80 °C储存）

18. MEM（Thermo Fisher，目录号：11090-073）（在 4 °C 下储存）

19. MEM，米INUS p苯酚的制备- [R ED（热费舍尔，目录号：51200-038）（在4存储℃下）

20. Neurobasal 培养基（Thermo Fisher，目录号：21103-049）（在 4 °C 下储存）

21. Neurobasal培养基，米INUS p苯酚的制备- [R ED（热费舍尔，目录号：12348-017）（在4存储℃下）

22. DMEM（Lonza，目录号：12-614F）（在 4 °C 下储存）

23. MEM Ñ导通Ë ssential一个蓑一个CID小号olution（热费舍尔，目录号：11140050）（在4存储℃下）

24.钠p yruvate（热费舍尔，目录号：11360070）（在4存储℃下）

25.葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G5146）（在4 °C下储存）

26. L-谷氨酰胺（Thermo Fisher，目录号：25030-081）（储存在-80 °C ）

27. B27补充剂（ThermoFisher ，目录号：17504-054）（- 20 °C储存）

28. 2.5S Ñ ERVE克rowth ˚F演员（ABD Serotec公司，目录号： PMP04Z）（存储于-80 ℃下）

29.强力霉素（Sigma-Aldrich，目录号：D9891）（储存在-80 °C ）

30. HEPES（Thermo Fisher，目录号：15630106）（在 4 °C 下储存）

31.青霉素小号treptomycin（热费舍尔，目录号：15140122）（在-80存储℃下）

32. V itaminÇ （Sigma-Aldrich公司，目录号：A0278）（在室温下储存）

33.氟脱氧尿苷（FdU ）（Sigma-Aldrich，目录号：F0503）（室温储存）

34.尿苷（Sigma-Aldrich，目录号：U3003）（室温储存）

35. HEK293细胞培养基（见ř ecipes）

36. NB培养基（参见ř ecipes）

37. Ñ乙˚F介质（见ř ecipes）

38. Ç介质（见ř ecipes）

39. Ç F培养基（见ř ecipes）

40.大号香港专业教育学院IMAG荷兰国际集团介质（见ř ecipes）

设备

CO 2培养箱（Thermo Fisher，型号：Heracell 240 ）
显微镜及要求：
倒置落射荧光显微镜，带有平面 Apo Lambda 100 × /1.45 NA 物镜（尼康，型号：Eclipse Ti -E ），配备电动 Epi- fl旋转过滤器转盘。
CCD 相机（安道尔科技，型号：Clara；尼康，型号：DS-Qi2）
加热插件 P（PECON，目录号：130-800 207）
温度控制37-2 数字（PECON，目录号：0503.000）
GFP过滤器立方体（尼康，目录号：96362）
594 - nm 激光带通设置滤波器立方体（色度，目录号：49911）

软件

NIS-Elements 高级研究软件（尼康，版本：4.30.01 ）
我mageJ 手动跟踪（斐济，https: //imagej.net/Manual_Tracking ）
E excel（微软，版本：2013）
Prism软件（g ^ raphPad，版本：8）

程序

荧光标记蛋白的产生
保险丝或者EGFP或mKate2（远红外）（小号EE注1，4，5，6 ）在C末端或使用独特的限制性酶位点感兴趣的蛋白质的其他合适的位点存在于表达载体中。根据需要通过 PCR 添加限制性酶切位点，或者在亚克隆到pSLIK或 FUGW之前首先转移到具有多个限制性位点的其他载体。如果标签的合适位点在域之间，则通过补丁 PCR添加限制性离子酶位点、接头序列和标签（Squinto等，1990）。
亚克隆第Ë所得融合蛋白的cDNA为doxycycli NE诱导型慢病毒载体，例如，改性pSLIK （Addgene公司使用Gateway LR＃25737）克隆酶II或组成型表达改性pFUGW慢病毒载体（Addgene公司＃14883使用独特的限制性位点存在的）在这个向量中。用于实时成像的构建体的细节之前已经描述过（Dzhashishivili等，2007；Zhang等，2012；Bekku和Salzer ，2020）。

Lentivir我们生产
外套100 - mm培养皿用5 ml聚-L-赖氨酸（10 μ克/毫升; P5899，号11中第ë试剂列表）的PBS在室温下20分钟; 室温下用 PBS 冲洗 3 次。
用6个菜肴× 10 6 293FT细胞前24小时转染，并允许细胞密度达到〜90％confluenc Ë在转染时。
添加新鲜HEK293细胞培养基（5ml）中30 -在转染前60分钟。
使用 LipoD293 TM体外DNA 转染试剂，用 5 μg pSLIK或 FUGW 慢病毒构建体以及辅助质粒Δ 8.9 (6.25 μg ) 和VSVg (3.3 μg )转染 293FT 细胞。
取代的用7ml DNA / LipoD293复杂含有培养基HEK293细胞转染之后的培养基5小时。
从培养物中48小时收集培养基的转染和转移后，以50 -毫升离心管中。离心机在1700 15分钟×在室温克和过滤的通过0.45上清- μ微米的过滤器单元。过滤的上清液等分为 0.6 - ml 样品并储存在 -80°C直至使用。

P赔偿分离的大鼠DRG神经元培养物的髓鞘和共培养物用于LIV ë成像
Ç燕麦在各底部的玻璃盖玻片马蒂克培养皿（P1274，用号0.5mg / ml的PLL 12在试剂列表）在300 μ升PBS。37 °C孵育30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。
接着，涂覆的玻璃盖玻片上，用10 μ克/ ml的层粘连蛋白在200 μ升PBS。在 37 °C 下孵育30 分钟。
根据先前发布的协议 ( Taveggia和Bolino , 2018)，准备分离的 E15-E16 大鼠 DRG 神经元培养物作为仅神经元培养物或髓鞘共培养物生长。简而言之，从大鼠胚胎中取出 DRG，用 1.5 ml 胰蛋白酶在 37 °C下孵育45 分钟，加入 1 ml C 培养基，通过重复移液分离神经节，并在室温下以 193 × g离心细胞5分钟
重悬的在〜200通过温和研磨粒料μ升CF介质含有p enicillin-小号treptomycin每DRG（PS）。种子解离的大鼠 DRG 神经元，相当于 1 个神经节（约 2.1 × 10 4 个细胞），放在Matek PLL/层粘连蛋白涂层盖玻片上并孵育 24 小时。
每隔一天在 NBF 和 NB 培养基上循环培养共 12 天，以耗尽所有非神经元细胞，只留下神经元培养物。
要建立髓鞘共培养，将 3 × 10 5出生后大鼠 SCs 添加到仅神经元培养物中。SCs 是从坐骨神经制备的，可以将单独的等分试样储存在液体 N 2 中，如前所述（Kim 和Maurel ，2009）。为了启动髓鞘形成，5 天后，将维生素 C 添加到 C 培养基中，最终浓度为 50 μg /ml；这种维生素 C 浓度不会影响培养基的 pH 值。髓鞘形成通常在添加维生素 C 几天后发生。

在仅神经元和髓鞘共培养物中双重病毒感染和荧光标记蛋白的诱导
在含有PS 的C 培养基中稀释第一个病毒上清液。仅适用于神经元的文化，加入1：1（病毒：C为介质）稀释mKate2标记pSLIK病毒一个-天-老DRG神经元的文化。对于髓鞘共培养，加入1：1（病毒：C为介质）稀释EGFP标记pSLIK病毒一个-天-老神经元的文化。用病毒上清液孵育培养物 24 小时。
Ť他第二天，稀释用C介质中的第二病毒上清含有PS。对于仅神经元培养，将病毒培养基更改为新鲜稀释的 EGFP -标记的pSLIK病毒（1:1 稀释）。对于共培养，更换的新的稀释mKate2病毒介质-标记FUGW病毒：在（稀释病毒的1:15 C培养基）的神经元培养物（小号EE注9 ）。孵育 24 小时。
除去的病毒培养基，加入NBF，并培养所述另外的1感染的神经元- 2天直到表达被诱导。如果需要更长的孵育时间以允许神经元进一步生长，请将培养基改为 NB再延长2 天。
根据添加强力霉素当天的培养基循环，将 2 µg/ml 强力霉素（最终浓度）添加到仅神经元培养物中的 NB 或 NBF 中，或加入共培养物中的 C 加维生素 C 以诱导蛋白质表达 24 - 48 小时之前实时成像（S ^ EE注8 ）。
注：概略时间过程š实验对神经元培养物仅和髓鞘培养物（程序C和d）是图1中所示。

图1.时间过程的双-彩色实时成像

现场IMAG ING
1.在实时成像之前立即将介质更改为实时成像介质。

2. P花边培养成长荷兰国际集团上的马蒂克菜到37 ℃下加热显微镜载物台（热插入P）连接到温度控制单元（Tempcontrol 37-2）。

3.在实时成像之前或开始时，确定每个囊泡相对于神经元体的位置的轴突运输方向。

4.使用 CCD 相机和 100 ×物镜（见注释 2、3、8 ）使用 NIS-Elements 高级研究软件（尼康）的完美对焦设置以 2 秒的间隔捕获图像，持续时间≥2分钟，以校正焦点漂移。使用NIS-Elements 高级研究软件的实时解卷积处理图像。EGFP -用 GFP 过滤器立方体 (96362, Nikon) 捕获标记的蛋白质；mKate2 的那些是用 594 - nm 激光带通设置过滤器（49911，色度）立方体捕获的。请参阅图 2 中双色实时成像的代表性静止图像。

5.拍摄 20 多个神经元的图像进行分析。焦点的损失由于显微镜载物台漂移可能需要重新聚焦和可能也减少可用于生成kymographs图像号。

图 2.囊泡协同运输和独立运输的代表性静止图像。上部面板小号：含有囊泡NF186-mKate2和NRCAM -EGFP是顺行共同输运轴突如eviden土木工程署通过从mKate2标记NF186和EGFP标记的重叠黄色NRCAM在相同的囊泡; 黄色箭头突出显示了共同运输的囊泡s 的一个例子。下部面板小号：含有囊泡NF186-mKate2和的Na v β 1 -EGFP在沿轴突逆行方向分开运输; 囊泡的实例含有荷兰国际集团的Na v β 1-EGFP仅由白色箭头突出显示。

数据分析

1.通过实时成像 15 - μm 轴突段 2 分钟构建 kymographs 。构建 kymographs 的一种选择是使用 NIS-Elements 高级研究软件，该软件显示像素强度随时间沿定义的线性部分的变化（图 3）。ImageJ或其他显微镜分析软件是构建 kymographs的另一种选择。的提取物轨迹个体从囊泡的kymographs并手动在每个方向上计数囊泡号码。甲nalyz Ë ≥ 10个神经元转染蛋白的每个组合和比较所述的速率协同转运每种蛋白质。对于统计分析，分析≥ 100 个囊泡（≥ 10 个神经元）；样本大小可以根据变化的实验设计。样本大小可以通过软件计算，例如，G power。

2.确认定量结果使用ImageJ手动跟踪，特别是对于一些顺行囊泡其可以是有限的亮度。

3.使用 ImageJ 手动跟踪测量囊泡的平均速度。

4.比较了通过平均协同转运率的从每个被拍轴突结果。

5.评估与任双尾韦尔奇统计学意义牛逼-测试或双尾学生牛逼-使用非成对数据检验的Excel或的GraphPad Prism软件。

图 3.共同转运囊泡的代表性 kymograph 。这ķ ymograph从表达NF186-EGFP和NF186-mKate2由神经元的实时成像产生的NIS-元素的高级研究软件。囊泡的轨迹由蓝色圆圈突出显示，按时间顺序编号。在 kymograph 中，可以检测到两个逆行共运输的囊泡。另外的代表性实时图像和电影，kymographs ，在设置和数据分析细胞与生物学（Bekku餐厅和萨尔泽，2020）。

笔记

1.该协议描述了双色成像，但可适用于三个或更多荧光团，具体取决于显微镜区分用作标签的不同荧光团的能力。

2.由单一活体成像的限制-激光荧光显微镜是滤波器之间切换以监视不同的荧光团时产生的时间延迟。在此滞后期间，如果囊泡被主动运输，囊泡将继续移动并表现出划分同一囊泡的不同荧光团的人工空间分离。

3.带有两个摄像头的旋转圆盘显微镜是同时实时成像多色囊泡的绝佳替代方案，没有时滞，因为没有过滤器切换。在我们的研究中，我们还使用了转盘显微镜来确认结果。来讲图像质量，落射荧光显微镜需要清晰图像小号个别囊泡。

4.在我们的研究中，蛋白质在其 C 端用 EGFP 或 mKate2 标记，并通过成对比较分析它们的运输。不像mKate2，都进行了尝试，其他红色荧光标记，即mRFP的，mCherry的，和红色荧光蛋白，引起一定程度的蛋白质聚集是受影响贩运的是与片山协议等。, 2008.

5.确认添加荧光蛋白标签不会影响蛋白质运输是很重要的。例如，用 EGFP 标记的蛋白质和用 mKate2 标记的相同蛋白质的双重表达表明，这些蛋白质在神经元的细胞内运输过程中表现出完全重叠（Bekku和Salzer ，2020）。

6.同样重要的是，以显示其在加入荧光标记的不与所述标记蛋白的靶向到其正常质膜目的地（干扰例如，到节点，突触，等等）。有关如何设计融合蛋白的说明，请参见(Snapp, 2005)。

7.若要在神经元中同时表达两种蛋白，标记的蛋白亚克隆到诱导型病毒构建pSLIK ，并且它们的表达瓦特作为同时通过多西环素诱导的。

8.对于更长的实时成像（> 5 分钟），可能需要重新聚焦感兴趣的区域，因为尽管安装了自动对焦软件，显微镜载物台仍可能会偏离焦点。

9.对于需要长时间培养的髓鞘形成培养物，通过驱动一个构建体在 FUGW 载体中的表达和pSLIK驱动另一个构建体的表达，可以最好地实现两种构建体的共表达。神经元与两个pSLIK构建体的共同感染对旧培养物中的表达产生不利影响，可能通过损害双重感染神经元的存活或双重表达。

食谱

HEK293细胞培养基
d MEM

10% 胎牛血清

2 mM L-谷氨酰胺

2 毫米 NEAA

1 mM 丙酮酸钠

1 × p enicillin-小号treptomycin

NB培养基
Neurobasal 培养基（用或不用酚红制备）

0.4%克葡萄糖

2% B27 补充剂

2 mM L-谷氨酰胺

50 纳克/毫升 2.5S NGF

NBF培养基
NB培养基

FUDR（最终浓度：10 μ M FdU + 10 μ M Uridin ）

中号
MEM（用或不用酚红制备）

0.4%克葡萄糖

10% 胎牛血清

2 mM L-谷氨酰胺

50 纳克/毫升 2.5S NGF

CF培养基
中号

FUDR（最终浓度：10 μ M FdU + 10 μ M尿苷）

实时成像介质
酚红-无 NB（仅用于神经元培养）或 C（用于共培养）培养基

10 毫米 HEPES

致谢

我们感谢 Erik Snapp 关于使用荧光蛋白标签进行实时成像的建议，感谢 Michael Cammer支持旋转盘显微镜实时成像。这项工作得到了JLS的NIH 赠款（赠款编号 NS043474）的支持。该协议基于J Cell Biology上发表的工作（Bekku和Salzer ，2020 年；doi ：10.1083/jcb.201906071 ）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

所有动物实验均按照纽约大学医学院动物护理和使用委员会发布的相关政策和机构指南进行。

参考

Bekku , Y. 和Salzer , JL (2020)。有髓轴突域成分的独立顺行运输和逆行协同运输。细胞生物学杂志219(6)。
Cavalli, V.、Kujala , P.、Klumperman , J. 和 Goldstein, LS (2005)。Sunday Driver 将轴突运输与损伤信号联系起来。J Cell Biol 168(5): 775-787。
Dzhashiashvili , Y.、Zhang, Y.、Galinska , J.、Lam, I.、Grumet , M. 和Salzer , JL (2007)。Ranvier 节点和轴突初始段是通过不同机制组装的锚蛋白 G 依赖性域。J Cell Biol 177(5): 857-870。
Kaether , C., Skehel , P. 和 Dotti, CG (2000)。轴突膜蛋白在不同的载体中运输：在培养的海马神经元中进行的双色视频显微镜研究。分子生物学细胞11(4): 1213-1224。
Katayama, H.、Yamamoto, A.、Mizushima, N.、Yoshimori , T 和Miyawaki , A. (2008)。GFP 样蛋白稳定性在溶酶体中积累。细胞STRUC功能该33（1）：1-12。
Kim, HA 和Maurel , P. (2009)。原代施万细胞培养物。在：Doering ，L.（E d）。神经细胞培养方案。Springer 协议手册。人类出版社。
Lois, C., Hong, EJ, Pease, S., Brown, EJ 和 Baltimore, D. (2002)。慢病毒载体传递的转基因的种系传递和组织特异性表达。科学295（5556）：868-872。
Salzer , JL, Brophy, PJ 和Peles , E. (2008)。周围神经系统中髓鞘轴突的分子结构域。神经胶质56(14)：1532-1540。
Shin, KJ, Wall, EA, Zavzavadjian , JR, Santat , LA, Liu, J., Hwang, JI, Rebres , R., Roach, T., Seaman, W., Simon, MI 和 Fraser, ID (2006) . 用于基于 microRNA 的条件性 RNA 干扰和协调转基因表达的单一慢病毒载体平台。Proc Natl Acad Sci USA 103(37): 13759-13764。
Snapp, E. (2005)。荧光融合蛋白在细胞生物学中的设计和使用。CURR Protoc细胞生物学21.4.1-21.4.13 。
斯奎托，S 。P 。，奥尔德里奇，T 。H . ，林赛，R 。米。，莫里西，D 。米。，Panayotatos ，N 。，比安科，。小号。米。，弗斯，M 。乙。和扬科普洛斯，G 。d 。(1990) 。神经元细胞系和原代神经元上睫状神经营养因子的功能受体的鉴定。神经元5 (6) ：757-766。
Taveggia, C. 和 Bolino, A. (2018)。DRG 神经元/施万细胞髓鞘共培养。在：伍德胡，A.（E d）。髓磷脂。分子生物学方法，第 1791 卷。Humana 出版社，纽约，纽约。
Zhang, Y., Bekku, Y., Dzhashiashvili, Y., Armenti, S., Meng, X., Sasaki, Y., Milbrandt, J. 和 Salzer, JL (2012)。ranvier 节点的组装和维护依赖于不同的蛋白质来源和靶向机制。神经元73（1）：92-107。