材料和试剂

形成玫瑰花结的iRBC
1. 在成熟阶段（滋养体至早期裂殖期，5-10％寄生虫血症，5％血细胞比容）的玫瑰花结形成寄生虫的培养物
2. 寄生物克隆系3D7/PF13，Palo Alto 89F5 Var0，IT4/R29或患者分离株
培养基试剂
1. 疟疾非免疫人AB血清+血清（3-5个不同供体的汇集物）
2. 具有L-谷氨酰胺和25mM HEPES（500ml）的RPMI 1640培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：52400）
3. 10mM次黄嘌呤溶液（100x）（C.C.Pro，目录号：Z-41-M）
4. 庆大霉素溶液（50mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：G1397）
其他材料
1. 非致热无菌聚苯乙烯，具有塞密封盖的长方形颈部细胞培养瓶（75cm 2，Corning Incorporated，目录号：430720; 25cm 2）， Corning Incorporated，目录号：430168，分别用于20和5ml培养基）
2. 冰冷的Ficoll（Lymphoprep TM，密度1.077g/ml）（Abcys，目录号：1114545）
3. 来自明串珠菌的硫酸葡聚糖钠盐，MW> 500,000（Sigma-Aldrich，目录号：D6001）
4. 来自猪肠粘膜的肝素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H3393）
5. 来自水泡藻（Fucus vesiculosus）的岩藻依聚糖（Sigma-Aldrich，目录号：F5631）
6. Hoechst 33342,10mg/ml水溶液（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：H-3570）。
7. 无菌蒸馏水RNase DNase free（Life Technologies， Gibco ，目录号：10977-035）
8. 小鼠，大鼠或兔免疫和免疫前多克隆血清
9. 单克隆抗体（mAbs）与玫瑰花形成iRBC的表面反应
10. 来自生活在疟疾流行地区的个体的血清或血浆样品
11. 来自疟疾非免疫个体的血清或血浆样品
  注意，所有血浆样品必须使用除肝素以外的抗凝剂（肝素在用于抗凝血活性的浓度下破坏多种菌株的玫瑰花结）收集。方便的抗凝剂是EDTA [乙二胺四乙酸]或柠檬酸钠）。储存于-20°C或-80°C直至使用。
  注意：Abs是由患者自制或收集的。

设备

将5ml聚苯乙烯圆底无菌管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352058）
无菌实验室真空过滤器0.22μm（Stericup Filter Units Millipore，目录号：051446）
将无菌聚丙烯锥形离心管（15ml，BD Biosciences，Falcon，目录号：352097; 50ml，BD Biosciences，Falcon ，目录号：352098）
无菌一次性血清学1ml吸量管（Dominique Dutscher，目录号：999079）
专业手套（例如 Kimtech Sterling丁腈手套，Kimberley-Clark Professional，目录号：99211或Satin Plus手套Kimberley-Clark Professional，目录号：SP2330E或2220E）
1.4ml基质圆底非无菌管（Thermo Fisher Scientific，目录号：10630784）
显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：10090431）和盖玻片22×22mm（Thermo Fisher Scientific，目录号：11728691）
用旋转叶片转子离心机（Thermo Fisher Scientific Heraeus Multifuge 3SR +离心机）
用A-4-38摆动转子离心机Eppendorf 5702（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-400-318）
真空泵（ILMVAC Biovac，型号：104）
具有UV光和40x或100x放大率的荧光显微镜（Leica荧光显微镜DM5000B，HP Plan目镜10×22 507897，HCX Plan 100x油，HCXPL 40x PH2）
在37℃下在连续注视中的孵育器：5％O 2，5％CO 2和90％N 2（Thermo Fisher Scientific Binder孵育器，型号：CB210）
层流II类，A2型生物安全柜（例如Thermo Fisher Scientific HeraSafe，目录号：13-998-002）

程序

请注意，在处理过程中必须使用手套。

玫瑰花结的制备
1. 准备玫瑰花形成寄生虫的寄生虫培养物（参见" 恶性疟原虫 Rosette formation assay "，第1节和2）。准备足够的材料以执行每个测定一式三份：每个测定需要3×40μl富含玫瑰花的悬浮液，在2％血细胞比容（见1.i-j。）。这对应于初始的20μl培养物，6-8％寄生虫血症，
2. 收获玫瑰花形成寄生虫的文化在成熟滋养体到裂殖体阶段（5-10％寄生虫血症）。避免晚期或分裂的裂殖体，形成松散的玫瑰花结
3. 通过在冰冷的Ficoll上离心来富集玫瑰花结（参见" 恶性疟原虫 Rosette formation assay " - 第2部分）。玫瑰花结破坏测定最好用具有超过50％玫瑰花结的频率的寄生虫培养物进行。
4. 通过在Fisher Scientific Heraeus Multifuge中在256×g（1,200rpm），室温下离心10分钟来旋转细胞。
5. 使用连接到真空泵的1ml抽吸无菌移液管抽吸上清液。
6. 在补充有10μg/ml Hoechst的4ml预热的CCM（参见Recipes）中轻轻地重新悬浮富含玫瑰花结的沉淀（一些玫瑰花结易于被简单的机械处理破坏，避免来回强烈吸液）。
7. 轻轻混合并在37℃下在黑暗中在具有连续注视的培养箱中孵育10分钟（5％O 2，5％CO 2，90％N ₂）。
8. 用CCM洗涤一次：在Fisher Scientific Heraeus Multifuge中在室温下加入900μlCCM，在256×g（1,200rpm）下离心3分钟。
9. 取出上清液，并在CCM（2体积（体积）细胞沉淀+98体积CCM）中以2％血细胞比容重悬沉淀。制剂的寄生虫血症通常在5％左右
10. 在1.4个基质圆底管中分配40μl的玫瑰花结富集的RBC悬浮液的等分试样
11. 离心机在Fisher Scientific Heraeus Multifuge中以178×g（1,000rpm）室温下离心5分钟。
12. 弃去上清液，按第2节或第3节所述处理沉淀。
13. 在CCM中制备肝素，硫酸葡聚糖，岩藻依聚糖或其他硫酸化聚糖的系列稀释液（0.1μg/ml - 1 mg/ml）。
14. 在CCM中制备血清，血浆（起始稀释度1/5）或纯化的mAb或免疫球蛋白制备物的系列稀释液作为稀释剂。包括阴性对照例如单独的CCM和非免疫血清（或Ig）和具有能够破坏玫瑰花结的血清或mAb的阳性对照。
用硫酸化聚糖进行解离测定
1. 加入100μl稀释的硫酸化聚糖到玫瑰花状制剂（1-j部分）
2. 在37°C孵育30分钟（使用培养箱，而不是水浴）
3. 取出60微升培养基，并将沉淀的沉淀重悬在剩余的体积中
4. 取10微升等分试样，将其放在显微镜载玻片上，并添加盖玻片
5. 在显微镜下计数100-200个iRBC，并且评分iRBC参与玫瑰花结（即，具有结合两个或更多个未感染RBC的滋养体或裂殖体阶段）（图1）。
图1.在用10μg/ml 硫酸葡聚糖孵育之前和之后的玫瑰花结离解测定。
1. 计算玫瑰花结率=（不成熟阶段iRBC参与玫瑰花结/成熟阶段）×100。
2. 计算解离速率=（无抑制剂的对照培养物的玫瑰花结速率 - 处理样品的玫瑰花结速率/无抑制剂的对照培养物的玫瑰花结速率）×100。
用免疫试剂进行解离测定
1. 制备血清，血浆（起始稀释度1/5）或纯化的mAb或免疫球蛋白制备物的连续稀释液。包括阴性对照例如单独的CCM和非免疫血清（或Ig）和具有能够破坏玫瑰花结的血清或mAb的阳性对照。
2. 加入40μl稀释的血清或血浆到玫瑰花制备（1-n部分）
3. 在37°C孵育30分钟（使用孵化器，而不是水浴）。
4. 将沉淀的沉淀重悬在培养基中。
5. 取10微升等分试样，把它放在显微镜载玻片上，并添加盖玻片。
6. 在显微镜下计数，100-200 iRBCs和iRBC分数参与玫瑰花结。
7. 计算玫瑰花结率=（不成熟阶段iRBC参与玫瑰花结/成熟阶段）×100。
8. 计算解离速率=（用非免疫试剂孵育的对照培养物的玫瑰花结速率 - 处理样品的玫瑰状化速率/用非免疫试剂孵育的对照培养物的玫瑰形成速率）×100。注意，在某些稀释度下，多克隆免疫试剂（和IgM mAb）倾向于破坏玫瑰花结并凝集iRBC。免疫凝集物容易显现为密集包装的iRBC（参见图2）。在较高稀释度下容易显现解离。

图2.孵育后获得的形成玫瑰花结的iRBC的凝集与针对PfEMP1衍生的小鼠多克隆抗体表面暴露结构域（稀释1/40）。 iRBC细胞核用Hoechst 33342染色，细胞用光A和UV B显微镜检查。

食谱

完全培养基（CCM，500ml）
445ml RPMI 1640
5ml次黄嘌呤溶液（终浓度100μM） 200μl庆大霉素溶液（终浓度20μg/ml） 50ml人AB血清+终浓度（终浓度10％）使用0.22μm过滤器单元灭菌
储存在4°C或-20°C长期储存
硫酸化聚糖的储备溶液准备10mg/ml的硫酸化聚糖在无菌水（0.1g + 10ml水）中的溶液使用0.22μm过滤器单元灭菌
等分并存储在-80°C
使用每个等分试样一次（不要冻融）

致谢

该方案改编自以下出版物：Vigan-Womas等人（2008和2010）。这项工作得到了Agence Nationale de la Recherche的合同ANR-07-MIME-021-0（www.agence-nationale-recherche.fr/）和第七个欧洲框架计划FP7/2007-2013（http：：//cordis.europa.eu/fp7/home_en.html）contract 242095，Evimalar。

参考文献

Vigan-Womas，I.，Guillotte，M.，Le Scanf，C.，Igonet，S.，Petres，S.，Juillerat，A.，Badaut，C.，Nato，F.，Schneider，A.，Lavergne， A.，Contamin，H.，Tall，A.，Baril，L.，Bentley，GA和Mercereau-Puijalon，O。（2008）。体内和体外模型的恶性疟原虫玫瑰花结和由varO介导的自凝集，varO是编码频繁血清型的A组var基因。 Infect Immun 76（12）：5565-5580。 br />
Vigan-Womas，I.，Lokossou，A.，Guillotte，M.，Juillerat，A.，Bentley，G.，Garcia，A.，Mercereau-Puijalon，O.and Migot-Nabias，对恶性疟原虫的体液反应 VarO玫瑰花结变体及其与保护的关联。 J 9：267。
Vigan-Womas，I.，Guillotte，M.，Juillerat，A.，Vallieres，C.，Lewit-Bentley，A.，Tall，A.，Baril，L.，Bentley，GA和Mercereau-Puijalon， 2011）。恶性疟原虫红细胞膜蛋白1的等位基因多样性需要变异特异性红细胞表面表位。
/em> 6（1）：e16544。