材料和试剂

1. 60 - mm 培养皿（Tarsons ，目录号：460061）
2.吊具（Tarsons ，目录号：920081）
3. 99.99% 铂丝（Sigma-Aldrich，目录号：267201）
4.线虫：N2（野生型（WT）和做P-2（vs105）成年动物用3 - 4个鸡蛋（明尼苏达大学，秀丽隐杆线虫遗传中心）
5.大肠杆菌OP50（明尼苏达大学，Caenorhabditis遗传中心）
6.乙醇（EtOH）（Fisher 化学品，目录号：UN1170）
7.胆固醇（SRL Sisco Research Laboratories，目录号：54181）
8.氯化钙二水合物（CaCl 2 · 2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C3306）
9.硫酸镁（MgSO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
10.磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P5379）
11.磷酸二氢钾（K 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P8281）
12.氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
13. Bacto -agar（HiMedia Laboratories，目录号：GRM026）
14. Bacto-蛋白胨（BD，目录号：211677）
15. 400mM的乙醇（见配方小号）
16. 5mg / ml的胆固醇（见配方小号）
17. 1M的氯化钙2储液（见配方小号）
18. 1M的用MgSO 4储备溶液（见配方小号）
19. 1M的KPO 4 ，pH 6.0的储备溶液（见配方小号）
20.线虫生长培养基（NGM）琼脂板（参见配方小号）

设备

移液器仪（Eppendorf，型号：研究®加，目录号：2231000224）
2 - L玻璃锥形瓶（DWK Life Sciences，DURAN，目录号：2121763）
高压釜（Equitron-7431 SLEFA）
显微镜（蔡司，型号：Stemi 2000 C）

软件

GraphP ad Prism v6（GraphPad 软件）
ImageJ的（由开发该研究所Š健康）

程序

制备60 -毫米NGM高原ES为所述维护的秀丽隐杆线虫。在无菌条件下，在细菌罩中用大肠杆菌OP50（作为秀丽隐杆线虫的食物）接种平板，并使其在 37°C 下生长过夜。
通过漂白同步线虫菌株进行分析。收集的从用1ml M9溶液中的NGM板动物在2 -毫升微量离心管（MCT）。添加400 μ以中等速度向管和涡流5分钟：升新鲜制备的漂白剂溶液（1比5 N氢氧化钠和次氯酸钠的1）。在6 , 097旋转 MCT× g ( 40 00 rpm ) 60秒，弃上清。W¯¯灰60上的用新鲜的M9再次沉淀和板-毫米NGM板。
为了进行该测定，制备新鲜60 -在4℃下直到使用含有所述测定和存储的前一天8毫升媒体毫米（NGM）板。
上的天的测定中，干燥3在层流气流将板- 4小时用的盖子打开。
扩展400毫米（196 μ升）100％乙醇上的博士ÿ 60 -与使用玻璃吊具8毫升媒体毫米的板。博士ÿ （不含乙醇板- EtOH中）被用作对照板。
密封吨用parafilm他EtOH中测定板，以避免乙醇和任何损失的地方，在20℃进行2 ħ以允许EtOH中横跨板平衡。
EtOH 检测板现已准备就绪，可用于检测。
转移10只动物的基因型从正在研究接种的板（+食品），以非种子选手板（-食品）15 - 20秒（摆脱食物的）。接下来，将动物转移到测定板或对照板，并在 20°C 下静置2小时。
观察线虫2后- ħ时间间隔。计数平板上的动物的数量，并使1 -分钟的视频的每个动物观察和分析通过计算运动器官行为的身体弯曲的数目（前和后）和振幅来表征的行为。
身体弯曲的数量是使用 ImageJ 手动评分的，同时在分析前后身体弯曲时保持相同的参数（图 1A）。
计算所述的振幅的手动使用NIH ImageJ软件，身体弯曲孔定量达分别荷兰国际集团的前部和后部主体弯曲。到孔定量泰特的振幅的身体弯曲，米easure主体弯曲的最深角度之间的距离。画一条从头部尖端到身体中部的切线，并测量从该线到身体的垂直距离作为前身体弯曲的幅度（图 1B）。相应地，从中间部分到所述动物的尾部，是为后体弯曲振幅（图1B）获得的测量结果。归一化的测量到的动物在微米至导出测量值的长度。

图标描述已自动生成
图1 。形象代表ü的sed对于该分析的身体弯曲的幅度。A.图像分别代表前体弯曲和后体弯曲的评估。B.图像表示身体弯曲的幅度；双面箭头描绘š的中前部和后部区域振幅（AMP）。

执行基于时间轴的分析B的ehavior。从EtOH博览会开始URE ，不同的时间点（30，60，120，300分钟），包括曝光过夜（16小时）是analyz ED（图2A）。

图标描述已自动生成
图2 。EtOH 处理秀丽隐杆线虫以研究 EIS 行为的时间表插图。A.时间点表示 WT 动物在 EtOH 暴露后的不同阶段，如时间线所示。测试身体弯曲的数量和幅度的实验在约 2 小时进行。B.的EIS行为插图，其中WT动物从EtOH恢复-诱导的麻痹和显示正常的正弦运动，而DOP-2突变体动物显示出乙醇-诱导的镇静行为（潘迪等人，2021）。

WT动物在乙醇麻痹后2 小时表现出正常行为（视频 1）。尽管多巴胺自身受体，DOP -2 ，突变体动物显示的EtOH -i EP3受体激动剂诱导小号edative（EIS）在同一时间点（图2B和视频2）的行为。

图形用户界面描述已自动生成
视频 1 . 代表性的六DEO的WT动物表示单线虫已经从EtOH中回收-诱导的麻痹。所述动物可以看出，在正常的正弦波运动-状图案，与没有可观察到在运动缺陷（潘迪等人，2021）。

图形用户界面，应用程序描述已自动生成
视频2 。代表性的视频的由示出的EIS行为DOP-2突变体线虫在2在EtOH中曝光- h时相点。该动物表现出运动缺陷，并通过拖动其后部区域来移动（Pandey等人，2021 年）。

从EIS行为恢复可以观察到在后转移突变体动物与正常食物NGM板一个2 -小时暴露于EtOH中。dop-2突变体在转移后1小时从 EIS 表型中恢复。

数据分析

分别计算在1前部和后部的身体弯曲数-在2分钟视频- ħ时间点。
软件：GraphPad Prism v6。
转移10只动物每块测定板，并执行的一式三份实验每个菌株。
统计分析：使用单向方差分析来确定统计P 值。

笔记

干燥所述NGM板完全是即时通讯portant ，和冲浪的ACE的板应该是免费从任何灰尘或用于适当可视化的其他表面像差的轨道。
用封口膜密封板以避免乙醇损失和适当的平衡。

食谱

5 毫克/毫升胆固醇
加入500毫克的胆固醇至百毫升95％乙醇，并通过在室温下混合旋转为几个小时以溶解。
储存在 4°C。
1 M CaCl 2原液
将 14.7 g CaCl 2 · 2H 2 O溶解在 100 ml ddH 2 O 中，并在 121°C 下高压灭菌 15 分钟。
储存在 4°C。
1 M MgSO 4储备溶液
将 12.04 g MgSO 4溶解在 100 ml ddH 2 O 中，并在 121°C 下高压灭菌 15 分钟。
储存在 4°C。
1 M KPO 4 ，pH 6.0 储备溶液
将 108.3 g KH 2 PO 4和 35.6 g K 2 HPO 4 混合在 500 ml ddH 2 O 中。
加入 NaOH 调节 pH 至 6.0 ；最后补到1升。
分装溶液并在 121°C 下高压灭菌 15 分钟。
储存在 4 °C。
线虫生长培养基 (NGM) 琼脂平板
加入3克氯化钠16克细菌用-琼脂和2.5g细菌用-peptone到975毫升的DDH 2 ○在2 -大号烧瓶中。
在 121°C 下高压灭菌 50 分钟。
允许的NGM琼脂到冷却到55 - 60℃。添加 1 ml 5 mg/ml 胆固醇、1 ml 1 M CaCl 2 、1 ml 1 M MgSO 4和 25 ml 1 M KPO 4 ，pH 6.0。
400mM的È THANOL
传播196毫升乙醇8 ml培养基在60 -毫米板。
密封用石蜡膜板和允许equilibrat离子在20℃。

致谢

该协议改编自 (Pandey et al. , 2021)。AS感谢该协会科学和工业研究委员会（CSIR）的-大学教育资助委员会（教资会）的研究生奖学金。PP从科学与技术（DST）的一个部门承认的支持-口碑Ë n个科学（WOS-A）授予，以及从过去的资金与生物技术（DBT）生物系护理，在科学教育和研究的印度理工学院(IISER) Mohali ，以及授予 KB 的 IA 赠款。KB 是印度联盟 (IA) 的中级研究员，目前是 IA 高级研究员。KB 感谢联盟提供资金支持。KB也感谢DBT，DST -科学与工程研究理事会（SERB），以及人力资源开发部（MHRD）-方案转型和高级研究在科学（STARS）的资金支持。

资金
这个工作是由DBT /支持威康信托印度联盟研究金[资助号IA / S / 19 /504649分之2和IA / I / 12 /五十万○五百十六分之一]授予KB和部分地由DBT，MHRD-STARS支持，并DST-SERB 向 KB 授予 [BT/PR24038/BRB/10/1693/2018、STARS/APR2019/BS/454/FS 和 SERB/F/7047] 以及 DBT-IISc 合作伙伴关系资助。PP是由DST WOS-A基金的支持[SR / WOS-A / LS-二千〇一十八分之二百八十五]和由DBT BIOCARE较早支持准予[ BIOCARE / 01/10167]。

利益争夺

在一个uthors声明没有冲突小号的利益或竞争利益小号。

参考

白克，JH（2013 年）。奖励相关行为中的多巴胺信号。前神经电路7：152。
Chase, DL, Pepper, JS 和Koelle , MR (2004)。秀丽隐杆线虫突触外多巴胺信号传导机制。Nat Neurosci 7(10): 1096-1103。
Davies, AG, Pierce-Shimomura, JT, Kim, H., VanHoven , MK, Thiele, TR, Bonci , A., Bargmann , CI 和 McIntire, SL (2003)。BK 钾通道在秀丽隐杆线虫乙醇行为反应中的核心作用。单元格115(6)：655-666。
Davies, AG 和 McIntire, SL (2004)。使用秀丽隐杆线虫筛选乙醇和改变行为的药物的目标。Biol Proced Online 6：113-119。
Imperato , A. 和 Di Chiara, G. (1986)。乙醇优先刺激自由运动大鼠伏隔核中的多巴胺释放。J Pharmacol Exp Ther 239(1): 219-228。
Lee, J., Jee , C. 和 McIntire, SL (2009)。C. elegans 中的乙醇偏好。基因脑Behav 8（6）：578-585。
Pandey, P.、Singh, A.、Kaur, H.、Ghosh-Roy, A. 和 Babu, K.（2021 年）。增加的多巴胺能神经传递导致秀丽隐杆线虫的乙醇依赖性镇静行为。PLoS基因17(2)：e1009346。
Weiss, F., Parsons, LH, Schulteis , G., Hyytia , P., Lorang , MT, Bloom, FE 和Koob , GF (1996)。乙醇自我给药可恢复依赖大鼠中累积多巴胺和 5-羟色胺释放的戒断相关缺陷。J Neurosci 16（10）：3474-3485。