材料和试剂

人脑微血管内皮细胞 (HBMEC) （Stins等人，1997 年；Stins等人，2001 年）
呼肠孤病毒株T1L M1-P208S通过如前所述的反向遗传学从质粒中回收(Kobayashi等人，2007和2009) 。该菌株由 Terence Dermody 实验室设计。
罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）-1640 Medium（默克，目录号：R8758）
胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）š olution 10 × （默克，目录号：9002-07-7）
胎牛血清（FBS）（BI Biological Industries，目录号：04-007-1A）
康宁® NU-血清TM IV生长培养基补充物（康宁® ，生命科学，目录号：55004）
极限必需培养基（MEM）v itamin小号olution 100 × （赛默飞世科学，Gibco公司TM ，目录号：11120052）
丙酮酸钠溶液（默克，Sigma-Aldrich，目录号：113-24-6）
MEM n on - essential a mino a cid Solution 100×（默克，目录号：M7145）
L-克lutamine（默克，目录号：56-85-9）
青霉素小号treptomycin（默克，Sigma-Aldrich公司，目录号：P4333）
两性霉素 B 溶液（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：1397-89-3）
4-（2- ħ ydroxyethyl）哌嗪-1-乙磺酸，N-（2-羟乙基）哌嗪-N' - （2-乙磺酸）HEPES（默克，Sigma-Aldrich公司，目录号：7365-45-9）
蒸馏的 50% 戊二醛（TAAB Laboratories，目录号：G015）
蓝宝石盘 Ø1.4 毫米（Martin Wohlwend，目录号：454）
NUNC TM Ç ELL Ç ulture-吨reated米ultidishes （赛默飞世科学，目录号：140675）
牛血清白蛋白（BSA）（默克，Sigma-Aldrich，目录号：9048-46-8）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（默克，Sigma-Aldrich，目录号：P3813）
超纯军用升的i-Q水
Dumont Tweezers type 4（TAAB Laboratories，目录号：T052）
Dumont Tweezers type 7（TAAB Laboratories，目录号：T050）
四氧化锇电子显微术（EM）小号olution（TAAB实验室，目录号：O015）
醋酸铀（Electron Microscopy Sciences，目录号：22400）
干燥的甲醇（默克，目录号：67-56-1）
丙酮干燥（默克，目录号：1-00299-0500）
812树脂（TAAB Laboratories，目录号：T026）
十二烯基琥珀酸酐（DDSA）（TAAB Laboratories，目录号：D027）
甲基降冰片烯二酸酐（MNA）（TAAB实验室，目录号：MG12）
苄基二甲胺（BDMA）（TAAB实验室，目录号：B022）
BEEM ® Ë mbedding Ç apsule 00（TED PELLA，INC，目录号：130）
GEM ®小号tainless -s TEEL b拉德（TED PELLA，INC，目录号：62-0179）
完美环（电子显微镜科学，目录号：70945）
超金刚石刀 45°干燥（DIATOME，目录号：DU4530）
QUANTIFOIL ® R 3.5/1 多孔碳膜网格 Cu 300 网（QUANTIFOIL ® ，目录号：Q11394）
蛋白 A 金 10 nm (PAG 10 )。来源是细胞显微镜核心（乌得勒支大学医学中心细胞生物学系）
无水乙醇（100% 乙醇）（默克，目录号：64-17-5）
液氮

设备

净水系统（Merck, Milli-Q ® ，型号：Advantage A10）
pH计Basic 20（HACH LANGE SPAIN，Crison ，型号：Basic 20）
碳涂层系统（Leica Microsystems，型号：Leica EM MED020）
细胞培养箱（BINDER，型号：CB 170）
高压玻璃化系统（Leica Micro systems，型号：Leica EM PACT2）
自动低温置换系统（Leica Microsystems，型号：Leica EM AFS2）
通风柜（Flow-Tronic）
超薄切片机（Leica Microsystems，型号：Leica EM UC6）
Field Electron and Ion Company (FEI) Tecnai电子显微镜（FEI，型号：G2 F20 (200 kV)）
电荷耦合器件（CCD）相机（FEI，型号：Eagle 4k×4k）

软件

断层扫描 3 ( https://www.thermofisher.com/ )（EM 软件，ThermoFisher Scientific）。该软件用于Tecnai成像和倾斜系列采集。
IMOD （KREM ER等人，19 96）（https://bio3d.colorado.edu/imod/）被用于对准的原始倾斜系列和断层图像生成的。
Amira ( https://www.thermofisher.com/ )（2D-5D 可视化和分析软件，ThermoFisher Scientific）。阿米拉用于断层图像分割，重建，和可视化。

程序

注意：该协议涉及危险的化合物，即四氧化锇，戊二醛，环氧树脂的操作，和双氧铀乙酸盐。四氧化锇，戊二醛，和环氧树脂是一个接触和吸入的危险。在化学通风橱中准备和使用这些有毒化合物并戴上手套。醋酸铀是一种铀盐，不会造成显着的外部辐射危害，因为 α 粒子不会穿透皮肤的外层。有 β 和 γ 发射器，但 β 也没有足够的能量穿透皮肤，而且 γ 辐射的量很小。尽管如此，醋酸双氧铀具有相关的化学和放射危害，必须采取一些基本的安全预防措施，重点是避免吸入或摄入该材料的可能性。乙酸双氧铀必须被存储和设置的作为低放射性化合物。请仔细阅读每种化合物的官方指南仔细在使用前，并按照当地安全法规。

文化性荷兰国际集团在蓝宝石上的磁盘和病毒感染的细胞
电镀细胞之前，50微米厚的蓝宝石圆盘（1.4毫米直径）必须被小心地用100％乙醇清洗并覆盖着的4碳层- 7-微米使用涂布装置的厚度。大多数细胞系使用这种底物最有效地繁殖。要知道细胞在磁盘的哪一侧，在碳上划一个不对称的字母或数字很有用。
碳涂层必须稳定以避免与磁盘分离。为了在使用前保持稳定，请将碳涂层磁盘放入玻璃盘中，并在 120°C 下烘烤过夜。如果不立即使用磁盘，可以将它们存放在 4°C 的潮湿环境中的冰箱中 2 - 4 周。贮存后，应将这些磁盘辉光放电之前我们Ë作为细胞底物。最后，应该在培养细胞之前对圆盘进行消毒（例如，使用紫外线辐射）。
注意：TEM 网格的辉光放电处理使碳膜表面带负电，使水溶液易于扩散并促进细胞和颗粒的附着。
将蓝宝石盘放在塑料盘中。HBMEC (5× 10 5 个细胞/孔）加入并维持在补充有10% 热灭活胎牛血清 (FBS) 的2 ml 完全 RPMI-1640 培养基（参见配方）中。
细胞在 37°C 和 5% CO 2下孵育24 小时，并以 1 个噬菌斑形成单位 (PFU)/细胞（在培养基中稀释的原液）的感染复数 (MOI) 吸附于呼肠孤病毒株 T1LM1 P208S ℃ 1 小时。
注意：维持培养基必须在呼肠孤病毒吸收之前吸出。
除去接种物后，加入补充有2% FBS 的新鲜 RPMI 培养基，并将细胞在感染后孵育 18 小时 ( hpi )。
出于生物安全原因，HBMEC 在室温 (RT) 下用 1 ml 1% 戊二醛的 HEPES 缓冲液（参见配方）固定 1 小时。
注意：在固定之前，必须吸出培养基。

视频 1. 使用 Leica EM MED020 对蓝宝石磁盘进行涂层

高压冷冻 (HPF)
注意：HPF 是使用 Leica (EM PACT2) HPF 仪器完成的。对于其他 HPF 仪器，可能需要不同尺寸的蓝宝石光盘，并且加载协议可能不同。
从培养皿中取出磁盘，并将它们浸入 PBS 中的 20% BSA。
将带有细胞的蓝宝石圆盘放入填充有 20% BSA 的扁平样品架的空腔中（参见图 2A，Verkade ，2008 年）。BSA 起到冷冻保护剂的作用。可以使用其他冷冻保护剂，包括 FBS 和正常山羊血清 [NGS]。确保样品架中的液体中没有气泡。
将扁平样品架放置在样品架舱中，并通过将它们压在黑色钻石制成的表面上而紧密密封（见图 2）。
使用加载台将样品架加载到 Leica EM PACT2 中（参见图 2）。
要冷冻样品，在触摸屏上按“开始”，系统开始高压冷冻。冷冻完成后，载有样品的荚果落自动至液氮浴中。
检查冷却速度和屏幕上的压力上升。
将豆荚支架放在液氮的插座浴中，然后拧下豆荚支架，将冷冻样品留在浴槽底部。
冷冻后，扁平样品架在液氮下从 EM PACT2 仪器转移到预冷至 -90°C 的 Leica AFS2 冷冻替代系统。
图 2. 加载用于高压冷冻的蓝宝石磁盘。（A）图中显示了与HPF扁平样本保持器（蓝宝石盘的夹层小号TEP乙2）。使用 BioRender.com 准备。（B）扭矩螺丝刀被用于收紧含有吊舱蓝宝石盘（平坦样品架小号TEP乙3）。（C）的分离舱保持器被用于拾取和介绍与样本荚到徕卡EM PACT2（小号TEP乙3）。（d）该吊舱架装入徕卡EM PACT2（的装载台小号TEP乙4）。

冷冻置换和环氧树脂包埋
注意：在装入冷冻替代液之前，始终将冷冻样品保持在液氮中。所有仪器（例如，将样品转移到含有替代液体的管中的镊子）和溶液在使用前都应预冷。
样品冷冻-在-90℃下代替24小时中的1％四氧化锇，0.1％乙酸双氧铀，5％水和2％甲醇的无水丙酮的混合物。
温度以2°C/h 的速率升至 -25 °C ，最后以 5°C/h 的增量升至 0°C。
完成 -90°C 到 0°C 的转换后，机器可以在 0°C 下保持 1 - 2 小时。此过程增加了样品的对比度。如果持续时间超过2小时长，膜会不会还有-保存。
以下所有步骤均在 RT 中进行。用 1 ml 干燥的纯丙酮洗涤样品 3 次，每次 20 分钟。
用丙酮-环氧树脂混合物（参见配方）逐渐渗透样品，以 30%、50%、70% 和 90% 的步骤增加树脂浓度，每次 1 小时。
对于纯环氧树脂的渗透，使用镊子将蓝宝石圆盘与扁平样品架分开，并放入平底ed光束胶囊中。
胶囊填充新鲜制备的环氧树脂，用于在 60°C 下聚合 2 天。

超薄切片术
光束胶囊用一个不锈钢刀片移除，并且蓝宝石盘一个再从与耐热冲击树脂的块分离。将样品装入液氮中几秒钟，然后恢复到室温。重复这两个步骤，直到蓝宝石盘与树脂块分离。
使用不锈钢刀片将样品切成小块（~1 × 1 毫米），并固定在树脂块上作为支架（见图 3）。
使用新的不锈钢刀片手工修剪样品表面以获得梯形形状。
使用带有完美环的超薄切片机 UC6收集半厚切片（~ 350 - 400 nm），并将切片放置在Quantifoil ®铜网格中。
注意：其他类型的网格可用于 ET。

图 3. 安装超微切片样品。（A）在蓝宝石圆盘的分离之后，用嵌入式细胞单层树脂被切成小块的约1 -毫米大小。（B）样品的小片粘贴在以筒状树脂块，其允许安装的在切片机的试样支架的样品。比例尺 = 10 毫米。

在切片的两侧涂上带有基准标记（蛋白 A 金球 [10 nm 直径]，PAG 10 ）的网格，以便更好地对齐和用醋酸铀染色。该协议在图 4中进行了总结。
注意：基准标记是 10 nm 直径的金颗粒，用于在图像重建之前的断层扫描处理期间对齐倾斜图像。
在封口膜片上，每个蛋白 A 金溶液样品滴一滴（参见配方），每个水样品滴三滴。
将金滴上的网格孵化 10 分钟。
依次将网格放在三个水滴上几秒钟，以去除多余的金溶液。
用吸水滤纸吸收多余的液体。
重复小号TEPS ë 1 -E 4 ，温育所述网格的另一侧。
让网格干燥至少 2 小时。
注意：Ť Ó增加图像的对比度，用乙酸双氧铀染色切片。
在封口膜片上，放置一滴 2% 醋酸双氧铀（参见配方）并将网格孵育 20 分钟。
用三滴水清洗网格几秒钟以去除醋酸铀。
用滤纸吸收多余的液体。
允许网格到干燥用电子显微镜成像前至少2小时。
图 4. 电子断层扫描前的网格准备示意图。使用 BioRender.com 创建。

电子Ť omography
使用电子显微镜检查呼肠孤病毒出口区域的部分，选择并保存倾斜系列的感兴趣区域 (ROI)。
在收集倾斜系列之前预先照射 ROI。电子束会对树脂嵌入的样品造成损坏，导致样品收缩，尤其是沿Z轴的收缩（Luther等人，1988 年）。为避免在断层扫描过程中出现此问题，重要的是预先照射 ROI，包括比 ROI 更大的区域，因为外部区域稍后可能会进入现场。
注意小号：
约2 ，每平方000电子甲ngstrom在低放大倍数（2 ，000 × EM-照射的）是足以允许的ROI假定足够的尺寸和稳定性。
ROI 不应靠近网格条，因为网格条会在高倾斜角度阻止采集。
单轴和双轴 ET 使用Tecnai G2 F20 透射电子显微镜 (FEI) 在 200 kV 下运行。
样品在电子显微镜内倾斜以从许多不同角度产生透射电子显微镜图像，从而产生倾斜系列。
采集倾斜系列自动以1℃的增量在一个angul Ë范围的-60°〜60°。相机参数应设置为允许样品的最佳分辨率和对比度。在我们的研究中，我们获得了标称放大倍数为 ×11,500 的倾斜系列，导致像素大小为 1.01 nm。
使用 Eagle 4k × 4k 慢扫描电荷耦合器件 (FEI)和断层扫描 3 软件记录图像。
要进行双轴 ET，在样品围绕垂直于其支撑平面的轴旋转90°后收集第二个倾斜系列。
注意：双轴或双倾斜 ET 增加了收集的信息并减少了采集和重建的伪影（Mastronarde ，1997）。

断层图像处理
注意：ET 获得的不同视角用于重建 3D 视图，该视图在三个维度上解析呼肠孤病毒出口细胞器的超微结构。
下载并安装 IMOD 软件以对齐倾斜系列并获得断层扫描重建。
启动eTomo ，提供设置面板中的条目。关于倾斜系列的重要参数是：
轴类型：单轴或双轴
帧类型
像素大小和基准直径
倾斜角度
注意：在此设置面板中，可以删除排除的视图（不适合分析的图像）。
设置面板完成后，激活创建 Com 脚本。
预处理。运行Ccderaser以擦除图像中的 X 射线和其他伪影。X 射线模型创建了一个可以保存和使用的固定堆栈。
粗对准。使用Tiltxcorr计算互相关，以确定将每个图像与前一个图像对齐所需的 X 和 Y 平移，生成粗对齐堆栈。
基准模型生成。有多种方法可以生成基准模型。我们在零度视图中选择了分布均匀的基准点或金珠，并使用Beadtrack在倾斜系列的其余部分中找到它们的位置。最后，创建了一个种子模型。可以手动或自动标记种子点。对齐过程的概述如图 5 所示。
精细对齐。使用Tiltalign执行对齐并在该过程完成后检查日志文件中的结果。可以查看残差向量模型，该模型给出了对齐质量的概念（参见图 5）。残差向量越小，对齐越好。良好对齐的典型平均残差值约为 1 个像素。
断层扫描定位。准备一个简单的模型，在 Y 中三个位置的截面顶面和底面上有水平线。划定截面的厚度很重要。定义截面的边缘后，选择自动查找边界模型，创建边界模型（见图 5）。
最终对齐堆栈。使用Newstack获取对齐的堆栈。作为一个选项，可以在此步骤中校正显微镜 CTF（对比度传递函数）并过滤对齐的堆栈。
断层扫描生成。使用倾斜生成断层图。
注意：在双倾斜断层扫描中，称为 A 和 B 的两个断层扫描图像是分开处理的。断层图A首先对齐，表明它是双轴。使用其基准点（将断层图像 B 与 A 匹配）参考断层图像 A 对齐断层图像 B。结果，准备了组合断层图像。
图 5. IMOD 软件的屏幕截图。显示了使用断层图对齐构建的代表性模型。

断层图像分割和 3D 可视化
断层图像分割和三维可视化用进行的阿米拉软件。
在 Amira 界面中加载断层图 (.rec) 并应用高斯滤波器（3D 类型）以降低噪声。
一个Orthoslice可以进行可视化和比较断层扫描与过滤的X线断层。
过滤后的断层图使用函数LabelField进行分割，它允许在图像中标记不同结构的区域。在断层扫描的所有图像中标记结构是一项繁琐的工作，可以使用插值功能简化。插值功能允许在标记图像后自动完成分割。
注意：验证 Interpolate 功能是否运行良好很重要，因为有时必须对某些标记图像或结构进行自动分割的手动更正。
Arithmetic 和Isosurface函数用于在 3D 中可视化结构。
注意：标记结构的阈值是使用每个结构的直方图获得的。使用Isosurface调整阈值可改善重建的可视化。

数据分析

我们使用 3D-ET 来分析呼肠孤病毒的出口途径。图 6 中所示的断层图是使用半厚切片 (350 nm) 获得的，这使我们能够识别不同结构之间的空间关系。ET 对 VI-SO-MC 界面的分析揭示了这些结构之间存在物理连接（图 6）。断层图的计算切片与 3D 可视化相结合，显示 VI 和 SO（图 6A 中的虚线框）以及 SO 和 MC（图 6B 中的虚线框）之间存在膜连续性点。这些相互作用仅限于几个计算切片，表明这些隔间之间的关联是通过在图 6A 和 B 所示的更高放大倍率图像中观察到的离散通道发生的。

图6.的电子断层扫描的呼肠孤病毒出口机械。（A 和 B）HBMEC 被呼肠孤病毒 T1L M1-P208S 以 1 PFU/细胞的 MOI 吸附，并在 18 hpi通过高压冷冻、冷冻置换和半厚切片进行处理。单倾斜断层扫描和 3D 重建显示呼肠孤病毒出口机器（虚线框）的组件之间的连接。(A)中分选细胞器 (SO) 和病毒包涵体 (VI)或通过 (B) 中的通道附着在 SO 上的膜载体 (MC)之间的特定膜融合点的更高放大倍数。mi，线粒体。比例尺 = 500 nm A 和 B；在更高的放大倍数下为 100 nm。© 2020 费尔南德斯·德卡斯特罗等人。最初发表于J Cell Biol https://doi.org/10.1083/jcb.201910131。

我们使用双倾斜 ET 来研究呼肠孤病毒出口途径的最后步骤（图7 ）。通过 ET 和 3D 重建对质膜上的 MC进行检查，揭示了出口前载体形态和病毒粒子出口机制的细节。成熟的病毒粒子沿着 MC 内的膜或通道阵列分布（图 7A），这可能会增加 MC 的承载能力或病毒运输的效率。3D体积描绘了MC和它与细胞膜缔合（图的总含量小号7B和C）。因此，在充满病毒的 MC 接触质膜后，后代呼肠孤病毒颗粒通过不同的出口区离开受感染的细胞（Fernandez de Castro等，2020）。

图 7.膜状载体的电子断层扫描。HBMECs 被呼肠孤病毒 T1L M1-P208S 以 1 PFU/细胞的 MOI 吸附，并在 18 hpi通过高压冷冻、冷冻置换和半厚切片进行处理。(A) 计算机断层扫描切片显示膜载体 (MC) 与膜通道 (白色箭头) 和病毒粒子 (白色箭头) 靠近质膜 (PM)。（B）的3D重建的MC overlapp的ING用二维计算切片。(C) 显示分割后 MC总内容的 3D 卷的一个视图。成熟的病毒粒子，蓝色；通道，米色；膜质载体，浅棕色；质膜，绿色。比例尺 = 200 nm。© 2020 费尔南德斯·德卡斯特罗等人。最初发表于J Cell Biol https://doi.org/10.1083/jcb.201910131。

该ET实验中有至少两个生物学重复进行。记录了显示不同呼肠孤病毒出口区的八张断层图，并从九张断层图分析了 VI-SO-MC界面。使用两样品不等方差确定统计学显着吨-试验用双尾分布。

笔记

呼肠孤病毒株 T1L M1-P208S 与原型 T1L 株相同，除了 μ2 蛋白（由 M1 基因编码）的第 208 位脯氨酸到丝氨酸的取代。这种突变将包涵体形态从丝状变为球状（Parker等，2002）。
在倾斜系列对准中，最关键的部分是基准标记在截面中的分布。只有在每个部分中维护的那些基准点才应该在同一 Z 平面上进行标记，并且它们应该在整个部分中均匀分布。

食谱

完整的 RPMI-1640 介质
10％女小号erum
1% MEM 维生素
1％小号裂果丙酮酸
1% MEM 非必需氨基酸
1% L-谷氨酰胺
1% 青霉素/链霉素
0.1% 两性霉素
商店在 4° ç
HEPES 0.4 M
9.54 克 HEPES
米尔添加升I-Q水至50ml，直至HEPES完全溶解拌匀
用 1N NaOH 溶液调节 pH 值至 7.2 - 7.4
添加英里升I-Q水至100毫升
储存在 4 °C
环氧树脂
使用塑料巴斯德吸管称量环氧树脂组分。
通过倒转管数次混合树脂组分。
使用时必须添加加速器 (BDMA)。
将混合物以14,100 × g离心10 分钟以消除小气泡。
19.2 克 812 树脂
7.6 克 DDSA
13.2 克 NMA
0.8 克（或 20 滴）BDMA
Protein A Gold 或基准标记溶液
在水中混合胶体金溶液（1:50 比例）
每次都新鲜制备此溶液
注意：基准标记的稀释（和大小）取决于倾斜系列采集的放大倍数。放大倍数越高，基准点越密，黄金尺寸越小。

致谢

这项工作得到了公共卫生服务奖 AI032539（TSD 和 CR）的部分支持。特别感谢马丁Sachse的博士整个工作和手稿的严格审查专家技术咨询和支持，弗朗西斯博士哈维尔Chichón从CNB-CIB（CSIC）CR yoEM与ET技术咨询机构，和克里斯蒂娜·帕蒂诺，比阿特丽斯·马丁，和Pablo机Solá从CNB（CSIC）EM设施。该协议改编自以前的工作：Fernández de Castro等人。，Ó riginally发表在细胞与生物学https://doi.org/10.1083/jcb.201910131。

参考

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