材料和试剂

1. 60毫米培养皿（格雷纳乙IO- ø NE，目录号：628102 ）
2. 1.5 ml 微量离心管（AXYGEN ，目录号：MCT-150-C ）
3.载玻片和盖玻片（MARIENFELD，目录号：0107052）
4. 10毫升小号yringe（泰尔茂，目录号：DVR-3424 ）
5. 0.22微米小号yringe ˚F ilters（MCE膜过滤器，JET BIOFIL，目录号：AGC-F-MCE022-13）
6. C. elegans菌株来自 Caenorhabditis Genetics Center：
N2 布里斯托尔、eat-2(ad1116)、daf-2(e1370)
7. OP50-1 è scherichia大肠杆菌细菌（秀丽隐杆线虫遗传学中心）
8.油红O染色剂（Sigma ，目录号：O0625 ）
9.次氯酸钠溶液（6-14% 活性氯基；Sigma ，目录号：13440 ）
10. ķ 2 HPO 4 （j 。Ť 。贝克，目录号：3252-01 ）
11. Bacto agar （BD ，目录号：214510 ）
12.细菌蛋白胨（BD ，目录号：211677 ）
13. CaCl 2 ·2H 2 O （Sigma ，目录号：C3306 ）
14.胆固醇（Sigma ，目录号：C3045 ）
15. EGTA（Sigma，目录号：E8145 ）
16.亚精胺（Sigma，目录号：S2626 ）
17.精胺（Sigma，目录号：S4264 ）
18. PIPES（Sigma，目录号：P6757 ）
19. 2-巯基乙醇（Sigma，目录号：M3148 ）
20. 16% 多聚甲醛（Alfa Asear，目录号：43368 ）
21.氯化钾（Ĵ 。Ť 。乙阿克尔，目录号：3040-01 ）
22. 2-丙醇（Sigma，目录号：I9516 ）
23. KH 2 PO 4 （Sigma，目录号：P 9791 ）
24. Na 2 HPO 4 ·7H 2 O（OMNIPUR，目录号：8210 ）
25.氯化钠（Ĵ 。Ť 。贝克，目录号：3624-05 ）
26. MgSO 4 ·7H 2 O （Sigma，目录号：M2773）
27. Triton X-100（Sigma，目录号：T8787）
28. LB肉汤（BIO-DOC，目录号：BDLBB-500）
29.线虫生长培养基（NGM）（见配方小号）
30. 2× MRWB原液（见配方小号）
31. M9缓冲液（见配方小号）
32.线虫生长培养基（NGM）琼脂1 L培养基（见配方小号）
33. LB培养基（见配方小号）
34.漂白溶液（见配方小号）
35.油红O染色原液（见配方小号）
36.磷酸钾缓冲液（见配方小号）

设备

低温冷藏培养箱（精密，目录号：PR505755R，温度范围从 -10 °C到 +60°C ）
离心（Thermo Scientific的，型号：微微17,24 × 1.5 /2毫升转子，米。斧小号小便13300转）
解剖显微镜（奥林巴斯，型号：SZ61）
荧光显微镜（奥林巴斯，型号：BX63）

软件

MatLab（The MathWorks，https ://www.mathworks.com/products/matlab.html ）
Cellsens（奥林巴斯，https: //www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens/ ）

程序

C.线虫保养
将n大肠杆菌OP50 菌落接种到 200 毫升烧瓶中的 50 毫升 LB 肉汤中，并在 37°C下轻轻搅拌孵育过夜。
将大约200 μl 的 OP50液体培养物应用到 60 mm NGM 板上。接种孵育在室温下板3 -使用前7天。
转移50 - 100混合阶段幼虫蠕虫使用加热灭菌铂丝拾取新OP50-接种NGM板。将蠕虫保持在 20°C。
重复小号TEP一个3每隔2-3天进行维修。

通过漂白同步线虫
在 1.5 ml 离心管中收集蠕虫（第 3 天的维护板通常具有最大数量的妊娠成虫），其中含有 1 ml M9 缓冲液和0.1% Triton X-100。
以 200 × g离心 1 分钟并丢弃上清液。
将0.5ml漂白溶液（见配方4 ）到管中并且在室温下长达5分钟轻轻摇动。监测蠕虫裂解的解剖显微镜下的程度。
将0.5ml的M9缓冲液，淬灭漂白过程。
注意：避免过度漂白。
离心机在1 1分钟，300 ×克。丢弃上清液。
重复小号TEPS乙4和乙5两次洗掉漂白剂溶液。
轻轻倒转试管，将两滴 2 微升鸡蛋混合物放在干净的显微镜载玻片上。计数鸡蛋并确定鸡蛋的浓度。
将约 150 个鸡蛋放在 OP50 接种的 60 毫米 NGM 板上（每个菌株/条件 2-3 个板）并在 20°C下生长。
每 2 天将同步蠕虫转移到新的 OP50 板上，直到它们达到所需的阶段。

蠕虫油红O染色
在所需阶段用 M9 + 0.1% Triton X-100 在 1.5 ml 离心管中收集同步的 300 条蠕虫（来自两个60 mm NGM 板）。以 200 × g离心 1 分钟。
弃上清，然后用 1 ml M9 清洗蠕虫，200 × g离心 1 分钟。重复此步骤 3 次以洗掉细菌。最后一次洗涤后，将蠕虫留在 100 μl M9 缓冲液中。
制备1 ml的的2 × MRWB通过添加缓冲液250μl的16％多聚甲醛到750微升MRWB原液。
通过加入100固定蠕虫微升2 × MRWB缓冲液（新鲜制备的）含所述管中的蠕虫的100μl的M9缓冲液。
在室温下孵育样品 1 小时。每 15 分钟轻轻反转管子。
旋转蠕虫并丢弃上清液。
加入1ml的M9 + 0.1％的Triton X-100，离心，以1 1分钟，500 ×克，并去除上清。重复此步骤两次。
对于脱水，加入 1 ml 60% 2-丙醇，然后在室温下避光孵育样品 15 分钟。
当样品处于脱水状态时，准备油红 O 工作溶液。混合油红O贮存液（在85预热℃的水浴2小时）和双蒸2 ö在3：2的比率。彻底混合工作液。甲吨这一点，在米ixed溶液出现混浊。工作溶液每次都应从原液中新鲜制备。
通过 0.22 - μm 注射器过滤器过滤混合溶液。流出物应呈深红色但清澈。
降速脱水样品（来自小号TEP Ç 8）在1500 ×克1分钟，然后弃上清。
添加油的200微升红O工作溶液（从小号TEP Ç 10）到每个管中。孵育在37黑暗℃，4 - 6小时。
以 1,500 × g离心1 分钟以沉淀蠕虫。丢弃染色染料。
洗涤用1毫升的M9 + 0.1％的Triton X-100，和离心机中以1 1分钟，500 ×克。重复此步骤两次。
最后一次洗涤后，留下 100 μl M9 溶液。在室温下储存在黑暗中直到需要。
将蠕虫安装在带有琼脂糖垫 (ddH 2 O 中的2% w/v 琼脂糖) 的载玻片上,并在显微镜下观察它们。

数据分析

通过测量染色面积和每只蠕虫的平均染色强度来量化蠕虫的脂质含量。我们创建了一个MatLab的插件，为我们的图像处理。以下是一步为我们的插件（图1）步骤的指令：
启动MatLab软件。
首页>打开> “ORO染色软件” 。
编辑器>运行。该染色质量窗口会显示出来。
按打开并选择 ORO 染色蠕虫的图像。该文件窗口将同时出现在屏幕上。
按设置比例并调整蓝线以匹配比例尺。输入已知距离、像素纵横比和长度单位。按OK应用到选定的图像。
通过调整两个水平杆设置的阈值的染色窗口进行量化。将计算与红色区域中的像素关联的强度值。单击图像以查看原始灰度图像。
单击ROI以在图像中选择您感兴趣的区域。
蠕虫中红色区域的平均强度可以在染色量化窗口中找到。
直接单击文件名或使用Pre和Next按钮选择图像。
完成所有测量后，按保存将结果保存在 Excel 文件中。

图1. ü破产管理署染色软件的SER接口。A.图像窗口。红色区域中像素的强度值将被计算为 ORO 信号。B.染色量化窗口包括两个阈值选择栏、结果图表和设置按钮。C.文件窗口。打开的图像将列在此窗口中。

在下面的章节中，我们已经申请了破产管理署染色协议，以野生型N2动物，吃-2 （ad1116 ）突变体，以及DAF-2（e1370）突变体。以前的研究已经表明，吃-2 （ad1116 ）突变体，饮食限制的遗传模型，具有比野生型动物脂肪少存储（艾利，1993）。在另一方面，DAF-2突变体是长寿命，并增加了脂肪含量（木村等人，1997）。按照在协议上述图像处理和数据分析，我们表明，ORO信号的面积，而不是IR平均强度，显着降低在吃-2突变体。然而，ORO的面积和强度信号既增加的daf-2突变体（图2）。在这里，我们证明了通过该协议获得的结果与先前的发现非常吻合，并提供了关于脂肪含量总量和蠕虫中储存脂肪的空间分布的额外信息。

图 2. 野生型 N2、eat-2( ad 1116 )和daf-2(e1370)突变体中的油红 O 染色水平。A.野生型 N2、eat-2( ad 1116)和daf-2(e1370)动物幼虫 4 阶段油红 O 染色的代表性图像（比例尺：50 μm）。B.野生型 N2、eat-2( ad 1116)和daf-2(e1370)突变体中油红 O 染色区域的定量。C.野生型动物、eat-2( ad 1116)和daf-2(e1370)突变体中平均油红 O 强度的量化（100% 描述饱和度水平）。使用单向方差分析测试，然后是针对选定组的 Dunnett 事后测试。样本大小：N2 为n = 40，eat-2为n = 45 ，daf-2为n = 30 。结果代表平均值 ± SD，*** P < 0.001。

笔记

固定后，蠕虫得到经常卡住在塑料表面上，如管和移液管。为了最大限度地减少蠕虫，使用玻璃滴管，玻璃管的损失，和M9缓冲液含有去污剂，如0.1％的Triton X-100 。尽管如此，15亏损- 20 ％，可能会在整个过程中发生的。如果必要，增加蠕虫的数量。
在切片上安装蠕虫时，将移液器尖端的末端切掉约 0.5 厘米。创建更宽的开口将避免在传输时破坏蠕虫。
食谱

M9缓冲器
3 克 KH 2 PO 4
11.32 克 Na 2 HPO 4 ·7H 2 O
5 克氯化钠
最多 1升的水
高压灭菌，然后加入1 ml 1 M MgSO 4 （过滤灭菌）
用于 1 L 培养基的线虫生长培养基 (NGM) 琼脂
3.0 克氯化钠
20克细菌用琼脂
2.5克细菌蛋白胨
高压灭菌来灭菌琼脂，冷却至55℃，然后加入：
1 ml 1 M MgSO 4 （过滤灭菌）
1 ml 1 M CaCl 2 （过滤消毒）
1 毫升 5 毫克/毫升胆固醇在无水乙醇中
25 ml 1M 磷酸钾缓冲液（参见配方 6）
LB培养基
25 g LB 肉汤溶于 1 L ddH 2 O
漂白液
3毫升次氯酸钠溶液
1.5 毫升 5N 氢氧化钾
最多10毫升的水
MRWB 原液
590 毫克氯化钾
117毫克的NaCl
0.7 毫升 1M EGTA
7.26 毫克亚精胺
4 毫克精胺
1.5毫升的1个中号PIPES（pH 7.4）中
0.1毫升β-ME
在 50 ml ddH 2 O 中溶解
油红O染色原液
0.5 g ORO 粉末在 100 ml 2-丙醇中
磷酸钾缓冲液（1 M KPO 4 ，pH 6.0）
108.3 克 KH 2 PO 4
35.6 克 K 2 HPO 4
最多 1升的水
1 MEGTA
50 ml ddH 2 O 中的19 g EGTA 粉末
1 M HEPES 原液 (pH 7.4)
80 ml ddH 2 O 中的23.8 g HEPES
添加NaOH 将 pH 值提高到7.4
W¯¯亚特到100毫升

致谢

我们感谢 Cho-Lun Chiang 为数据分析提供技术支持。这项工作是由来自Minist资金支持RY科技，台湾（MOST 106-2311-B-010-005）。该方案基于出版物“S-腺苷甲硫氨酸合成酶 SAMS-5 介导了秀丽隐杆线虫的饮食限制诱导的长寿”（Chen等人，2020 年）。

利益争夺

作者没有要声明的利益冲突。

参考

Ashrafi, K. (2007)。肥胖与脂肪代谢的调节。蠕虫书：1-20。
Avery, L. (1993)。秀丽隐杆线虫饲养的遗传学。遗传学133（4）：897-917。
Barros, AG、Liu, J.、Lemieux, GA、Mullaney, BC 和 Ashrafi, K.（2012 年）。性分析C.线虫脂肪代谢途径。方法细胞生物学107：383-407。
Jones, KT 和 Ashrafi, K. (2009)。秀丽隐杆线虫作为研究肥胖基本生物学的新兴模型。 Dis Model Mech 2（5-6）：224-229。
Kimura, KD、Tissenbaum, HA、Liu, Y. 和 Ruvkun, G. (1997)。daf-2是一种胰岛素受体样基因，可调节秀丽隐杆线虫的长寿和滞育。科学277(5328)：942-946。
McKay, RM, McKay, JP, Avery, L. 和 Graff, JM (2003)。Ç 。线虫：探索脂肪储存遗传学的模型。开发单元4(1)：131-142。
O'Rourke, EJ, Soukas, AA, Carr, CE 和 Ruvkun, G. (2009)。秀丽隐杆线虫的主要脂肪储存在不同于溶酶体相关细胞器的囊泡中。细胞代谢表10(5)：430-435。
Ramirez-Zacarias, JL、Castro-Munozledo, F. 和 Kuri-Harcuch, W. (1992)。通过用油红 O 染色胞质内脂质定量脂肪转化和甘油三酯。组织化学97(6): 493-497。
Suh, JM, Zeve, D., McKay, R., Seo, J., Salo, Z., Li, R., Wang, M. 和 Graff, JM (2007)。脂肪是一种保守的剂量敏感抗肥胖基因。细胞代谢表 6(3)：195-207。
Yen, K., Le, TT, Bansal, A., Narasimhan, SD, Cheng, JX 和 Tissenbaum, HA (2010)。使用标记和无标记方法对秀丽隐杆线虫中脂肪储存定量的比较研究。公共科学图书馆一5(9)。
Zhang, SO、Trimble, R.、Guo, F. 和 Mak, HY (2010)。脂滴作为线虫中无处不在的脂肪储存细胞器。BMC 细胞生物学 11：96 。
版权所有 © 20 2 1作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。1