材料和试剂

1. PD-10 柱 Sephadex G-25（20 × 80 mm）（GE Healthcare，目录号：17085101）；在室温下储存
2. 15 ml锥形离心管（无RNase）（VWR，目录号：10026-076）或等效物
3. 50 ml锥形离心管（无RNase）（VWR，目录号：10026-078）或等效物
4. 1.7 ml微量离心管（无 RNase）（Denville，目录号：C2170）或同等产品
5. PCR 管（USA Scientific，目录号：1402-2900）或等效物
6.超速离心管（Beckman Coulter，型号：10.4 ml 聚碳酸酯瓶，带用于Ti80 转子的帽组件（16 × 76 mm）；目录号：355603） 7.体积血清移液管，无 RNase，25 ml（Denville Scientific Inc，目录号：P7129）和 5 ml（Denville Scientific Inc，目录号：P7127）或等效物
8. 25 mm 注射器过滤器（康宁，目录号：431224）
9.快速流动瓶顶PES过滤器，500毫升（Thermo Scientific，目录号：73520-994）
10.无菌巴斯德移液器（Thomas Scientific，SteriPettes，目录号：1215D97）或等效物
11. BY4741 菌株（Fisher Scientific；Dharmacon Inc，YEAST PARENT STRAIN BY4741，YSC1048）；-80°C 储存在 YPD/20% 甘油储备中
12.蛋白胨（Research Products International，目录号：P20250）；在室温下储存
13.酵母提取物（Thermo Scientific，目录号：J23547-A1）；在室温下储存
14.葡萄糖（VWR，BDH Chemicals，目录号：BDH9230）；在室温下储存
15. Bacto-agar（VWR，Life Sciences，目录号：J637）；在室温下储存
16. RNase away 溶液（Thomas Scientific，目录号：1236B62）；在室温下储存
17. HEPES 游离酸（VWR Life Sciences，目录号：0511）；在室温下储存
18.醋酸钾，C 2 H 3 O 2 K（Bio Basic，目录号：PB0438）；在室温下储存
19.醋酸镁四水合物，C 4 H 6 MgO 4 · 4H 2 O（Sigma，目录号：M5661）；在室温下储存
20.甘露醇粉（VWR BDH Chemicals，目录号：BDH9248）；在室温下储存
21.二硫苏糖醇（DTT）（Sigma，目录号：D0632）；4°C 保存
22. Renilla 荧光素酶质粒，pRL-null（Promega，目录号：E2271）；储存在-20°C
23.萤火虫质粒，pGEM-luc（Promega，目录号：E154A）；储存在-20°C
24.纳米荧光素酶质粒，pF4Ag NanoLuc（Addgene，目录号：137777）；储存在-20°C
25. DNA清洁和浓缩试剂盒（ZYMO RESE ARCH，目录号：D4004）；在室温下储存
26. mMESSAGE mMACHINE TM T7 转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ，目录号：AM1344）；储存在-20°C
27.肌酸激酶，兔肌肉（BioVision，目录号：P1301）；储存在-20°C
28.磷酸肌酸（VWR，目录号：97061-328）；储存在-20°C
29. GTP 溶液，100 mM（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0461）；储存在-20°C
30. RiboLock RNase 抑制剂，40 U/ μ l（ThermoFisher Scientific，目录号：EO0381）；储存在-20°C
31. Renilla萤光素酶测定系统（Promega，目录号：E2810）；储存在-20°C
32.萤火虫荧光素酶测定系统（Promega，目录号：E1500、E4030、E4550）在-20°C下储存
33. Nano-Glo 荧光素酶检测系统（Promega，目录号：N1110、N1120）在 -20°C 下储存
34. Renilla荧光素酶单克隆抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号：SR07-830），4°C保存
35. TAP 多克隆抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号：CAB1001），4°C 保存
36. Rpl3 单克隆抗体(ScRPL3, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa) ，4°C 保存
37. EasyTag EXPRESS 35 S 蛋白质标记混合物，[ 35 S]-，2 mCi，11 mCi/ml（PerkinElmer，目录号：NEG772002MC），储存在 4°C
38.三氯乙酸，TCA（Sigma，目录号：T6399）；4°C 保存
39. UltraPure Agarose（Invitrogen，目录号：16500）；在室温下储存
40.甲酰胺（Sigma，目录号：47670-25ML-F）；在 -80°C 下以 1 ml 等分试样储存
41. SYBR 金核酸凝胶染色剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ，目录号：S11494）；储存在-20°C
42.可选：Hybond-N+ 尼龙膜（GE Healthcare，目录号：NS0921）；在室温下储存
43.可选：TRI-REAGENT-LS（Molecular Research Center Inc.，目录号：TS 120）；4°C 保存
44. HCl（GFS Chemicals，目录号：43491）；在室温下储存
45.甘油（VWR Life Sciences，目录号：BDH1172）；在室温下储存
46.液氮
47. DreamTaq PCR master mix（2 × ）（ThermoFisher Scientific，目录号：K1071）；储存在-20°C
48. GeneRuler DNA 阶梯混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM0333）；短期储存 4°C，长期储存 -20°C
49. ATP 溶液，100 mM（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0441）；储存在-20°C
50. 20 种必需氨基酸的 1 mM 溶液，完整（Promega，目录号：L4461）；储存在-20°C
51. 1 mM 必需氨基酸溶液，不含甲硫氨酸和半胱氨酸（Promega，目录号：L5511）；储存在-20°C
52.甲醛溶液，37%（GFS Chemicals，目录号：40301）；在室温下储存
53. EDTA，0.5 M 无菌溶液，无 RNase（VWR Life Sciences，目录号：E522-100ML）；在室温下储存
54.酵母培养基（见食谱）
YPD培养基
YPD-琼脂平板
55.原液（见配方）
1 M HEPES -KOH，pH 7.6
2 M KOAc
300 mM MgOAc
100 mM MgOAc
1 M 数字电视
50% 甘油
56.工作解决方案（见食谱）
缓冲液A
缓冲液 A/甘油
缓冲液 A/甘露醇
缓冲液 A/甘露醇/DTT
缓冲液 A/甘油/DTT
肌酸激酶稀释缓冲液
肌酸激酶溶液
10×能源组合
FAE解决方案

设备

-80°C 冰箱
-20°C 冰箱
实验室水净化系统（PureLab，型号：Elga 净水器系统）或同等产品
pH 计（Sartotius，型号：PB-11-P11.1）或同等产品
可选：层流罩（NuAir，NU-201-430）
微生物培养箱（Binder World，ED 系列）或同等产品
培养摇床仪（Eppendorf ，型号：新不伦瑞克伊诺® 43）或等效的温度控制振荡器可以容纳一个4大号烧瓶
制备型离心机（Beckman Coulter，型号：J 2-MI）或同等产品
Beckman JLA-10.500 转子 ( Beckman Coulter) 或同等产品
制备型超速离心机（Beckman Coulter，型号：L e -80）
贝克曼超速离心机转子（贝克曼库尔特，型号：Ti80）
带有 A-4-62 转子的Eppendorf离心机，冷藏（Eppendorf，型号：5810R）
台式离心机（Eppendorf，型号：5420）
Freezer/Mill ® （SPEX SamplePrep，型号：6700）或同等低温研磨机
Freezer/Mill ®配件：小研磨瓶套装（SPEX SamplePrep，目录号：6751）
Toplanding 天平（Sartorius，目录号：CP3202P）或同等产品
移液器（吉尔森，P20，P200 ，和P1000）或等效
涡流器（任何型号）
分光光度计（Eppendorf，目录号：6131-26951）或同等产品
500 毫升锥形瓶
4升锥形瓶
带密封盖的 PPCO 离心瓶，500 ml（Thomas Scientific，目录号：2625H84）或等效物
Ť ħ ermocycler仪（Eppendorf，型号：的Mastercycler ® ）或等效
干浴培养箱（Eppendorf，型号：Thermomixer R）
光度计（Promega；型号：Glomax 20/20）或同等产品
液体闪烁计数器（Beckman Ls System，型号：Ls6000Ta）或同等产品
电源（Bio - Rad，型号：PowerPac Universal Power Supply，目录号：1645070）或同等产品
琼脂糖凝胶电泳设备（Mansour 和 Pestov，2013）
凝胶摇杆平台（Thomas Scientific，BioRockerTM 3D Mini Rockers，目录号：1155J96）或同等产品
Typhoon 成像仪（GE，型号：Typhoon 5 Biomolecular Imager），或任何凝胶成像系统（例如，Cole-Parmer，型号：DelLogic 100 成像系统，或同等产品）
蛋白质凝胶电泳设备（Bio - Rad，型号：Mini-PROTEAN tetra Vertical Electrophoresis Cell，目录号：1658004）或同等设备
可选：聚丙烯酰胺凝胶电泳设备（Hoefer Inc，型号：SE260 Mighty Small II Delux Mini Vertical电泳装置）
可选：转移细胞（BIO - RAD，反式印迹® SD半干转移细胞，目录号：1703940）或等效
可选：杂交炉（UVP，型号：HB-1000 Hybridizer）或同等产品

程序

具有翻译活性的酵母CFE的制备可分为三个阶段：（1）酵母细胞的生长、收获和低温破碎；(2) 从总细胞裂解物中分离出具有翻译活性的部分；(3) CFE 翻译活动的验证。下面描述的程序适用于 BY4741 细胞的 1 L酵母培养物。这是我们建议用于 CFE 制备的最小体积。如果需要，该协议也可以扩大规模。

酵母细胞的生长、收获和低温破坏
该程序的这一部分的目的是制备 CFE 将从中获得的冷冻研磨酵母细胞粉末。
在盘子上种植酵母（提前 2-4 天）
在 YPD 琼脂板上对感兴趣的酵母菌株进行条纹，以实现单菌落生长。在培养箱中以最适合菌株的温度孵育板，直到菌落直径为 1-1.5 毫米。我们通常在此过程中使用 BY4741 菌株及其衍生物。根据菌株的基因型，菌落在 30°C 下可能需要 2 到 4 天才能生长。
一般准备和开始酵母培养（第 1 天，〜2-3 小时）
确保酵母培养基和该程序所需的所有溶液都已准备好并在适当的温度下储存。
高压灭菌 2-3 L 的去离子 H 2 O 并将其储存在 4°C（以下称为“冷 diH 2 O”）。
高压灭菌大离心瓶（400 毫升或类似物）。将高压灭菌的离心瓶、一袋 50 毫升、一袋 15 毫升锥形离心管和一袋 1.7 毫升微量离心管置于 -20°C。
将一个大的酵母菌落接种到 100 毫升的 YPD 培养基中，放入无菌的 500 毫升烧瓶中。将烧瓶放入轨道摇床中，在 30°C 下适度摇晃（~160 rpm）培养 14-20 小时。
生长和收获酵母细胞（第 2 天，~6-7 小时）
将在S 步骤A2d开始的隔夜培养物接种到 4 L 烧瓶中的 1 L 新鲜 YPD 中，以获得 OD λ = 600nm ~0.8。将此培养物在 30°C 下孵育 5-6 小时，并不断摇动直至 OD λ = 600nm ~2.5。
根据我们的经验，一个纽约州从这些参数偏差显著降低要么CFE产量或它在翻译反应活性。对于生长缓慢或非 BY4741 菌株，可能需要优化稀释因子。避免长时间培养日间培养物，这会消耗培养基中的葡萄糖并改变细胞代谢。
而培养的不断增长，冷却到4℃以所用的所有的转子和离心机小号TEPS A3c- A3以下（例如例如，一个JLA-10.500转子制备为用Beckman J2-MI离心机大离心瓶中，和A-4-62 转子，用于与 Eppendorf 5810R 离心机一起使用的 50 ml 试管）。
当细胞培养密度达到 OD λ =600nm ~2.5 时，将细胞培养物倒入预冷的大离心瓶中。在 4°C 下以 3,700 × g 的速度收获细胞6 分钟（在 Beckman JLA-10.500 转子中为 5,500 rpm）。
弃上清，将细胞沉淀重悬在总体积为 250 ml 的冷 diH 2 O 中。4°C 下以 3,700 × g 的速度沉淀 diH 2 O 洗涤的细胞6 分钟（Beckman JLA-10.500 转子中的 5,500 rpm） .
为了重悬细胞沉淀，我们使用容量为 25 ml 的塑料吸管并定期轻轻旋转离心瓶，直到形成均匀的细胞悬浮液。不要涡旋细胞沉淀。我们通常将在此步骤中获得的细胞悬液分在两个离心瓶之间，这样可以更容易地在下一步中重悬细胞沉淀。
丢弃上清液，在总体积为 100 ml 的冷 diH 2 O 中重悬细胞沉淀。在冰上工作，将细胞悬浮液转移到两个冷的、无菌的 50 ml 离心管中。在 4°C 下以 3,220 × g离心 5 分钟（在带有 A-4-62 转子的 Eppendorf 5810R 离心机中 4,000 rpm）沉淀细胞。
冷冻细胞/缓冲珠的制备（第 2 天，~2 小时）
在所有步骤中，将含有酵母细胞的离心管保持在冰上。使用液氮时，请采取适当的安全预防措施并戴上护目镜。
洗涤细胞沉淀一次用冷的缓冲液A /甘露醇和一次用冷的缓冲液A /甘露醇/ DTT（25毫升，每管;离心细胞作为在小号TEP A3E上文）。在最后一次洗涤期间将细胞悬液混合在一个管中。
使用连接到真空瓶的巴斯德吸管从管中吸出多余的缓冲液。确定酵母细胞沉淀的重量。使用空的 50 ml 离心管去皮重。通常，我们从生长到最终 OD λ = 600nm ~2.5的 1 L酵母培养物中获得 ~5 g 的湿细胞材料。
重悬酵母沉淀在缓冲液 A/甘露醇/DTT 中，体积 (ml): 颗粒重量 (g) 比为 2:3。
例如，对于 5 g 酵母细胞，使用 3.3 ml 缓冲液。细胞悬液会很稠。确保将细胞悬液保持在冰上。
将约 25 毫升液氮倒入固定在塑料架中的干净 50 毫升“收集器”管中。将机架放在冰桶或干净的泡沫塑料容器内，部分充满液氮（如图 1A 所示）。等待约 10 分钟，以确保整个设置彻底冷却。
收集从细胞悬浮液小号TEP A4C以上至5mL体积的塑料吸管。将移液器尖端保持在液氮水平上方约 5-6 厘米以避免尖端冻结（图 1A），将细胞悬浮液逐滴喷射到充满液氮的收集管中。为了形成单独的细胞/缓冲液珠，在添加下一个之前让每一滴都冻结；添加液滴过快会导致团块形成，这会使在程序的后期将珠子装入研磨瓶中变得复杂。如果需要，在收集管中加入更多的液氮。

图 1. 用于冷冻溶解的冷冻细胞/缓冲液珠制备的图示。为确保分离良好的珠子，以 3-5 秒的间隔缓慢弹出细胞悬浮液。使用两个收集器管并为每个液滴在它们之间切换（如面板 A 所示）可以加快过程，同时允许液滴正确冻结。然后应将细胞/缓冲液珠组合在一个管中进行储存，如面板 B 所示。

当最后一滴冷冻时，小心地从收集管中丢弃多余的液氮。将管子松松地盖上以允许排气，并将冷冻的细胞/缓冲珠（图 1B）置于 -80°C 以进行储存。冷冻的细胞/缓冲液珠可立即用于下一步。为了在程序中休息，珠子可以在 -80°C 下保存一夜到数周。通常，我们从 5 克湿细胞颗粒S步骤 A4b 中获得约 7-8 克细胞/缓冲液珠。
酵母细胞的低温研磨（第 2 天或第 3 天，~2 小时）
在本节中，我们提供 SPEX SamplePrep Freezer/Mill ® 6700 型的说明和插图。其他更高级的 Freezer/Mill 型号可在市场上买到。使用液氮时，请采取适当的安全预防措施并戴上护目镜。
按照制造商的说明用液氮填充低温磨机室。
地方研磨附着有小端塞和冲击杆置于其内的小瓶（参见图2A，部件A，B ，和c）垂直插入部分地填充有液体氮（图2B）聚苯乙烯泡沫塑料容器。确保只将小瓶浸入液氮中途，因为它们顶部的过度冷却会使它们收缩太多，并防止在稍后的步骤中锁定大端塞（图 2A，部分 d）。让腔室和小瓶冷却 15-30 分钟。通常，对于在步骤A4f 中获得的 7-8 克细胞/缓冲液珠，我们使用两个装有独立不锈钢冲击棒的小聚碳酸酯研磨瓶。
在天平上清空研磨小瓶（里面有杆）的重量。摇动小瓶内的细胞/缓冲珠，以获得每瓶 4-4.5 克的珠子（图 2D）。将装有珠子的小瓶放回液氮中，垂直放置 2-3 分钟（图 2C）。快速工作以避免解冻细胞/缓冲珠。
用大端塞 (图 2E) 关闭小瓶, 并将锁定的小瓶水平放置在液氮容器内, 使小瓶完全淹没 (图 2F)。
重复小号TEPS A5c- A5 d与剩余的小瓶（或多个）。

图 2. 用于冷冻研磨的研磨小瓶的制备。A.研磨小瓶的零件：聚碳酸酯小瓶 (a)；小（底部）端塞 (b)、冲击杆 (c)、大（顶部）端塞 (d)。b 和 d 部分可能看起来略有不同，具体取决于冷冻机型号。B.在液氮中预冷研磨小瓶。C , D.研磨带有细胞/缓冲液珠的小瓶。E.用顶端塞子封闭的小瓶。F.装有珠子的锁定研磨小瓶，准备进行冷冻研磨。

将装有珠子的研磨瓶放入冷冻室 (图 3A)，锁定腔室，并等待 10 分钟让系统完全冷却。使用 SPEX Freezer/Mill ® 6700的最大速度和以下设置研磨细胞：研磨 1 分钟，休息 1 分钟，总共8-10 个循环。如果需要，将液氮添加到腔室中，因为多个循环可能导致部分氮蒸发。在最后一个循环后，等待 10 分钟，然后将小瓶转移到 -80°C 的冰箱中。我们建议将粉状细胞储存在未开封的研磨瓶（图 3B）中，在 -80°C 下至少 30 分钟（过夜也是一种选择），以释放任何残留的氮气。对于长期储存，粉末可在-80°C下储存2-3个月。

图 3. 低温细胞研磨。A. 充满液氮的低温研磨机和装入设备的研磨瓶。B. 研磨小瓶内的粉状酵母细胞。C. 将含有酵母粉的研磨小瓶正确放置在冰桶中，使顶端暴露在室温空气中。

从细胞裂解物中分离翻译活性部分
这部分程序的主要目的是将细胞裂解物的翻译活性部分与其他对翻译反应不必要且可能具有抑制作用的裂解物组分分开。在 Sephadex G-25 柱上脱盐可去除 CFE 中的低分子量化合物，包括内源性氨基酸和核苷酸。(B) 中描述的所有步骤必须在同一天执行。
细胞裂解（第 3 天，~6 小时）
将固定角度转子（例如，Beckman Ti80 转子）和超速离心机预冷至 4°C。
将含有冷冻研磨酵母粉（图 3B）的研磨小瓶从 -80°C 转移到冰桶。垂直放置小瓶，使顶端塞暴露在室温空气中（图 3C）。将两个 50 毫升锥形管和四个带盖的小聚碳酸酯超速离心管放入冰桶中。
将研磨小瓶放在冰上约 5 分钟后，取下顶端塞子，将小瓶中的酵母粉摇晃到预冷的 50 毫升管中。将小瓶放在冰上太久可能会导致酵母粉解冻，使其类似于糊状物。在这种情况下，使用干净的无 RNase 刮刀将材料转移到 50 ml 管中。
将 2-3 ml 缓冲液 A/甘露醇/DTT 添加到 50 ml 管中。
使用 3-4 ml 缓冲液 A/甘露醇/DTT 收集残留在研磨瓶壁和刮刀上的细胞材料。将回收的细胞材料添加到含有大量冷冻研磨酵母粉 (B1c) 的 50 毫升管中。
上下吸取混合物以获得破碎的酵母细胞和缓冲液的均匀浆液。此时裂解液会非常稠。添加额外的缓冲液 A/甘露醇/DTT 至 9 ml 的最终体积，并用移液器混合。将裂解液转移到预冷的购物中心超速离心管中。用 1 ml 剩余的缓冲液冲洗 50 ml 管以收集剩余材料并将其转移到超速离心管中。裂解液的总体积必须为 10 ml。用盖子关闭超速离心管。
如果裂解液未完全解冻且呈泥状，则将含有酵母悬浮液的超速离心管在冰上孵育 5-15 分钟。
将超速离心管放入转子中，并在 4°C 下以 30,000 × g （在 Beckman Ti80 转子中为 17,000 rpm）离心15 分钟。
小心地从离心机转子上取下管子，垂直放在冰上。您将看到三个部分，如图 4 所示。将 6 毫升中间部分（“S30”）转移到一个新的预冷的小型聚碳酸酯超速离心管中，同时避免顶部的任何脂质层。我们成功地使用了1 ml的Pipetman P1000来收集中间部分。但是，为了避免重复穿过顶层，也可以使用带有针头的 10 毫升注射器。小心不要吸入顶部或底部馏分。将试管放在冰上并快速工作，以尽量减少裂解液暴露于室温。

图 4. 30,000 × g离心后三个不同组分的形成。顶部：乳白色脂质层。中间（标记为 S30）：含有翻译活性物质的淡黄色可溶部分。底部：含有完整细胞、细胞碎片和 DNA 的大颗粒。

将超速离心管放入转子中，并在 4°C 下以 100,000 × g （在 Beckman Ti80 转子中为 30,000 rpm）离心35 分钟。
而将管纺丝，这是一个很好的时间开始准备用于裂解物脱盐凝胶过滤柱（见小号下面TEP B2a的）。
离心完成 (B1j) 后，小心地从转子中取出超速离心管，并将它们垂直放置在冰上 5-10 分钟（参见步骤B1m）。避免干扰试管内容物。小心地收集 2.5 ml 的 S100 馏分，如图 5 所示（也参见步骤B1m），并将其转移到预冷的 15 ml 锥形管中。

图 5. 100,000 × g离心后酵母细胞裂解液中形成四个不同的层。顶部：大号ARGE淡黄色脂质体含有层。中间（标记为 S100）：半透明层，是所需的无多核糖体细胞裂解物部分。底部：甲重细胞组分，如内质网和多核糖体（在粉红色跟踪）构成的基本上不动的小球，和一个移动淡黄色分数（蓝色跟踪）。

将管子放在冰上 5-10 分钟有助于更好地可视化四层。要收集中间 S100 分数，可以使用巴斯德吸管或带有针头的注射器。在避免上层或底层的同时收集 S100 是一个具有挑战性的步骤，因为这些层是可移动的并且很容易与 S100 部分混合。特别注意不要用移动颗粒部分污染 S100（图 5 中的蓝色部分）。
裂解液脱盐和浓缩（第 3 天，柱平衡 45-60 分钟 + 脱盐约 1 小时）
从 PD-10 Sephadex G-25 柱上取下盖子，然后以 45° 角切掉底部尖端。允许存储缓冲区通过重力流耗尽。用 5 × 5 ml 冷缓冲液 A/甘油/DTT 平衡每根柱子。
在柱平衡过程中，标记十个 1.7 ml 微量离心管用于收集馏分 (1-10)，加上两个额外的管用于流通。将管子放在冰上。
转移平衡柱，微量离心管，并从裂解物小号TEP B1L到冷的（4℃）的房间。确保列顶部没有缓冲区。将微量离心管放在架子上，排列它们，使第一个流通管直接位于夹在实验室支架上的 PD-10 Sephadex G-25 柱的出口下方。
小心地将 2.5 ml 来自S tep B1l的裂解液施加到柱顶，让样品完全进入柱床。使用两个微量离心管收集流出液。对于洗脱，移取 5 ml 缓冲液 A/甘油/DTT 到柱床上，并开始将级分收集到 1.7 ml 标记为 1-10 的微量离心管中。每管收集~0.5 ml。盖住每个管子。轻轻涡旋或用移液管上下吸管内容物。将所有管子放在冰上。
测量每个管中的 RNA 浓度：用 H 2 O 1:100稀释每个分数的一部分，并使用分光光度计测量λ = 260 nm的吸光度。要计算 RNA 浓度（以μ g/ml 为单位），请将吸光度乘以 RNA 消光系数（ε RNA = 40）和稀释系数 (100)。在图上绘制每个部分中的 RNA 浓度，如图 6 所示。

图 6. G-25 柱洗脱级分中总 RNA 分布的图形表示。用分光光度法测定每个级分中的 RNA 浓度：用 H 2 O (1:100)稀释每个级分的一部分，并在λ = 260 nm 处测量吸光度。计算 RNA 浓度（ε RNA = 40），转换为μ g/ μ l ，并绘制在图表上。与最高含量的分数相比，我们收集的分数至少为 60-75%。通常，这些是分数 3 - 7（以红色框出）。

在一个 15 ml 试管中合并具有最高 RNA 浓度的级分，并通过轻轻涡旋或上下移液彻底混合内容物。工作在冰上，等分所得CFE到预冷1.7毫升微量离心管中，100 μ每管升。在液氮中快速冷冻 CFE 等分试样，并将管子置于 -80°C 进行储存。酵母 CFE 制备程序的一个例子见表 1。

表 1. 酵母无细胞提取物 (CFE) 制备程序示例
使用所述程序，从 1 L 酵母培养物生长到 OD λ = 600nm ~2.5（第 4 列），我们生成 7-8 克细胞/缓冲珠（第 6 列）。细胞/缓冲珠材料的低温裂解在两个单独的小瓶中进行，产生两个 2.5 ml 的 S100 等分试样，然后使用两个单独的 PD-10 Sephadex G-25 柱进行两个脱盐/浓缩步骤。从具有最高 RNA 浓度的一根柱子产生的洗脱液体积为 2.5 ml。通过合并两根色谱柱的洗脱液，我们获得了 5 ml 的 CFE，这足以进行约 660 次标准大小的反应。

在翻译中验证 CFE 活动
要确定新制备的 CFE 的翻译活性，请与 mRNA 报告基因（下文第 1 部分）建立翻译反应，或者，使用 [ 35 S]-甲硫氨酸/半胱氨酸标记源自存在于内源性 mRNA 的翻译产物CFE（第 2 节）。可选的 RNA 完整性分析（第 3 节）可能有助于排除提取物制备过程的故障。
使用荧光素酶报告基因验证 CFE 的翻译活性
生成报告基因
下面的协议是为海肾荧光素酶结构设计的，如Trainor等人使用的。( 2021) 。请参考表2的具体使用其他荧光素酶，如萤火虫和NanoLuc ® ，作为蛋白质记者在基于CFE-翻译反应。

表 2. Firefly 和 NanoLuc ®基于荧光素酶的蛋白质报告基因的合成和检测
T7启动子序列用蓝色标出；用于增加萤火虫荧光素酶翻译的 CYC1 5'-UTR 翻译增强子以红色标记。

扩增海肾的正向引物（5'-：使用下列引物萤光素酶基因，通过PCR ATCCG TAATACGACTCACTATAGGG TAACCGAGCTCGGACT ATG ACTTCGAAAGTTTATGATCCAGAA ），反向引物（5'-TCACGACATTTG TTCATTTTTGAGAACTCG-3' ）。正向引物包含 T7 聚合酶启动子序列（粗体）；起始 ATG 密码子以红色突出显示。
设置在50的总体积的PCR反应μ通过将25升μ的DreamTaq PCR主混合物（2×）的1,1- μ 20的升μ中号正向引物，1 μ 20的升μ中号反向引物，1 μ模板质粒（10毫微克/ l的μ升），和22 μ H的升2 O.甲海肾萤光素酶的含基因的质粒可从Promega公司购买（参见材料）。使用以下 PCR 程序扩增DNA ：27-30 个循环，94°C 30 秒（变性），54°C 30 秒（退火），72°C 1 分钟（聚合）。
一旦PCR完成，检查5 μ升在1％琼脂糖凝胶反应。在海肾萤光素酶基因是940bp的。使用分子量标记来确定 PCR 产物的大小。如果您检测到更多条带，请在提高引物退火温度的情况下重复 PCR 反应，以实现单个 940 bp 条带。
纯化使用PCR产物的DNA清洁＆按照制造商的协议集中器套件旋转柱。从具有16个柱洗脱纯化的PCR产物μ H的升2使用分光光度计测量O. DNA浓度。
在使用 mMESSAGE mMACHINE TM T7 转录试剂盒的转录/加帽反应中，使用1 μg纯化的 PCR DNA （来自S tep C1a.iii）生成 m7G 加帽的 mRNA 。在 37°C 下孵育反应 2 小时。按照试剂盒协议纯化转录产物，包括 DNase 在 37°C 下处理 15 分钟和用 LiCl 沉淀 RNA。最后用 80% EtOH 洗涤沉淀的 RNA 并风干 RNA 颗粒。
重悬RNA沉淀在30-40 μ的不含RNA酶的H L 2通过反复吹打O操作。将 RNA 放在冰上。如步骤B2e所述，使用分光光度计测量 RNA 浓度。等分试样4-5 μ所生成的RNA导入的PCR管的升，并在-80冻结这些等分试样℃。为保持一致性，我们不建议对报告基因进行冻融循环。
进行体外翻译反应
该协议基于Wu 和 Sachs ( 2014)，并进行了一些小的修改。为确保重现性和统计分析，将每个反应一式三份组装。
P ：repare 2.5×主混合物（80所需的体积μ通过按照该次序在表3所示。在冰上保持主混合物组装其部件升12个反应）。

表 3.用于翻译反应的 2.5 ×主混合物的制备

在冰上解冻的mRNA等分试样，调至浓度为200-300纳克/ μ使用无RNA酶的H L 2 O.保持稀释的mRNA在冰上。
通过在手上加热试管并定期轻敲以混合内容物来解冻等分的 CFE。一旦 CFE 解冻，将管子放在冰上。
通过首先将7.5建立翻译反应的期望数量μ CFE的升至1.7 ml离心管中。添加6 μ 2.5×主混合物到每个管的升。添加1.5 μ的mRNA的升（300-450纳克）加入每个管中。反应可以在室温下在工作台上组装。每个反应的总体积为15 μ升。通过轻轻敲击管子来混合反应组分, 并将管子在台式离心机中离心 10 秒。将试管放入设定为 21°C 的干浴培养箱中。将反应孵育 1-2 小时。
通过荧光素酶测定和/或蛋白质印迹分析翻译反应产物
对于海肾荧光素酶检测，请使用海肾荧光素酶检测系统试剂盒 (Promega) 中的试剂。遵循随套件提供的协议。
要在凝胶上可视化翻译反应中生成的蛋白质，请使用荧光二抗进行定量蛋白质印迹，例如，如Ghosh 和 Shcherbik ( 2020) 所述，或使用 HRP 融合二抗和 ECL 检测系统（Trainor等al. , 2021) 。将海肾荧光素酶的特异性抗体是市售的（见材料）。
用 [ 35 S]-Met/Cys标记新生多肽作为 CFE 翻译活性的读数
使用放射性材料时，请采取适当的安全预防措施。
P repare 2×标记主混合物（100 μ通过按照该次序在表4所示。在冰上保持主混合物组装其部件升12个反应）。

表 4.用 [ 35 S]-Met/Cys标记新生蛋白质的 2 ×标记主混合物的制备

通过在手中加热试管并轻轻敲击试管以混合内容物来解冻等分的 CFE。一旦 CFE 解冻，将管子放在冰上。
通过首先将CFE至1.7 ml离心管，7.5建立翻译反应μ每管升。接下来，添加7.5 μ 2×标记主混合物到每个管的升。每个反应的总体积为15 μ升。通过轻轻敲击管子来混合反应，并将管子在台式离心机中离心 10 秒。将试管放入设定为 21°C 的干浴培养箱中。将反应孵育 1-2 小时。
用 TCA沉淀 [ 35 S] 标记的多肽。例如，遵循https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/0/rabbit-reticulocyte-lysate-system-protocol.pdf 中描述的协议。
通过闪烁计数测量 [ 35 S-Met/Cys] 标记多肽的活性。
RNA完整性分析
如果新制备的 CFE 批次的翻译活性较低，我们建议通过凝胶分析和（可选）Northern 杂交检查 CFE 和生成的 mRNA 报告基因。这将解决程序中使用的试剂和设备的潜在 RNase 污染，这可能导致翻译反应组件的降解。
rRNA 和 tRNA 完整性分析
解冻一管冷冻的 CFE 并测量其 RNA 浓度。对于凝胶分析，取等分试样的 CFE 并用无 RNase 的水将其稀释至 2.5 μ g/ μ l RNA。混合1 μ与4-此稀释CFE的升μ的FAE溶液l（见配方）和在70℃下加热样品5分钟。
请注意，通过上述协议获得的 CFE 包含大量 rRNA 和 tRNA。如 (B2.e) 中所述，在测量 RNA 浓度之前，将 CFE 用 H 2 O稀释100 倍。用 FAE (Shedlovskiy et al. , 2017)加热样品后，可以直接通过变性凝胶电泳进行分析。
如 Mansour 和 Pestov ( 2013)所述，通过甲醛-琼脂糖凝胶电泳分析大分子量 RNA 种类（25S 和 18S rRNA ）。要分离小分子量 RNA 种类（tRNA、5S 和 5.8S rRNA），请使用 Shcherbik等人所述的聚丙烯酰胺变性凝胶。（2016 年）。
稀释SYBR金染料储备1：10,000（10 μ 100毫升水SYBR金升2 O）。将此溶液倒入干净的塑料托盘中，在室温下缓慢摇动孵育 20-30 分钟，将凝胶染色。使用合适的凝胶成像系统或激光荧光扫描仪可视化 SYBR Gold 染色的 RNA 条带。
（可选）将 RNA 从凝胶转移到尼龙膜，并将印迹与针对不同酵母 rRNA 和 tRNA 的探针杂交（探针序列在表 5 中提供）。遵循Pestov等人中描述的杂交协议。( 2008) 。我们建议首先使用 25S 和 18S rRNA 的探针，这些大 rRNA 物种在裂解物中的降解很容易被检测到。

表5序列小号探针的用于检测酵母个rRNA酶和tRNA

在翻译反应之前和之后检查 m7G 加帽 mRNA 的质量
如果使用蛋白质报告基因在 CFE 中检测到低翻译活性，则报告基因 mRNA 可能具有二级结构，导致 T7 聚合酶的合成失败。另一种可能性是体外产生的 mRNA可能在合成或翻译反应过程中降解。要测试这些可能性，请继续执行以下步骤：
合成的mRNA记者（C1.a）之后，分析2 μ克所生成的RNA的琼脂糖凝胶电泳，接着SYBR金染色，如在所描述的步骤C3a.iii。单条带的检测表明 mRNA 是完整的。如果您看到多个条带，请使用 mMESSAGE mMACHINE TM T7 Transcription 试剂盒重复 mRNA 合成；然而，在加入反应之前，先加热 PCR DNA产物，然后在 65°C 下加热 5 分钟，然后立即在冰上冷却 2 分钟。如果这不能提高生成的 mRNA 的质量，请更改所有解决方案以排除 RNase 污染的可能性。按照 mMESSAGE mMACHINE TM T7 转录套件手册中描述的其他故障排除步骤进行操作。
翻译反应 (C1.b) 完成后, 根据制造商的协议, 使用 TRI-REAGENT-LS 从反应中提取 RNA。重悬RNA沉淀在50 μ FAE的升（Shedlovskiy等人，2017）和分析2.5 μ使用探针特异性针对mRNA的记者克RNA通过Northern杂交。单条带的检测表明 mRNA 在基于 CFE 的翻译反应中是稳定的。大量降解产物的出现可能表明试剂受到 RNase 污染，在这种情况下，我们建议更改溶液并检查实验室设置以确保无 RNase 环境。

数据分析

如果研究人员选择使用荧光素酶报告器来评估 CFE 的活性，则可以使用市售的荧光素酶检测快速估计生成的产品的数量。这是一个简单，定量，和可靠的，以验证新准备的CFE批次的平移能力方法。图 7 显示了一个基于荧光素酶的检测示例。

图 7. 在基于酵母 CFE 的反应中检测 TAP-RLuc 报告基因合成。将指定量的TAP-RLuc mRNA 报告基因（Trainor等，2021）加入到基于 CFE 的翻译反应中，一式三份。反应在21°C温育2小时，并使用商业海肾荧光素酶测定系统（Promega）分析产物。加入检测试剂后测量发光 10 s。条形显示平均值；e误差条代表 SEM。单因素方差分析测试小号被用来比较的样本。**，P < 0.01 ；****，P < 0.0001 。

An alternative way to estimate protein amounts synthesized from a reporter in a CFE-based reaction is to separate the translation products on a gel followed by immunoblotting with the appropriately selected antibodies. 在我们手中，在用活性 CFE 进行 30 分钟的翻译反应后，TAP 融合蛋白报告基因的强信号很明显（图 8）。该方法可用于任何可用于免疫检测的抗体的蛋白质报告基因。

图 8. 在酵母 CFE 中翻译的 TAP 融合报告基因的免疫印迹检测。甲liquots的2 μ l的从翻译反应采取在指定时间，用2混合μ 2×l的SDS-PAGE加样染料，并解决在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，挡在5％的牛奶在PBS中制备，并用一级抗体针对TAP酵母的混合物（兔多克隆）和RPL3（鼠单克隆），用作后者孵育Ñ实习生人控制。TAP-RLuc 的分子量为 ~56 kDa，Rpl3 为 ~44 kDa。印迹用 0.1% Tween-20 的 PBS 溶液洗涤，并与 IRDye-800CW ant i -rabbit 和 IRDye-680RD 抗小鼠抗体一起温育。使用 Typhoon 5 成像仪在 800 nm 和 680 nm 处检测荧光信号。

还可以通过监测在与内源 mRNA 的翻译反应过程中合成的 [ 35 S-Met/Cys] 标记多肽的量来测试 CFE 。冷蛋氨酸和半胱氨酸应添加到单独的翻译反应中作为对照（图 9）。

图 9. 将 [ 35 S]-Met/Cys 掺入在 CFE 中合成的多肽中。[ 35 S]-Met/Cys（红色）或冷 Met/Cys（蓝色）被添加到两个基于 CFE 的翻译反应中。三个4 μ升等份收集每20分钟，并且蛋白用TCA沉淀。掺入多肽中的[ 35 S]-Met/Cys的量通过TCA沉淀物中每分钟计数(CPM)的闪烁计数来估计。

CFE 中 RNA 的完整性可以通过 SYBR Gold 染色和/或 Northern 印迹快速评估（图 10）。使用我们的 CFE 制备方案，我们预计只会看到痕量的 rRNA 降解，如在主要 25S 和 18S 条带下方的凝胶上出现的额外微弱条带所示，与使用基于快速甲酰胺的快速提取直接从细胞中分离的 RNA 相比方法（Shedlovskiy等人，2017 年）。未检测到 tRNA 或 5.8S rRNA 的降解（图 10，比较“细胞”泳道和“CFE”泳道）。

图 10. CFE 中 RNA 完整性的测定。来自 CFE 的 RNA 与通过一步热甲酰胺方法（Shedlovskiy等人，2017）（标有“细胞”的泳道）从同一酵母菌株中提取的总 RNA 进行电泳分离。样品在1.2％琼脂糖解决含1.3％甲醛（面板AC）凝胶或上8M尿素-10％聚丙烯酰胺凝胶（面板DH）。A.在 SYBR Gold 染色的琼脂糖凝胶上解析 RNA。公元前。没有ř RNA的杂交thern上分辨与琼脂糖凝胶[ 32 P]针对25S标记的探针和18S rRNA的。卫生署。没有- [R RNA的thern杂交解决在聚丙烯酰胺凝胶的探针对小个rRNA和tRNA的底部表示。

笔记

制备酵母 CFE 的一个关键参数是培养物生长条件。先前公布的协议在酵母培养物的生长方式方面差异很大。通过测试不同的方案，我们确定了最适合制备BY4741 细胞翻译提取物的培养条件。起始（过夜）酵母培养应达到OD λ =600nm ~10-12；当稀释到 OD λ =600nm = 0.8 时，培养物接下来应在 30°C 下生长不超过 5-6 小时，以达到 OD λ =600nm ~2.4-2.5。在我们手中，这些条件导致酵母裂解物的最高产量和强大的翻译活性。
我们建议通过 0.2 µm PES 过滤器过滤而不是高压灭菌来对本协议中使用的酵母生长培养基进行消毒。小号通过过滤更好控制在CFE制剂之间的介质和最小化变异性组分的浓度terilization。
Ť ø进一步提高翻译活性，可能希望修改用于生成CFE的酵母菌株的遗传背景。例如，核糖体失活因子的缺失STM1被报道提高了制备CFES的活性从酿酒酵母（Brodiazhenko等人。，2018）。我们还发现，缺失分泌核糖核酸内切酶基因RNY1在折痕RNA的稳定性，如个rRNA和tRNA基因，酵母裂解液（Shcherbik，2013）。
所描述的协议针对翻译记者使用进行了优化。为了测量合成蛋白质的绝对量（以 mg/ml 为单位），需要额外的步骤（例如从 CFE 翻译混合物中进行亲和纯化）。
要为荧光素酶以外的目的基因设计引物，我们建议在基因编码序列 5' 端上游的正向引物序列中加入 T7 启动子序列（如下蓝色所示）。为了提高此处描述的无细胞翻译系统中蛋白质的表达水平，可以将 CYC1 5'-UTR 增强子序列（在下面标记为红色）并入 T7 启动子下游和编码上游的正向引物序列中基因区域；然而，这一步是可选的。正向引物的 Tm 应仅针对与感兴趣的基因退火的序列进行计算（以黑色粗体字显示）。我们成功地使用了新英格兰生物实验室的 Tm 计算器工具：https ://tmcalculator.neb.com/#!/ main。在此工具中，研究人员可以选择实验室中可用的聚合酶。我们成功地使用了 Phusion 和 Taq 聚合酶。
5'-ATCCG TAATACGCTCACTATAGGG AGCTTCACACTAAATTAATA ATGXXXXXXXXXX -3'
对于反向引物，与感兴趣基因的 3' 端编码序列互补的序列就足够了。反向引物的 Tm 应与正向引物的 Tm 匹配。根据我们的经验，54-56°C 的 Tm 适用于 Phusion 和 Taq 聚合酶。

食谱

酵母培养基
YPD培养基
制作 1 L 液体 YPD 培养基：
中号IX 20g蛋白胨，10g的酵母提取物，20克葡萄糖，加去离子水中2 O操作1升。
用 1 M HCl将pH 值调整到 6.0 。
通过 0.2 µm PES 过滤器过滤对培养基进行消毒。
过滤后的 YPD 可在室温下避光保存长达 2-3 个月。
YPD-琼脂平板
甲DD20克每1L YPD培养基的细菌用琼脂; 高压灭菌。

库存解决方案
1 M HEPES -KOH，pH 7.6
Ť AKE238.3克的HEPES酸，加去离子水中2 O操作0.9 L，调节pH至7.6，用50％（W / V）KOH，并调整体积至1L; 高压灭菌。在室温或 4°C 下储存。
2 M KOAc
Ť AKE98.14克的KOAc，加去离子水中2 O操作500毫升，并且通过高压灭菌消毒。在室温或 4°C 下储存。
300 mM MgOAc
Ť AKE6.4克的乙酸镁四水合物（MgOAc · 4H 2 O），加去离子水中2 O操作100毫升，并且通过高压灭菌消毒。在室温或 4°C 下储存。
100 mM MgOAc
Ť AKE2.14克四水合乙酸镁（MgOAc · 4H 2 O），加去离子水中2 O操作100毫升，并且通过高压灭菌消毒。在室温或 4°C 下储存。
1 M 数字电视
取1.5克DTT粉末，加入去离子H 2 O至10毫升；涡旋直到看不到晶体。通过 0.2 µm 尼龙注射器过滤器过滤对 DTT 溶液进行消毒。以 1 ml 等分试样在 -20°C 下储存。
50% 甘油
将500 ml 甘油和 500 ml 去离子 H 2 O 混合，然后高压灭菌 50% 甘油溶液。在室温或 4°C 下储存。

工作小号olutions
缓冲液 A，1 升
混合 30 ml 1 M HEPES pH 7.6、50 ml 2 M KOAc 和 10 ml 300 mM MgOAc。使用无菌 H 2 O 将音量调整为 1L。储存在 4°C。
缓冲液 A/甘油，1 升
拌30毫升，浓度1M HEPES pH 7.6的，50毫升的2中号的KOAc，将10毫升的300mM MgOAc的，和400ml的50％甘油溶液中。使用无菌 H 2 O 将体积调整为 1 L。在 4°C 下储存。
缓冲液 A/甘露醇，1 L
混合 30 毫升 1M HEPES pH 7.6、50毫升 2 M KOAc、10 毫升 300 mM MgOAc 和 750 毫升去离子 H 2 O。将 85克甘露醇加入溶液中，并将体积调整为 1 L . 高压灭菌。储存在 4°C。
缓冲液 A/甘露醇/DTT
将 1 M 库存溶液中的DTT 添加到缓冲 A/甘露醇中，最终浓度为 2 mM。该溶液应在手术当天新鲜配制并保存在冰上。
注意：对于来自 7-8 g 细胞/缓冲液珠的酵母粉，需要 20 ml 缓冲液 A/甘露醇/DTT。
缓冲液 A/甘油/DTT
将 1M 原液中的 DTT 添加到缓冲液 A/甘油中，最终浓度为 2 mM。该溶液应在手术当天新鲜配制并保存在冰上。
肌酸激酶稀释缓冲液
混合0.1 ml 1M HEPES pH 7.6 和 0.25 ml 2 M KOAc。添加 50% 无菌甘油至 10 ml (9.65 ml)。涡旋混合并储存在 -20°C。
肌酸激酶溶液
将0.1ml肌酸激酶稀释缓冲液添加到1，000个单位冻干肌酸激酶达到10个单位/浓度μ升。与其他酶一起储存在-20°C。
10×能源组合
混合1 0.2ml的中号HEPES pH 7.6的，0.1毫升100毫摩尔ATP，0.01 1ml的100mM GTP的，0.4毫升500mM的磷酸肌酸，0.02毫升，浓度1M的DTT ，和0.27毫升无菌H的2 O的总体积是 1 毫升。以 0.03 ml 等分试样在 -80°C 下储存。
FAE解决方案
将 0.02 ml 0.5M EDTA，pH 8.0 添加到 1 ml 甲酰胺中。在 -20°C 下冷冻保存。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院的资助 R01GM114308（给 NS）。我们认同该研究论文（特雷纳等，2021），我们的实验室，从那这个协议已经出版了的。我们感谢 Dan Smethurst 的技术援助。我们要感谢Misha Anikin 和 Randy Strich 的启发性讨论和有用的建议。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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