材料和试剂

T75 / T175 ˚F lasks物（Thermo Scientific TM ）
1 L / 2升组织培养-t reated ř奥勒b ottles（康宁TM ）
50米升/250米升/5μL p olycarbonate锥形˚F lasks（康宁TM ）
Teflon/玻璃 Dounce 均质器（Cambridge Glassblowing Limited）
Miracloth（Merck Millipore Calbiochem ，目录号：475855）
用于线粒体梯度的 SW40 管（Beckman，目录号：344060）
聚碳酸酯b ottle与Ç AP一个ssembly用于吨YPE 70Ti转子，用于缓冲（贝克曼，目录号：355618）
用于线粒体梯度的 TLS-55 管（Beckman，目录号：347356）
Dulbecco 改良 Eagle 培养基（Gibco TM ，Life Technologies）
不含四环素的胎牛血清（Gibco TM ，Life Technologies）
Freestyle 293 表达培养基（Gibco TM ，Life Technologies）
DNase（无 RNA）（HT Biotechnology，N401a）
正十二烷基β-D-麦芽糖苷（Anatrace ，目录号：D310）
18:1 心磷脂（TOCL ; Avanti ，目录号：710335C）
β ，γ-亚甲基鸟苷 5'-三磷酸钠盐（GMPPCP ；Sigma ，目录号：M3509）
P rotease抑制剂（完全TM ，Roche）的
R abbit anti-mS27（Abcam ，目录号：ab67157 ）
中号乌斯抗OXA1L（Abcam公司，目录号：ab88975 ）
山羊抗小鼠Alexa Fluor Plus 800（ThermoFisher ，目录号：A32730 ）
山羊抗兔Alexa Fluor Plus 680（ThermoFisher ，目录号：A32734 ）
MIB 缓冲液（线粒体分离缓冲液，参见配方）
SM4 缓冲液（蔗糖/甘露醇缓冲液，参见配方）
MIBSM 缓冲液（MIB+SM4：实验缓冲液，见配方）
SEM 缓冲液（蔗糖 EDTA MOPS缓冲液，参见配方）
60%、32%、23%和15% 蔗糖梯度缓冲液（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
蔗糖Ç ushion缓冲区（见食谱）
重悬缓冲液（见配方）
15-30％线性小号ucrose ģ radient缓冲液（见配方）

设备

自动细胞计数仪 (Countess ® II FL)
阿凡提-J26 XP离心机（贝克曼Ç oulter）
高速离心机（贝克曼库尔特，型号：Avanti J-26XP）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-80 XP）
桌面ù ltracentrifuge（贝克曼Ç oulter，型号：的Optima TM MAX）
离心机（Eppendorf，型号：5430 R）
纳米d ROP ® 2000（温）
Odyssey ® CLx 红外成像系统 (LI-COR Biosciences)
Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific)
Titan Krios 显微镜（Thermo Fisher Scientific FEI）

程序

细胞培养
将 PDE12 -/- HEK293 细胞保持在T75 烧瓶中的DMEM 中，并在 37°C 和 5% CO 2下补充 10% FBS 。细胞应准备好在约 2-3 天内转移到 T175 烧瓶中。
通过拆分规模达每2-3天，直到在到达靶细胞质量。推荐至少 8 个培养瓶，每个培养瓶含有 30 ml细胞，作为适应悬浮培养的起点。
在90％confluenc ë ，分离的细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA 10-15分钟，在37℃ ，和监测细胞四舍五入。Ç在200 entrifuge ×克以除去胰蛋白酶，然后重新悬浮沉淀的细胞2 -3倍10〜20毫升自由式MEDI微米有1个％FBS洗出旧的介质。
重悬分离的细胞在30 - 50米升Freestyle培养基含有1％FBS，调整与媒体细胞密度大约为0.5× 10 6 个细胞/ml，并在37°C、8% CO 2 、120 × g下生长。
通过使用含有 1% FBS 的预热新鲜 Freestyle 培养基进行稀释和拆分来扩大规模。使用自动细胞计数器对细胞进行计数并将细胞浓度调整为 0.5 × 10 6细胞/ml。
每隔一天观察和计数细胞，如果细胞密度高于1.5 × 10 6 个细胞/ml ，则继续分裂/稀释细胞。
最终的细胞密度的范围可以从0.8到1.5 × 10 6个细胞/米升，和线粒体的分离需要至少10升作为起始点（请参见注释用于开始野生型的体积）。
在4°C 下以 1,000 × g离心7 分钟收获细胞。小心倒出上清液，并在预冷的 PBS 中快速重悬沉淀的细胞以洗掉培养基。
将重悬的细胞在4°C 下以 1,200 × g离心10 分钟。小心倒出上清液，并权衡PELLE牛逼。继续从收获的细胞中分离线粒体，或在液氮中快速冷冻细胞并储存在 -80°C。

线粒体分离
预-冷却聚四氟乙烯/玻璃Dounce匀浆O / N在使用之前。
重悬沉淀（例如，10克）在60毫升缓冲液的MIB。
在 4°C 的冷室中轻轻搅拌 15 分钟，让细胞膨胀。
添加 20 ml SM4 缓冲液（MIB 缓冲液体积的1/3 ）。
Dounce 均质化样品（> 60 次上下通道）。
离心机中以800匀化样品×克为15分钟，在4℃下。收集上清液（上清液1）通过的Miracloth（或与其它干酪布一个典型孔尺寸的〜22-25微米）。保留颗粒。
重悬沉淀在20毫升MIBSM（3:1 MIB：SM）缓冲液，搅匀手动（〜15向上和向下次），然后离心在4℃下，800 ×克为15分钟。
通过 Miracloth收集上清液 ( S upernant-2) 并与来自 B-6 的 Supernatant-1 结合。离心机在1000 ×克为15分钟，在4℃下。收集上清液。
离心从上清先前以10,000步骤×克为15分钟，在4℃下。
保留颗粒，但小心地洗掉松散的颗粒，不要打扰紧的部分。
在 10 ml MIBSM 缓冲液中重悬，每 10 g 添加 100 U RNase-free DNase I 细胞，旋转对辊一冷室中静置20分钟。
离心机以10,000 ×克为15分钟，在4℃下。
将沉淀重悬在 ~2 ml SEM 缓冲液中，并用小型 Dounce 匀浆器轻轻匀浆。执行不超过五次上下传球。
在 SW40 管中准备1 5-23-32-60% 蔗糖梯度。地方加入1.5ml的60％蔗糖储备缓冲到贝克曼超清晰离心管中。小心地覆盖 4.5 ml 的 32% 蔗糖储备缓冲液。用 1.5 ml的23% 蔗糖储备缓冲液重复，然后用 1.5 ml的15% 蔗糖储备缓冲液重复。
负载从再悬浮粗线粒体试样小号TEP B13上的顶部的15％蔗糖中制备的密度梯度小号TEP B14。离心机在一个SW40转子以28，000 ×克为1个小时，在4℃下。
完整的线粒体在 60%-32% 蔗糖界面形成棕色带。小心地取下了从蔗糖的顶部，直到到达线粒体带，然后用移液管在32%和60%蔗糖的界面上取棕色带。
在液氮中快速冷冻纯化的线粒体并储存在 -80°C。

Mitoribosome-Oxa1L 纯化
在冰上解冻冷冻的线粒体。
向线粒体中加入2倍体积的裂解缓冲液（例如，向 4 ml 线粒体中加入 8 ml 裂解缓冲液）。混合立即被颠倒的管几倍。
均化用一个小聚四氟乙烯/玻璃的Dounce匀浆器以协助裂解。
[R上为辊otate一冷室中静置20分钟，以完成的裂解。
离心机的裂解材料（约9毫升）在30000 ×克为20分钟，在4℃下，以除去所述不溶性材料。小心地从沉淀中倒出上清液并丢弃沉淀。
制备的蔗糖垫在Ti70（管体积约24毫升）：底图7毫升1 M（34％，W / V）在管的底部蔗糖垫缓冲液。
层大约17 ml裂解线粒体样品上的蔗糖垫小心，从而导致在一个裂解物：缓冲比率的2.5：1。
在 4°C 下以 ~231,550 × g离心样品60 分钟。
丢弃的上清液和冲洗的管依次用重悬缓冲液以除去残留的蔗糖（在不干扰颗粒）。
重悬粒料一个总的100μl的重悬缓冲液中。
在A 260测量 mitoribosome 吸收。
加载的整个样品到一个线性15-30％的蔗糖梯度管。离心机在一个TLS-55转子在213，626 ×克为60-90分钟，在4℃下。
对梯度进行分级，确定A 260处的光密度，并将与核酸峰对应的分数汇集在一起。峰的典型A 260 : A 280比> 1.6。
如有必要，更换缓冲液并用至少 5-10 体积的最终缓冲液稀释样品；建议浓缩或透析。计算最终的浓度使用Ñ ANO d ROP和转换：1个甲260 = 0.1毫克/毫升。
用于该纯化的mitoribosome样品后续实验ö ř管理单元-在再悬浮缓冲液和储存冷冻在-80℃。

数据分析

所述mitoribosome-OXA1L纯化方案describ编这里采用PDE12 - / - HEK293细胞，但是APPLI电缆到野生型或其它HEK293衍生的细胞。的高-质量纯化样品使生物化学和结构分析，其可以被应用到研究人类mitoribosomal翻译。结构研究的代表性结果如下图所示；这些分析都只是简要描述工作作为质量控制用于样品制备在此协议。
在随后的离心步骤之后，完整的线粒体在蔗糖梯度上分离（图1 ）；需要特别注意收集 60%-32% 界面处的棕色条带，同时尽量减少周围缓冲液的污染。高质量完整线粒体的制备可用于纯化或研究其他线粒体大分子。
线粒体已成功地分离被溶解，并mitoribosome-OXA1L最终纯化，使用一个蔗糖垫随后是连续的线性15-30％蔗糖梯度。然后可以自动或手动分离蔗糖梯度，方法是用移液管小心地取分数或用 21 G 针头冲管底部并收集液滴。两个主要mitoribosomal群体在梯度确定：在55S monosome和所述大39S亚基，如图中图2 。位于更靠近底部的额外峰可能出现在制剂铅污染ED与80S核糖体细胞质。OXA1L存在我们的样品中，通过蛋白质印迹（如确认图2乙）和冷冻电镜图（图3 ）。为了研究新生的链易位，我们在核糖体出口隧道上使用信号减法 (FCwSS) 进行了重点分类。有关更多信息或其他计算机处理，请参见我们已发表论文（Desai等人，2020 年）中的图 S3、S12A 。

图1 。在蔗糖梯度上分离线粒体。在不连续的蔗糖梯度上分离线粒体。纯化的线粒体位于 32%/60% 界面。

图2 。P与OXA1L mitoribosomes对蔗糖梯度urification。A. 蔗糖梯度级分在 260 nm 处的吸光度。B.对馏分中的核糖体蛋白 mS27 和 OXA1L 进行蛋白质印迹，表明 Oxa1L在我们的制备中与核糖体s共沉淀。

图3 。冷冻电镜显微照片、2D 类别和 3D 初始重建。A.显微照片的所述mitoribosome-OXA1L样品。B. [R具有代表性处理数据（2D类）。C.三维重建的mitoribosome-OXA1L复杂。

笔记

细胞培养注意事项：
细胞活力应保持在>90%，对于收获的最终培养物 >95%。细胞培养过程是专门为PDE12 - / -在第使用的细胞是手稿。
对于野生型细胞，所有步骤都在相同的但有两个：
在 FreeStyle 培养基 + 5% FBS 悬浮培养中培养细胞。小号PLIT时的细胞密度达到2 × 10 6个细胞/ ml（用A3-4相比）。
以~3-4 × 10 6 个细胞/毫升的浓度收获细胞。
一旦你甲肝Ë 10-20克细胞沉淀（从10-15大号PDE12 - / - HEK细胞或2L的野生-类型的HEK293细胞）作为起始点，存在有在下面的步骤没有差异为线粒体分离和纯化mitoribosome .
线粒体分离注意事项：
在整个过程中快速工作并保持一切都在冰上很重要。
除了一个d盎司搅匀ř在小号TEP B5 ; 或者，您可以在500 psi的压力下使用氮气空化20 分钟（Aibara等人，2018 年）。P重新冷却氮气穴室O / N在4 ℃下。
mitoribosome- O xa 纯化注意事项：
你Ç一个总是开始一个细胞的更小的体积和随后的LY准备一个缓冲器的更小的体积，以柯Ë P上的比率是相同的。
该协议中TLS-55转子的小蔗糖梯度允许快速纯化 mitoribosome-Oxa1L ；然而，55S 单体和 39S 大亚基峰之间通常存在重叠。在55S和39S群体的分离是没有必要的冷冻电镜研究，给出个在进一步的处理将被执行。如果需要在其它情况更好地分离小号，较大的管（例如，SW40）和一个较长的运行时间（例如，16小时）的建议。
在我们的数据集中，在所有 mitoribosome 样本s 中，mitoribosome 与 Oxa1L的复合物es的比例约为 12%。

食谱

线粒体分离缓冲液
1.线粒体分离缓冲液 (MIB)
50 mM HEPES-KOH，pH 7.4
10 毫米氯化钾
1.5 毫米氯化镁2
1 mM EDTA
1 mM EGTA
1 毫米 DTT
P rotease抑制剂（1片/ 50ml）中
2.蔗糖/甘露醇缓冲液 (SM4)
280 mM 蔗糖
840 mM 甘露醇
50 mM HEPES-KOH，pH 7.5
10 毫米氯化钾
1.5 毫米氯化镁2
1 mM EDTA
1 mM EGTA
1 米 M DTT
P rotease抑制剂（1片/ 50ml）中
3.实验缓冲液（MIBSM）
3体积小号MIB混合物用1倍体积SM4（例如，120毫升MIB缓冲液+40毫升SM4缓冲液）
4.蔗糖-EDTA MOPS (SEM) 缓冲液
250 mM 蔗糖
1 mM EDTA
20 mM MOPS-KOH（替代：HEPES-KOH，pH 7.4）
5.蔗糖梯度 (SG) 缓冲液
20 mM HEPES-KOH，pH 7.4
1mM EDTA和60％/ 32％/ 23％和15％的蔗糖，分别（使分离的储备溶液的4个不同的蔗糖浓度小号用于该逐步蔗糖梯度的制备）。

用于线粒体纯化的缓冲液
裂解缓冲液
25 mM HEPES-KOH ，pH 7.4
150 毫米氯化钾
50 mM MgOAc
1.5% β -DDM
0.15毫克/毫升心磷脂
500 mM GMPPCP
2 M 数字地面电视
P rotease抑制剂（1片/ 50ml）中
蔗糖垫 (SC)
1 M 蔗糖（34% w/v）
20 mM HEPES-KOH ，pH 7.4
100 毫米氯化钾
20 mM MgOAc
0.6% β -DDM
0.06 毫克/毫升心磷脂
250 mM GMPPCP
2 毫米 DTT
重悬缓冲液 (RB)
20 mM HEPES-KOH，pH 7.4
100 毫米氯化钾
5 mM MgOAc
0.15% β -DDM
0.015 毫克/毫升心磷脂
250 mM GMPPCP
2 毫米 DTT
15-30% 线性蔗糖梯度
15-30％线性小号在20mM HEPES-KOH ucrose，pH 7.4中
100 毫米氯化钾
5 mM MgOAc
0.05% β -DDM
0.005 毫克/毫升心磷脂
250 mM GMPPCP
2 毫米 DTT

致谢

这项工作获得了以下来源的资助：英国医学研究委员会 (MC_U105184332)；威康信托高级研究员奖 (WT096570)；阿古隆研究所；和路易斯-让泰基金会。HY由EMBO资助长期研究金（EMBO ALTF 806-2018），和N.D.由Wellcome基金会临床研究金博士（110301 / Z / 15 / Z）的资助。该协议取自Desai等人。( 2020 )稍作修改。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的财务或非财务利益。

参考

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