材料和试剂

温馨提示：无菌的枪头（低-保留提示）
隼，15 -毫升
无菌微量离心管(1.5 - ml )
洗瓶
液体丢弃烧杯
Kimwipe 纸巾（Kimberly-Clark，货号：34120）
微量离心管架
猎鹰架
荧光比色皿（3.0 mm 路径长度）（Hellma Analytics ，目录号：Z802336）
0.22 - μm 过滤器（Millex ，目录号：SLGP099RS）
10 -毫升注射器
MilliQ水（去离子水）
甲醇（100％）（HIMEDIA ，目录号：AS061-2.5L）
Guanidi NE盐酸盐（MP ，目录号：105696）
氯化镁（HIMEDIA MB ，目录号：040-500G）
氯化钾（Sigma ，目录号：793590）
Tris（超纯）（MP ，目录号：103133）
HCl（HMEDIA ，目录号：AS004-2.5L）
ATP（Sigma ，目录号：A2383）
DTT（MP ，目录号：100597）
纯化蛋白 ( sGFP )
纯化的伴侣和辅助伴侣（GroEL 、GroES ）
sGFP （萨达特ê吨人，2020 ）
缓冲液 A（见配方）

设备

移液器：2.5 - μl, 10 - μl, 200 - μl, 1 - ml
离心机
荧光分光光度计（Fluorolog 3 Spectrofluorometer ，Jobin Yvon，Horiba）
干b ATH
pH计

程序

sGFP自发重折叠
蛋白质展开
将2.5 μl sGFP (20 μM )添加到缓冲液 A 中含有 7.5 μl 8 M GuHCl （去折叠反应中的最终GuHCl浓度为 6 M）的微量离心管中（参见食谱）。将试管置于 25°C 的干浴中 1 小时。这将导致蛋白质完全展开。
蛋白质重折叠
打开Fluorolog仪器（荧光分光光度计）。保持仪器接通45分钟之前到荧光测量，以使灯是unifor毫升ÿ加热和波动是最小的。
将仪器设置为发射光谱模式。保持在350激发波长nm和发射光谱在365 - 430 nm范围内。45分钟后，将M i l liQ H 2 O 添加到石英微量比色皿中并获取拉曼光谱。如果您在 397 nm 处获得发射峰，则荧光分光计工作正常。
小号等仪器来动力学采集模式。设定激发波长到480 nm和所述发射波长到515纳米。设置于防photob升eaching模式。将收集间隔设置为20秒，将积分时间设置为0.7秒。的总时间为动力学被设定到1 ，800和小号。将温度设置为25°C。狭缝-宽度被保持在2纳米激发和5纳米用于发射。
清洁的石英比色皿（HELLMA分析10 mm光程）用100％甲醇和然后的MilliQ水，并用擦拭一个的Kimwipe 。取2微升（200 nM的最终）完全折叠蛋白，稀100 -倍乙uffer A（198微升），并通过吸取（调匀总反应体积200微升）中的反应杯。
一旦混合启动动力学采集完成（保持一个在该步骤中相等的延迟）。
sGFP重折叠通常遵循两种状态的途径。未折叠的蛋白质在重折叠缓冲液中一步重折叠为其天然状态。在重折叠实验中，我们通过在 480 nm 激发重折叠反应并测量 515 nm 的荧光发射来监测 GFP 荧光的增加。GFP发出荧光š折后才荷兰国际集团在其原生状态; 吨herefore，GFP荧光是读出的量折叠的蛋白质在我们的重折叠实验。后得到的复性动力学微量的重折叠反应可以最好使用非线性回归由装配一个单指数动力学方程。动力学数据均采用Origin软件进行分析。

一个数学模型来拟合的折叠动力学：
拟合从重折叠实验获得的数据的模型是二态折叠动力学的数学等效模型。一相指数衰减方程如下：

其中被所述偏移，是所述振幅，并且是在时间常数。的表观速率的重折叠反应通过取获得的的倒数的时间常数。典型的重折叠动力学图显示在˚F igure 1a上。

伴侣蛋白-辅助sGFP重折叠
蛋白质展开
展开sGFP如前面所述小号TEP A1。
蛋白质重折叠
一个，B，C ˚F ollow步骤2A，B，C作为自发重折叠说明。
Ť AKE 2微升（200 nM的中）完全解折叠蛋白和稀100倍乙uffer含有的GroEL （400个nM的tetradecamers的GroEL的）。添加的GroES （800个nM的七聚体的GroES的），以使得衬底的比率来GroEL的至GroES的是1：2：4。重折叠被发起由所述加入2毫摩尔ATP（最终浓度）; 总反应体积为200 μl 。通过缓慢移液彻底混合反应。
一旦混合启动动力学采集完成（保持一个在该步骤中相等的延迟）。
代表性的重折叠动力学图如图 1a 所示。图1b中，1个C，1 d解释涉及在数据分析中用于计算的各种步骤的重折叠率。1/t1 给出了重折叠率/秒。
与步骤A 2 f相同。
图1 。sGFP重折叠图。一种。P很多表示的动力学sGFP如通过测定重折叠的增加GFP荧光。sGFP在6展开中号盐酸胍中乙uffer甲在25℃下进行1 ħ 。随后，展开sGFP通过在100倍稀释重折叠乙uffer A.湾重新折叠后的输出屏幕。C。在选择时间和荧光列后单击分析会出现此屏幕。d. 通过在函数部分选择“expdec1”，在拟合后会出现此屏幕。

注意小号

虽然可以使用这种方法监测的重折叠一个NY荧光蛋白，我们必须记住，只有第OSE该启动荧光蛋白到fluoresc È只要它们被折叠是排他地适用于测量使用所描述的协议复性动力学。如所描述的，sGFP只要它被折叠荧光在其天然状态; 因此，我们实际上测量了sGFP荧光的增加率，这对应于蛋白质的重折叠率。因此，这是一种计算sGFP复性率的间接方法。我们假设在使用这种方法通过类似的自发或伴侣蛋白辅助的体外复性试验测量其他荧光模型蛋白的复性率时没有这样的限制。个是协议可以很容易地修改，尤其是在仪器设置小号（狭缝宽度，激发-发射波长，动力学测量的总时间），展开的时间，浓度盐酸胍，和其它参数取决于PROPERT IES模型荧光的使用的蛋白质。在分子伴侣辅助的重折叠实验的情况下，重折叠缓冲液中底物与分子伴侣的摩尔比必须针对用于重折叠测定的单个分子伴侣/共分子伴侣进行优化。

食谱

缓冲液A
20 mM Tris pH 7.4
20毫米氯化钾
5毫米氯化镁2
2毫米 DTT
使用过滤一个0.22 -微米的过滤器和一个10 -毫升注射器

致谢

KM确认来自生物技术部（DBT），印度政府（授权号BT / PR28386 / BRB / 10 /二千〇一十八分之一千六百七十一）和资金的科学和工程研究委员会（SERB），印度政府为核心研究资助(SERB/CRG/2019/006281) 和 SNU 核心资金。在这项工作中IGIB实验室是由支持一个Swarnajayanthi奖学金资助来自DST部分，并通过BSC0124从CSIR。仪器支持还获得了Wellcome Trust-DBT India Alliance 和 CSIR。KM，确认小号SNU，以及AS和ST承认CSIR和CSIR-IGIB的基础设施支持。AS 确认 DBT。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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