开始之前要考虑的事情
样品制备
裂解缓冲液：我们推荐使用传统 SDG 分析中使用的标准多核糖体提取方法。裂解缓冲液包含用于稳定多核糖体（RNase 抑制剂和 Mg 2+ ）的标准试剂（Klein等，2004；Panda等，2017；Poria 和 Ray，2017；Shi等，2017；Simsek等. , 2017; Imami et al. , 2018) 。
去垢剂：SEC 的分离原理是根据分子的大小和形状对分子进行有效分选，这与细胞裂解中使用的生理缓冲液兼容，也可用于后续的 SEC 分离。用于多核糖体提取的典型的缓冲液含有去污剂，例如，0.5-1％的Triton X-100或NP-40 ; ħ H但是，这些洗涤剂具有较低的临界胶束浓度（CMC）（曲通X-100：0.0155％; NP-40：0.0179％）。在CMC上方形成的胶束相对较大 (~90 kDa) ( https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/detergent-selection-guide.pdf )。此外，这些去污剂在 280 nm 处有很强的吸光度，这会导致 SEC 期间产生背景噪音。因此，我们选择了CHAPS作为选择的去污剂核糖兆-SEC因为：1）的CMC足够高（0.4920 - 0.6150％）至被用来在下面SEC分离缓冲器有效的CMC ; 2）胶束尺寸小（6,150 Da）；3) 280 nm 处的吸光度较弱。还已知 CHAPS 可溶解蛋白质复合物而不会引起重大变性(Hjelmeland, 1980) 。此外，我们证实，对于使用 1% Triton X-100 或 1% CHAPS 从 HeLa 细胞制备的裂解物，多核糖体和核糖体亚基的回收效率相似（Yoshikawa等人，2018 年）。因此，我们使用 1% CHAPS 进行细胞裂解，0.3% CHAPS 用于 SEC 运行缓冲液。然而，原则上，任何具有足够高 CMC 的去污剂都适用于SEC 分离。
翻译延伸抑制剂（放线菌酮 (CHX)、依米丁）：在我们最初的实验中，我们用 CHX 处理细胞以按照多核糖体提取的标准方法“冻结” mRNA 上的多核糖体结构。由于 CHX 是一种可逆的翻译延伸抑制剂，因此应包含在所有溶液中；否则，效果会降低（Schneider-Poetsch等人，2010 年）。Emetine 是另一种翻译延伸抑制剂，但它是不可逆的（David等，2012）。然而，考虑到有与翻译抑制剂治疗的细胞的潜在副作用（格拉先科和Gladyshev 2014;桑托斯等人2019年），我们现在不想给我们é任何翻译延伸抑制剂用于从哺乳动物的细胞制备多聚核糖体（见图3）。请注意，但是，该CHX应增加从芽殖酵母核糖准备。

分馏物料量
对于多核糖和核糖体的分析，含有我们通常注入裂解物10 - 20 μ克RNA（通常相当于约100-200 μ g蛋白质）。因此，对于一个典型的分析中，从裂解物在60培养的细胞制备-毫米培养皿（〜3.0× 10 6 个单元）就足够了。用于SEC分析，我们建议注射高达100 μ克RNA（相当于〜1 mg蛋白质）在200 μ升，由于注入非常大量（例如，在200超过2毫克蛋白μ升）会影响塔的性能和引线防止堵塞（请注意，SEC 柱是分析柱而非制备柱）。如果下游分析需要更大量的分馏材料，我们建议通过执行多次运行来实现这一点，即，将较少量的相同裂解物多次注入同一 SEC 色谱柱，而不是将相同总量注入一个大的、浓缩的样本。然后可以合并来自每个单独运行的等效分数并用于进一步分析。uHPLC 分馏系统非常高的重现性确保每个等分试样都具有直接可比性，并且根据我们的经验，来自不同运行的等效馏分几乎相同。

列的选择
人体细胞中的 80S 核糖体的分子量约为 4.3 MDa，直径为 250 - 300 Å。非常大的 polysome 复合物，在单个 mRNA 上包含多个核糖体，超出了通常用于分离单个蛋白质和较小复合物的典型 ~300-500 Å 孔径 SEC 色谱柱的有效分离范围，例如Superose 6 色谱柱. 核糖体和多核糖体复合物简单地出现在这些柱的空隙体积中；吨herefore，我们使用一个2000埃孔径SEC柱用于多核糖体，并从人细胞中分离出核糖体亚基的分离。这种大孔径色谱柱成功地分离了多核糖体尺寸范围内的复合物，在空隙体积中基本上没有检测到蛋白质峰（Yoshikawa等人，2018 年）。这种 2,000 Å SEC 色谱柱还可用于从组织样本中分离裂解物（Yoshikawa等人，2018 年）。
我们注意到，根据特定实验所需的分辨率，在选择 SEC 色谱柱时需要进行权衡。因此，使用 1,000 Å 孔径 SEC 色谱柱可在 60S 和 40S 哺乳动物核糖体亚基之间以及 40S 亚基和较小的蛋白质复合物之间提供更高分辨率的分离，但导致 80S 峰几乎与多核糖体峰重叠（Yoshikawa等人，2018 年）。用于在其他物种中翻译复合物的分析，我们发现，对1,000埃SEC柱适合于提取从任一果蝇胚胎或芽殖酵母（图1）。

图 1.使用 1,000 Å 孔径 SEC 柱的果蝇胚胎和出芽酵母细胞提取物的Ribo Mega-SEC 图谱。A）果蝇胚提取物是ANALY ž使用0.8毫升/分钟的流速编 B）酵母细胞提取物ANALY ž通过蔗糖密度梯度ED分馏，并收集用于随后的核糖兆SEC分析突出显示的部分。C) 用于蔗糖密度梯度分析的酵母细胞提取物，或图 2C 中收集的馏分，以 0.2 毫升/分钟的流速注射到 1,000 Å 孔径的 SEC 柱上。第r飞行面板示出了Y轴的的放大图升EFT面板。

色谱柱性能评估
为了评估 2,000 Å 和 1,000 Å 孔径 SEC 色谱柱的性能，我们使用三种不同的材料作为尺寸标准：1) BSA ；2) DNA HyperLadder 1 kb ; 和 3) HeLa 细胞裂解物。而 BSA 在渗透极限处洗脱，其中“低于一定尺寸的分子完全穿透孔并倾向于在几乎相同的位置洗脱”（https://www.shimadzu.com/an/service-support/technical-support/analysis -basics/basic/55/55intro.html），几个DNA 片段在排除极限和渗透极限之间洗脱（图 2）。此外，注入含有10 HeLa细胞裂解物μ克RNA到SEC柱提供多核糖体的“标准”的分离，80S，60S，40S ，和其他较小的蛋白复合物（图2）。我们监控以下参数来确定色谱柱性能：1 ) 形状，2) 强度，3) 分辨率，以及 4) 峰保留时间。

图标描述已自动生成
图 2. 使用 2,000 Å 孔径 SEC 色谱柱 (A) 或 1,000 Å 孔径 SEC 色谱柱 (B) 以 0.4 ml/min 的流速通过 SEC 对标准品进行典型分离

流量，柱压，并且分辨率
在典型的实验，我们ANALY ž使用2000埃孔径大小SEC柱，用0.2毫升/分钟，60分钟的分离时间的流率e的样品，和操作压力的在5℃〜40巴在列隔间。这提供了高-大型复合物的分辨率分离。当使用 0.8 ml/min 的色谱柱流速时，在 5°C和~160 bar的操作压力下，分离时间减少到 15 min 。考虑到压力，快速蛋白质液相色谱 (FPLC) 仪器也可用于 Ribo Mega-SEC。我们建议使用 0.8 ml/min 的柱流速进行初始筛选，然后使用 0.4 ml/min 进行大多数后续详细分析。
除了色谱柱流速外，进样量也是影响色谱柱分离度的另一个重要因素。建议在注射体积是小于2％的总柱体积。在我们的UHPLC系统中，最大注射体积设定为200 μ升，这等于安捷伦Bio SEC-5柱（7.8毫米的柱体积的1.4％× 300毫米）。为了比较不同条件下的样品，我们制备了总浓度相同的裂解物，以便相同体积的蛋白质和 RNA 可以注入相同的量。

样品Normali ž通货膨胀
Normali ž的样品量通货膨胀，通过测量的总蛋白质和/或RNA含量在细胞/组织提取物，使所述的多核糖中和整个条件核糖体亚基的相对水平的差异可靠的检测。例如，降低的多核糖体水平，在对80S核糖体和60S和40S亚基的峰的相应增加，在从氨基酸裂解物中检测到-饥饿的哺乳动物细胞中COMPAR ISON与下正常生长条件下培养细胞小号（吉川等人。, 2018) 。另一种方法是对我们Ë细胞数为normali Ž通货膨胀，它提供信息ö Ñ在二者比例和数量的变化（布雷内斯等人，202 1 ;加洛韦等人。，2021 ）。

材料和试剂

Agilent Bio SEC-5 HPLC 柱（7.8 × 300 mm，5 μm 颗粒）1,000 Å（安捷伦，目录号：5190-2536）或 2,000 Å（安捷伦，目录号：5190-2541）
小瓶小号（例如，安捷伦，目录号：5184-3550）
Cap s （例如，Agilent，目录号：5182-0723）
深-孔平板96/1 ，000微升，蛋白质低吸附仪（Eppendorf，目录号：0030504208）
Ultrafree-MC 离心过滤器，0.45 - µm 孔径，亲水性 PVDF，0.5 - ml 体积，非无菌（Merck Millipore，目录号：UFC30HVNB）
Stericup s （默克密理博）
1.5 -毫升管小号（例如，Sarstedt的，目录号：72.690.001）
100 -毫米细胞培养皿ES （例如，康宁，目录号：430791）
细胞刮刀
胚胎收集笼（Flystuff.com，目录号：59-101）
w 1118或任何其他所需基因型的果蝇
冰桶
DPBS，无钙，无镁（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190144）
三- b uffered小号艾琳（TBS）
HEPES
氢氧化钠
特里斯
脱水柠檬酸三钠（默克，Sigma-Aldrich，目录号：C8532）
氯化钠
MgCl 2 ·6H 2 O
乙二胺四乙酸二钠盐
CHAPS，Sol-Grade（Anatrace，目录号：C316S）
甘油
二硫苏糖醇 (DTT)
来自猪肠粘膜的肝素钠盐（默克，Sigma-Aldrich，目录号：H3393）
玻璃珠，酸洗，425-600 μm（默克，Sigma-Aldrich，目录号：G8772）
放线菌酮（默克，Sigma-Aldrich，目录号：C7698）
十二烷基硫酸钠 (SDS)
胃蛋白酶（默克，Sigma-Aldrich，目录号：P7125）
RNase A（默克，Sigma-Aldrich，目录号：R5000）
10 毫克/毫升 BSA 溶液
三氯乙酸溶液（默克，Sigma-Aldrich，目录号：T0699）
TRI试剂（默克，Sigma-Aldrich，目录号：T3934）
SUPERase•In TM RNase Inhibitor（20 U/ μl ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM2694）
cOmplete TM ，无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物（Roche，目录号：11873580001）
Pierce TM 660 nm 蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：22662）
HyperLadder 1 kb（BIOLIBE，目录号：BIO-33053）
2 × SSC，1% SDS 溶液
过滤 Milli-Q (MQ) 水
过滤后的 20% 乙醇 (EtOH)
苹果汁琼脂（CSH_Protocols 2011）在100分配-毫米板
Polysome提取缓冲液（见配方）
SEC 运行缓冲液（见配方）
50 ×蛋白酶抑制剂溶液（见配方）
胃蛋白酶溶液（见食谱）
RNase A 溶液（见配方）
20 × SSC（见配方）
标准 HeLa 细胞裂解物（见配方）
注意：如果该供应商/制造商未在上面的标准实验室化学品所描述的，第ESE可获自默克公司（Sigma-Aldrich公司），VWR，或Formedium。

设备

配备二极管阵列检测器的 Ultimate 3000 Bio-RS HPLC (Thermo Fisher Scientific)
涡流米ixer（例如，科学工业，涡精灵2）
冷藏微量离心机（例如，Thermo Fisher Scientific、Fresco TM 17 Microcentrifuge）
Eppendorf 生物光度计
Biospec Mini-Beadbeater-24

软件

Chromeleon 软件 (Thermo Fisher Scientific)

程序

uHPLC 设置
制备和筛选所有溶液小号和SEC运行缓冲液（见配方）：在“线的SEC运行缓冲液，” MQ水中在线“B”，和在线“C” 20％EtOH中。
使用默认设置（3 毫升/分钟，5 分钟）清洗泵。
在柱温箱中，连接用于哺乳动物样品的 2,000 Å 孔径 SEC 色谱柱或用于果蝇或酵母样品的 1,000 Å 孔径 SEC 色谱柱。
使用至少 2 倍柱体积 (CV) 的 MQ 水冲洗色谱柱，室温下流速为 0.2 - 0.8 毫升/分钟。
设置列室的在5℃的温度和第在4℃（注自动进样器/级分收集舱1）。
通过与至少2 CV SEC缓冲冲洗平衡柱子在0.8毫升/分钟的流速。
启动一个空白运行到normali Ž E中的基线在260和280nm。
在 5°C 下使用 0.8 ml/min 的流速检查 ~160 bar 的操作压力。
注入100 μ升1毫克/毫升BSA溶液阻止的网站的非特异性相互作用。
注入10 μ升1毫克/毫升BSA溶液来运行作为其一部分的标准，检查分离（图2）。
注入10 μ升HyperLadder解决方案来运行作为其一部分的标准，检查分离（图2）。
注入含有 10 µg RNA 的标准 HeLa 细胞裂解物（图 2）（注2）。
开始另一个空白运行。

样品制备（所有离心均在 4°C 下进行）
人类细胞系的裂解物
洗涤细胞在一个100 -毫米培养皿（〜80％confluenc é ;约〜5 × 10 6细胞）用冰冷的PBS洗涤两次。
收获细胞在1ml冰冷的PBS刮削和收集它们在1.5 -在冰上毫升管。
以 500 × g离心5 分钟，并使用抽吸器小心地去除上清液。
如果需要，用 1 ml 冰冷的 PBS 冲洗细胞。
细胞沉淀可以在液氮中速冻并储存在 -80°C 或立即用于裂解液制备（注4）。
裂解细胞，通过移液，在250涡旋10秒微升多核糖体提取缓冲液，并incubat荷兰国际集团在冰上15分钟。
离心17000 ×克20分钟以沉淀的碎片。
收集和过滤的0.45上清液-微米ULTRAFREE-MC HV离心过滤装置，在12000纺丝×克2 - 5分钟（注3）。
转移滤液到新的1.5 -毫升管小号和置于冰上。
裂解物可以在液氮中速冻并储存在 -80°C（注4）。
测量RNA和蛋白质浓度的滤液使用一个BioPhotometer生物分光光度计和一个皮尔斯TM 660纳米蛋白测定试剂盒，分别。
Equali ž Ë横跨条件样品的浓度通过在多核糖体提取缓冲液稀释（注5）。
将裂解物转移到小瓶 (12 × 32 mm) 中，盖上盖子，并保持在冰上。
（可选）p花边5 μ升蛋白酶抑制剂小号（50 ×原液）和2 U RNase抑制剂小号在每个孔中的96深孔-孔板中。
果蝇胚胎的裂解物
用w 1118或任何其他所需的苍蝇基因型设置鸡蛋收集杯。每天更换苹果汁琼脂平板 2-4 次，连续 2 天。
胚胎收集的当天，改变苹果汁琼脂平板两次后，30 -分钟的集合。丢弃盘子。
随后，在 25°C 下将胚胎收集在新鲜平板中 30 分钟。
将收集的胚胎再老化 40 分钟。甲吨这一点，胚胎将40-70 -分钟-旧并因此将仍然在合胞体的阶段。
用 5% 的漂白剂对收集和老化的胚胎进行 Dechorionation，直到大部分胚胎上升到溶液的表面。
用自来水彻底清洗胚胎并在纸巾上擦干。
使用画笔收集 dechorionated 胚胎并将它们转移到 1.5 - ml 管中。
甲吨这一点上，胚胎可以是快速冷冻并储存在-80℃或进一步处理。
添加400μl的多核糖体提取缓冲液，细胞溶解用杵胚胎配合到1.5 -毫升管，并在冰上15分钟温育。
按照“人类细胞系裂解物”中描述的步骤s 'g to n ' 。

芽殖酵母的裂解物
成长Ÿ在YPD或选择性培养基东文化。采取SW EE的对在y上用干净的牙签YPD平板兴趣生长的东应变和接种5 -毫升培养。
过夜生长到了早期的固定相。在早晨，接种一个500 - ml培养用5ml过夜培养物并生长在一个2 -L在30℃下的Erlenmeyer玻璃烧瓶中，直到它达到OD 600 〜1.0。
Ť ø稳定的多核糖体收获之前添加Ç ycloheximide（CHX）在0.1毫克/毫升的最终浓度，并培育用于在冰上10分钟。
将细胞以 4,000 × g旋转 10 分钟并丢弃上清液。
用冰冷洗涤细胞沉淀-含0.1毫克/毫升CHX冷TBS 。
重悬沉淀在10ml p olysome提取缓冲液含有0.1mg / ml的CHX。
分离重悬的细胞到1 -毫升等分试样在2 -毫升管。
细胞可以在液氮中速冻并储存在 -80°C（注4）。
向管中加入等体积的玻璃珠并混合。
在 4°C的玻璃珠搅拌器中破碎细胞；在冰上以 2 分钟间隔跳动 2 分钟珠子。
重复此过程 6 次。
取 1 μl破碎的细胞并稀释至 10 μl ；下检查该显微镜对细胞进行重影。
将破碎的细胞以 6,000 × g 、4°C离心5 分钟。
将上清转移至预冷却的1.5 - ml离心管。
澄清两个连续离心裂解物在11300 ×克，4℃5分钟，每次仔细转移上清至新的预冷却1.5 -毫升管。
裂解物可以在液氮中速冻并储存在 -80°C（注4）。
按照“人类细胞系裂解物”中描述的步骤s 'k到 n ' 。'

Ribo Mega-SEC 运行
P花边小瓶和自动进样器/馏分收集隔间板。
注入1/5体积，以一个等体积裂解物，并决定的时间处收集的基础上的色谱级分。
设置序列中馏分收集的时间（注6）。
ANALY ž Ë的使用设置了序列样品。

从 Ribo Mega-SEC 馏分制备样品
对于蛋白质印迹，沉淀的由三氯乙酸蛋白（TCA）沉淀，然后通过一个在SDS样品缓冲液洗涤乙醇或甲醇/氯仿沉淀，重悬蛋白质颗粒。必要时，添加的Tris对样本进行调整的pH值。
为了编写，J重新用于蛋白组样品小号分析，消化RNA的样品中与b enzonase，减少和烷基化的蛋白质，并清理所述蛋白质使用FASP （的Wisniewski等人，2009; Potriquet 。等人，2017），其有效地除去盐和洗涤剂，如肝素和 CHAPS。SP3 -基于蛋白质清理（休斯。等人，2014）是如果样品不需要包含肝素用于分离分子或比核糖体其他蛋白复合物可以使用的另一种方法。
到prepar Ë从RNA的级分，提取RNA使用T- RI ZOL LS（热）或一个等价的产物。请注意，需要RNA小号重新纯化利用LiCl沉淀RNA为-Seq的或RT- q PCR以去除肝素（荣格等人，1997）。

化验之后列维护ž ING样本
使用至少 2 CV 的 MQ 水冲洗，室温下流速为 0.2 - 0.8 毫升/分钟（注7、注8）。
冲洗20％EtOH中使用至少2 CV用，以0.2的流量- 0.4mL /分钟在室温下。
从 uHPLC 中取出色谱柱并根据制造商的说明进行储存。

列清理
冲洗用MQ水至少5 CV ，以0.2的流量- 0.8mL /分钟在室温下。
使用至少 5 CV 的胃蛋白酶溶液冲洗，流速为 0.2 - 0.8 ml/min，37°C ；将色谱柱在 37°C 下无流动孵育 1 小时（注9）。
冲洗与使用至少5CV的RNA酶A溶液，用0.2的流量-在37℃下0.8mL /分钟; 将色谱柱在 37°C 下无流动孵育 1 小时（注9）。
冲洗用2 × SSC，用1％SDS溶液至少10 CV ，以0.2的流量- 0.8毫升/分钟50℃。
使用至少 10 CV MQ 水冲洗色谱柱，在室温下使用 0.2 - 0.8 毫升/分钟的流速。

数据分析

我们使用变色龙软件运行UHPLC和ANALY ž Ë数据。为了比较的数据，我们与标准偏差一起绘制平均轮廓跨越生物学重复[见我们原来的纸（吉川等人，（2018）] 。我们还使用了计算的曲线下面积由该变色龙软件（图3） .
例如，我们使用来自用或不用 CHX 或依米汀处理的 HeLa 细胞的裂解物，通过 Ribo Mega-SEC 比较了多核糖体。乙埃特恢复被看见从依米丁处理的细胞相比，用CHX处理的细胞（图3）。我们还检测到的多核糖体从未经处理的细胞大部分实验的足够的屈服，尽管产率比从任CHX低级-或ë metine -处理的细胞（图3）。

图表、折线图描述已自动生成
图3.裂解物的SEC分离简档来自未处理的制备，放线菌酮（CHX）-处理的或依米丁-处理的HeLa细胞。A）裂解来自未处理的制备将HeLa与CHX（红线）或处理过的细胞（蓝线）或细胞依米丁（绿色）为ANALY Ž使用2000通过核糖兆SEC编SEC柱以0.8ml /分钟的流速分. B）孔定量吨的通货膨胀的图1A中所示的多核糖体区域的曲线下面积。点表示生物学重复。* P < 0.05，** P < 0.01。

注意小号

我们通常使用的“设置的延迟”选项的行为在夜间步骤6-12，S五脏俱全，我们可以开始ANALY ž荷兰国际集团样本的第二天早上。
为了检查可重复性，当有足够的样品可用时，建议至少注射 HeLa 细胞裂解物两次。
过滤器往往会变得堵塞时，裂解液含有脂类。必要时，残留在过滤器顶部的裂解物需要转移到新的过滤器中。
速冻裂解物或细胞可在 -80°C 下保存至少 6 个月。
进样量影响峰分辨率；因此，应在不同条件下注入等量。
我们通常收集 12、24 或 48 个部分，范围从多核糖体到“小 RNP” 。
运行两个空白，然后注入 BSA 和 HyperLadder 溶液，建议检查色谱柱条件。我们通常会看到最多约 50 次注射含有 20 µg RNA的裂解物的良好分离。
当新样本是ANALY Ž编的第二天，将柱冲洗至少2 CV MQ水和重新平衡的SEC缓冲液中。
我们发现 rRNA 倾向于与 SEC 柱中的熔融石英相互作用。由于 rRNA 受到核糖体蛋白的保护，我们在 RNase 消化以去除 RNA 之前使用胃蛋白酶消化蛋白质。

食谱

多聚体提取缓冲液
20 mM H EPES -NaOH (pH 7.4)
130 毫米氯化钠
10 毫米氯化镁2
5% 甘油
1% 小伙伴
0.2 毫克/毫升肝素
通过高 PVDF 过滤器或使用 Stericup 进行过滤以消毒并去除任何污染的 RNase 痕迹。商店的长达6个月，在4 ℃。
使用前添加：
2.5 mM DTT（来自-20 °C 下储存的1 M 库存溶液）
为20U SUPERase我ÑRNase抑制剂/1毫升多核糖体提取缓冲液
完全无EDTA p rotease抑制剂（从50 ×储存在-20原液℃;见ř ecipes为“ 50 ×蛋白酶抑制剂溶液”下面）
SEC运行缓冲区
20 mM H EPES -NaOH (pH 7.4)
60 mM 氯化钠
10 毫米氯化镁2
5% 甘油
0.3% CHAPS
0.2 毫克/毫升肝素
2.5 毫米 DTT
过滤器或者通过较高的PVDF过滤器，或使用一个Stericup消毒和去除任何污染RNA酶痕迹。理想情况下，总是准备新鲜，但它可以在室温下储存 2 天。
50 ×蛋白酶抑制剂溶液
1片完整TM ，无EDTA的p rotease我nhibitor Ç ocktail
0.5 毫升 MQ 水
在1.5重悬以及-在-20毫升管和存储℃下。
胃蛋白酶溶液
20微克/毫升胃蛋白酶
0.1 M 醋酸
0.5 M 氯化钠
过滤器或者通过较高的PVDF过滤器，或使用一个Stericup消毒和去除任何污染RNA酶痕迹。一个lways准备新鲜。
RNase A 解决方案
20 微克/毫升 RNase A
10 mM Tris-HCl (pH 7.4)
0.5 M 氯化钠
过滤器或者通过较高的PVDF过滤器，或使用一个Stericup消毒和去除任何污染RNA酶痕迹。总是准备新鲜。
20× SSC
3 M 氯化钠
0.3 M 柠檬酸三钠脱水
2 × SSC，1% SDS 溶液
过滤器或者通过较高的PVDF过滤器，或使用一个Stericup消毒和去除任何污染RNA酶痕迹。在室温下储存。

致谢

该协议是对 Yoshikawa等人发表的先前研究进行了微小修改的。(2018)。我们感谢 Lamond 实验室的同事提出宝贵的建议。这项研究是内藤基金会资助的海外留学（2013-413到HY）：由以下资金支持上原纪念基金会博士后奖学金（201430061 to HY）；欧盟展望2020 [R esearch和我nnovation P下罗多夫斯卡玛丽-居里奖学金个人rogramme（657087到HY）; 和Tenovus Scotland Small Pilot 补助金（2017 年左右给 HY）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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