材料和试剂

细胞培养皿；35 × 10 毫米和 60 × 15 毫米（Sigma-Aldrich，目录号：CLS430165，CLS 430166）
注射器过滤装置；0.22 - µm（默克，目录号：SLGP033RS）
微量离心管；0.6 - ml 和 1.6 - ml（海王星，目录号：3735.X、3745.X）
离心管；15 - ml 和 50 - ml（Corning，目录号：352096、352070）
一次性超细针（27 ģ × 1/2” ;汉克萨斯狼，目录号：4710004012）和1 -毫升注射器小号（泰尔茂，目录号：SS + 01T结核菌素）
玻璃巴斯德吸管小号（230毫米）（VWR，目录号：6121702）
吸嘴管组件（Sigma-Aldrich，目录号：A5177）
小鼠（> 4 周龄雌性；使用的菌株：B6CBF1）（昆士兰大学生物资源，昆士兰大学，澳大利亚）
PMSG（Prospec，目录号：HOR-272）
牛血清白蛋白（BSA；Sigma - Aldrich，目录号：A7096）
适用于小鼠胚胎培养的轻质矿物油（Sigma - Aldrich，目录号：M5310）
IBMX（Sigma - Aldrich，目录号：I5879）
MilliQ水
碳酸氢钠（Sigma - Aldrich，目录号：S5761）
H EPES（游离酸）（Sigma - Aldrich，目录号：H3375）
H EPES（盐）（Sigma - Aldrich，目录号：H7006）
ģ entamicin硫酸盐（西格玛- Aldrich公司，目录号：G1264）
用于体外培养的M16 培养基（Sigma - Aldrich，目录号：M7292）
α-最低必需培养基（MEM）粉末（Thermo Fisher Scientific，目录号：12000022）（参见食谱）

设备

精细解剖剪刀（Met-App Scientific and Surgical Instruments，目录号：2235）
细钳（Met-App Scientific and Surgical Instruments，目录号：2127）
立体显微镜（Leica Microsystems，型号：M165C；Nikon Microscope Solutions，型号：SMZ800N）
干式加热块（Grant Instruments，型号：QBD4）
CO 2我ncubator（三洋，型号：MCO-18AIC）
酒精燃烧器（LabTek，型号：LW15557-01）
管辊混合机（Ratek，型号：BTR10P-12V）
磁力搅拌器（IKA，型号：RCT basic）

程序

ħ小鼠ormonal刺激
在盐水中制备 20 IU/ml PMSG，并将 1 - ml 体积分装到 1.6 - ml 微量离心管中。储存在 -80°C 直至需要（储存的等分试样可稳定长达 12 个月）。
注入雌性小鼠腹膜内处的具有大约300μl的PMSG腹部下左手侧至5的最终剂型- 7 IU。
房子的小鼠在无菌过滤器顶的笼子在25℃下为46 - 48 ħ和馈送一个标准饮食和水。

的制备的口抽吸单元
点燃装有无水乙醇的酒精灯。
取一个玻璃巴斯德吸管，两端夹在每只手的拇指和食指之间，将窄端放在火焰上，使其开始变软。
从火焰中取出吸移管，并迅速拉每端隔开，使得软化的玻璃可以与达到的内径的目标拉伸类似于那的一个卵母细胞（约80微米）。这可能需要多次尝试才能获得正确的直径，这可以通过比较分离后拉尖的大小与卵母细胞的大小来确定。
将移液器的窄段剪断或折断至合适的长度以便处理。
为了组装所述嘴抽吸单元，附加的巴斯德移液管至一个1 ，000 -微升体积移液管尖端，然后将前端到嘴抽吸管如图描绘1Aii 。

图1 。卵巢收集和卵母细胞分离的工作流程。的（A）制备的解剖台。该插图示出了菜肴用于分离，剥蚀，和串行洗涤的卵母细胞（i）和所述嘴抽吸单元组件（ii）中。(B)附有输卵管和子宫角的小鼠卵巢的放大明场图像。(C) 在卵巢和输卵管 (切割部位) 之间的边界处解剖卵巢。示出的是围绕的卵巢的放大图像中的脂肪。（d）实施例的一个卵巢（脂肪移除）被分解以释放卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。(E)孤立的COC。（F）裸露的卵母细胞之后去除的卵丘细胞。比例尺：50 μm。

制备的处理和文化中介一
上卵巢收集前一天，过滤器5通过一个毫升M16培养基0 22 -微米注射器-驱动过滤器成一15 -毫升离心管中，并放置该管，其盖子松动在一个培养箱中集合到5％CO 2和37 °C以实现 CO 2平衡（见注1）。
上卵巢采集（46天- 48小时以下PMSG注射），制备3 - 4个100 -微升液滴的CO 2 -equilibrated M16在一个35 -毫米培养皿和覆盖有矿物油以防止蒸发。这菜将被用于卵母细胞的过夜培养后的集合。
倾析5毫升处理介质引入15 -毫升离心管中，并添加0.3％BSA w / v的（5毫升培养基要求15毫克BSA）。
放置在处理介质上的与所述管盖盖紧以允许管辊混合器的BSA以溶解（约15分钟）。
过滤的处理介质通过一个0。22 -微米注射器驱动的过滤器，添加IBMX到一个最终100μM的（见注2）的浓度，和通过将干加热上预温至37℃块。
使用图1A中所示的设备准备工作站。
制备微滴的IBMX处理的处理介质在一个35 -毫米培养皿覆盖有矿物油，如在图1A中描绘的插图。
制备1毫升IBMX处理的处理在1.6介质-干加热上ml离心管和预温热至37℃块。

卵巢收藏品ñ
牺牲的小鼠通过颈椎脱位和发生在该仰卧姿势。喷雾的腹部用70％乙醇润湿的皮毛，并防止它从回车荷兰国际集团腹腔。
做一个小切口在与精细解剖剪刀下腹部皮肤，用戴手套的手轻轻拉了腹部皮肤敞开，露出腹膜膜。
清洁从任何毛皮的用纸巾剪刀，再切腹膜以暴露腹腔腔。
使用细镊子，找到子宫角。轻轻拉动子宫角，顺着它的头端一直到四肢，找到位于肾脏下极下方的卵巢。
使用细解剖剪到横切一个部分的所述子宫角相邻到的卵巢和从周围组织解剖对位卵巢脂肪，如在图1B和描绘Ç 。
将卵巢放入含有 1 ml 预热的 IBMX 处理介质的管中，该介质在 C 部分制备，然后转移到实验室。

卵母细胞隔离和ñ
在实验室中，转移的卵巢成35 - 100mm培养碟。
在立体显微镜下，使用细镊子和27的前端ģ附着于1针-毫升注射器小心除去周围的输卵管，子宫角，从卵巢和脂肪，确保其在卵巢中不破损，如所示在图1C和视频1.将卵巢出现浅粉红色的颜色，而脂肪和输卵管为白色颜色。

VIDEO 1.分离的卵母细胞从一个小鼠卵巢

一旦卵巢是不含脂肪和其它组织，将其转移到另一35 -含2ml处理介质毫米培养皿中。不要用矿物油覆盖该介质。
用针反复穿刺卵巢以释放卵丘-卵母细胞复合物 (COC) ，如图1D 和视频 1 所示。
使用的拉玻璃巴斯德移液管制备在部分乙，选择的COC （图1E）从培养皿中并移动到一个第二35 -毫米培养盘用IBMX处理的处理介质的液滴用矿物油覆盖（图1A我）。
使用口控抽吸装置去除周围卵丘细胞的卵母细胞，通过玻璃移液管的尖端反复吸出和排出 COC，以产生无卵丘的卵母细胞，如图 1F 和视频 1 所示（见注3）。
用IBMX 处理的处理介质的连续液滴清洗裸露的卵母细胞，以去除任何残留的卵丘细胞。

卵母细胞培养
为了诱导恢复减数分裂，洗涤卵母细胞裸露与5 - 6个100 -在60 IBMX -自由M16的微升液滴-毫米培养皿（无矿物油覆盖）。
地方的卵母细胞中的培养d ISH制备在部分C （图2A）和地点在一个培养箱中在37 ℃和5％CO 2培养过夜。
为了分析的GV率breakd自己（GVBD），从卵母细胞移除的培养箱2小时以下通过用于检查在光学显微镜下从IBMX冲洗和分数GVBD的所述GV的消失（如图描绘2B）。
极体挤出（PBE）的速率可以拿下约8 -以下从释放10 H IBMX通过检查用于所述存在的一个PB下一个光显微镜，如描绘于图2C。为时间序列数据，如图2D和E，分数GVBD和PBE在30 -分钟间隔（见注4和5）。

图2 。工作流程的体外成熟的卵母细胞（IVM）。(A) 在用于 IVM 的孵化器中的矿物油覆盖下含有 M16 培养基滴的培养皿。(B) 在不含 IBMX 的 M16 培养基中培养的卵母细胞的明场图像。请注意，2 小时后，大多数卵母细胞都经历了 GVBD。(C) 在不含 IBMX 的 M16 培养基中过夜培养后，大多数卵母细胞已挤出少量 PB。(D, E) GVBD 和 PBE 率分别与 IBMX 和 GVBD 发布后的时间相关。误差条代表三次生物学重复±平均小号TANDARD Ë所述的RROR米EAN（SEM）。比例尺：50 μm。

数据分析

1.计算的比例的卵母细胞经历GVBD作为该比率（％）的GVBD的卵母细胞于卵母细胞的总数。同样，将 PBE 率计算为已挤出 PB 的卵母细胞与卵母细胞总数的比率 (%) 。
2.重复得分在所述期望的时间间隔为所述期望的总的持续时间的时间。对于例如，GVBD率可被计算为0.5 - ħ间隔为一个总的4 ħ后IBMX释放，如在图2D中。PBE速率可在0.5来计算-小时的间隔从6 - 12小时后GVBD ，如图2E中（见注小号5和6）。
3.从≥ 3 个生物重复获得数据后，使用GraphPad Prism ( www.graphpad.com ) 在折线图上绘制平均百分比，x 轴为时间间隔，y 轴为各自的百分比。

笔记

M16中介嗯要求CO 2在使用前平衡。由于 M16 含有酚红 pH 指示剂，这可以指示其是否适当平衡。的Medi嗯认为出现橙红色的适当平衡，但米EDI嗯这是在外观粉红尚未平衡足够长的时间，不应该被用于卵母细胞培养。
IBMX被添加到抑制GVBD在卵母细胞分离和处理阶段。IBMX可能也被添加到M16培养基以维持GV的卵母细胞阶段的时间更长的时间。
最小化光曝光到所述卵母细胞通过覆盖的处理和培养培养皿作为多尽可能与暗罩，如在图描绘1A 。
卸下的培养皿从所述培养箱经常可以暴露的卵母细胞于温度波动和过度的光，这可能影响成熟速率。
卵母细胞产量和定时的GVBD和PBE可以变化取决于上的小鼠品系（派克-的Thornburg等。，2011;波兰斯基，1986和1997;程等人，2012）。鼓励研究人员首先评估一些菌株，以确定最适合他们需求的菌株（Luo等，2011）。
时间推移microsc OPY被使用在我们的实验室，以自动捕获明场图像在所需的时间间隔。如果在 IVM 的第二天手动对 PBE 进行评分，PB 可能会退化并且难以识别。
使用唯一的清洁和消毒烧杯，体积瓶，称重盘S，等，为使在处理中。
这是重要的，以保持所述pH值的所述介质之间7.2和7.5。如果该pH值也不会稳定在这个范围内，重新使媒介。
加入的HEPES到所述处理MEDI UM允许使用外部的一个CO 2培养箱无显著pH值的波动。

食谱

卵母细胞处理培养基
最终浓度：6 mM 碳酸氢钠、10 mM HEPES（游离酸）、10 mM HEPES（钠盐）、100 pg/ml g恩他霉素硫酸盐。见注释 7 - 9。

在称重托盘中称量 8.8 克 ɑ-MEM 粉末，然后转移到 1 - L 玻璃烧杯中。
加入 900 毫升 MilliQ 水并在磁力搅拌器上搅拌。
添加504毫克碳酸氢钠，2 ，380毫克HEPES（游离酸），和2 ，600毫克HEPES（钠盐）到烧杯中，并搅拌，在室温至少15分钟温度。
一旦所述溶质被完全溶解，检查了pH值的所述处理介质下恒定搅拌。确保培养基的 pH 值为 7.2 - 7.5 。
定容至 1 L ，将培养基过滤到无菌玻璃瓶中，贴上标签，并在4°C 下储存不超过 2 个月。
上的天的的实验中，滗析的所需体积的处理介质到离心管中并添加0.3％w / v的BSA和100 μM IBMX立即之前开始所述实验。作为一个例子，对于10 ml的培养基，添加30毫克BSA和5微升IBMX （小号滴答Ç oncentration：200 μM）。

致谢

这项工作是由教授克里斯托弗·陈捐赠基金的支持，Ş从医学的昆士兰大学学院，tartup资金，以及国家健康与医学研究委员会项目资助APP1078134，APP1103689 ，并APP1122484到H.AH
YY是支持由昆士兰研究培训大学的奖学金。

我们感谢 Christopher Chen 卵母细胞生物学实验室的成员的帮助。图形摘要是使用BioRender.com创建的。
该协议是从Subramanian等人发表的先前研究中稍作修改后改编的。(2020)。

利益争夺

HAH是一个联合创始人，股东，和Jumpstart的生育公司，成立开发的顾问研究为NAD +依赖的途径参与的女性的生育能力。HAH是一个共同发明人对在专利申请“用于提高生育方法”（申请号2017903013）。所有剩余的作者都声明没有竞争利益。

伦理

用于准备该协议的所有小鼠均由昆士兰大学研究伦理办公室、动物伦理委员会批准，认证号为 MED/530/18 。

参考

Bertoldo, MJ, Listijono, DR, Ho, WJ, Riepsamen, AH, Goss, DM, Richani, D., Jin, XL, Mahbub, S., Campbell, JM, Habibalahi, A., Loh, WN, Youngson, NA , Maniam, J., Wong, ASA, Selesniemi, K., Bustamante, S., Li, C., Zhao, Y., Marinova, MB, Kim, LJ, Lau, L., Wu, RM, Mikolaizak, AS , Araki, T., Le Cuteur, DG, Turner, N., Morris, MJ, Walters, KA, Goldys, E., O'Neill, C., Gilchrist, RB, Sinclair, DA, Homer, HA 和 Wu,乐 (2020)。NAD + Repletion 可在生殖衰老期间挽救女性的生育能力。细胞代表30(6)：1670-1681 e1677。
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