材料和试剂

1.培养皿（VWR，目录号：391-0440）
2.平板培养摊铺机（VWR，目录号：612-1561）
3.接种环小号（VWR，目录号：612-9352）
4. 50 -毫升锥形管小号（VWR，目录号：525-0402）
5.化学感受态大肠杆菌MC1061
6. Q5聚合酶（NEB，目录号：M0491L，储存：-20°C）
7. Dpn I（NEB，目录号：R0176L，储存：-20 °C ）
8. dNTPs（Thermo Scientific，目录号：R0181，储存：-20 °C ）
9.寡核苷酸（Eurofins Genomics）
10.琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）
11. O'GeneRuler DNA Ladder（Thermo Scientific，目录号：SM1163）
12. DNA小量制备试剂盒（OmegaTek，目录号：D6943-02）
13.酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
14.胰蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0042）
15. NaCl（VWR，目录号：ICNA0219473805）
16.琼脂（VWR，目录号：20767.298）
17.硫酸卡那霉素（VWR，目录号：0408-EU-25G，储存：4 °C ）
18.氨苄西林钠盐（Sigma，目录号：A0166-25G，储存：4 °C ）
19. LB培养基（见ř ecipes）
20.抗生素原液（见配方）
21. LB琼脂（参见ř ecipes）
22. 50 × TAE缓冲液（见ř ecipes）
23. DNA上样缓冲液（见ř ecipes ）

设备

热循环仪（Techne，目录号：5PRIME/02）
DNA微型水平潜艇单元（Hoefer，目录号：HE33）
电泳p奥尔供给（GE ħ ealthcare，目录号：EPS601）
凝胶I mager Azure C200（Azure Biosystems，目录号：AC2001）
Thermomixer中Ç omfort仪（Eppendorf ，目录号：5355000.011）
新不伦瑞克我ncubator（新不伦瑞克省，目录号：M1282-0012）
台式离心机（Eppendorf ，型号：5417C）
NanoDrop S分光光度计（Thermo Scientific ，目录号：ND-2000）

程序

检查协议是否是相关的宠物通过交叉参考表1和表2。如果是这样的质粒的兴趣，订单的要求寡核苷酸组。
协议 1 将纠正 T7 lac模块中的设计缺陷，将其转换为T7p CONS lac。该协议仅适用于表 1 中列出的pET 质粒。
协议 2 将用两个优化的TIR 之一替换标准 TIR 。该协议仅适用于编码N端聚- pET表达质粒ħ istidine标签，例如那些在表1中列出。
表 1.将受益于每个协议的pET 质粒

订购实施 T7 CONS lac启动子（协议 1）和/或 TIR（协议 2）所需的寡核苷酸集。寡核苷酸在其 3' 端与质粒模板互补，在 5' 端彼此互补。序列在表 2 中提供。

表 2.用于纠正设计缺陷的寡核苷酸序列

协议 1 的 PCR 设置和程序
结合以下试剂（最终反应体积 25 μl）：
5 μl Q5 反应缓冲液
5 μl GC 增强剂溶液（可选：包含在 Q5 聚合酶试剂盒中）
1 μl dNTP，来自 10 mM 储备液（0.4 mM 终浓度）
10 μM 原液中的 1.25 μl 引物 1（0.5 μM 终浓度）
1.25 μl 引物 2 来自 10 μM 原液（0.5 μM 终浓度）
0.5 μl 模板质粒来自 2 ng/ μ l原液（0.04 ng 终浓度）
0.25 μl Q5 聚合酶
10.75 μl 无菌超纯水
使用以下参数设置 PCR 程序：
在 95°C 下保持 5 分钟
第一个循环，重复 5 次
95°C 30秒
48°C 30秒
72°C 3.5 分钟
第二个循环，重复 20 次
95°C 30秒
60°C 30秒
72°C 3.5 分钟
10°C 无限保温

协议 2 的 PCR 设置和程序
结合以下试剂（TIR-1或TIR-2 ）（最终反应体积 25 μl）：
5 μl Q5 反应缓冲液
5 μl GC 增强剂溶液（可选）
1 μl dNTP，来自 10 mM 储备液（0.4 mM 终浓度）
1.25 μl 引物 3 (TIR-1) 或 4来自 10 μM 原液(TIR-2)（0.5 μM 终浓度）
10 μM 原液中的1.25 μl 引物 5 （0.5 μM 终浓度）
0.5 μl 模板质粒来自 2 ng/μ l原液（2 ng 终浓度）
0.25 μl Q5 聚合酶
10.75 μl 无菌超纯水
使用以下参数设置 PCR 程序：
在 95°C 下保持 5 分钟
第一个循环，重复 5 次
95°C 30秒
48°C 30秒
72°C 3.5 分钟
第二个循环，重复 20 次
95°C 30秒
60°C 30秒
72°C 3.5 分钟
10°C 无限保温

检查所述用琼脂糖凝胶电泳PCR产物
用 1 × TAE 缓冲液和适当的凝胶染色剂浇铸 1% (w/v) 琼脂糖凝胶。
拌3 μ升与PCR反应一个合适的DNA加样缓冲液。
加载的样品和在恒定100伏电泳进行30分钟。
在合适的成像工作站（如 Azure 200、Azure Biosystems）上可视化凝胶。图 3 显示了预期 PCR 产物的示例。

图 3.方案 2的预期 PCR 产物示例。TAE 缓冲液中的 1% 琼脂糖凝胶。泳道 1：O'GeneRuler 1 - kb Plus DNA Ladder（Thermo Scientific）。泳道 2：使用引物 3 和 5 的 PCR 产物。泳道 3：使用引物 4 和 5 的 PCR 产物。

对PCR 产物进行Dpn I 处理
结合在200以下-微升PCR管：
4微升的PCR产物（可选：执行PCR清理的样品之前的DpnI予处理）
0.5 μl Cutsmart 缓冲液（包含在Dpn I套件中）
0.5 微升Dpn I
孵育的样品在37℃下为1个在热循环（如Techne公司大幅面梯度热循环仪）小时。
可选：在 80°C 下加热灭活Dpn I 15 分钟。

变换MC1061用的DpnI我-处理PCR产物
加入5微升的DpnI我-处理过的样品至50μl化学感受态大肠杆菌（E.coli），如MC1061或一个能够替代应变体内DNA装配。
在冰上孵育 30 分钟。
热休克在42℃下为1分钟。
在冰上孵育2分钟。
添加 150 μl LB 培养基。
使用热混合器（例如 Eppendorf Thermomixer R）以 900 rpm摇动在 37°C 下孵育30 分钟。
板100微升细胞培养物到LB-一个GAR含有一个合适的抗生素。
允许该板在无菌环境中干燥。
在 37°C下将板面朝下孵育过夜。

选择菌落和序列
选择两个单独分开的菌落，接种10毫升LB培养基用一个合适的抗生素，在50 -毫升锥形管中。
将接种的培养物在 37°C 下孵育过夜，并以 180 rpm 的速度摇晃。
收获的通过离心培养物在3 ，220 ×克10分钟。
提取的使用小量制备试剂盒，例如自Omega酶标仪的EZNA DNA mini试剂盒的质粒。
测量的使用分光光度计DNA浓度，如纳米滴2000（Thermo Scientific）进行。
发送的纯化质粒进行测序。
注意：使用适当的引物是一个微量庵从突变的网站60基点。
新的修饰的DNA序列插入确认通过比较与预期序列使用一个独立的程序，例如SnapGene （下载从https://www.snapgene.com/）或在线浏览器-基于程序如从Benchling（接入HTTPS：/ /www.benchling.com/）。

食谱

LB培养基
10 克/升氯化钠
10g / L的吨ryptone
5 g/L y东方提取物
溶解在1大号ü ltrapure水和通过高压灭菌消毒
一个ntibiotic原液
权衡的抗生素的需要的量S; 50毫克/米升ķ anamycin或100mg /米升一mpicillin
加入超纯水的所需量和涡旋溶解
在无菌条件下，过滤器消毒的抗生素溶液进入的适当体积
直接使用或-20°C保存
LB琼脂
LB 培养基加 15 g/L 琼脂
溶解在1大号ü ltrapure笏ER和通过高压灭菌消毒
让介质冷却至 ~50°C
甲DD合适的抗生素和倾20 -米升体积成9.5 -厘米的培养皿
三醋酸 (TAE) (50 × )
242.2 g/L Tris 碱 (2 M)
57.1 毫升/升醋酸 (1 M)
18.6 克/升 EDTA (50 mM)
6 × DNA 上样缓冲液
60% v/v 甘油
20 mM Tris pH 8.0
60 mM EDTA
0.03% 溴酚蓝

致谢

钍是工作是由瑞典研究理事会的支持（2017-00704 ），并在卡尔Trygger小号小号tiftelse。最初的研究导致这些协议我S中描述先令等。( 2020) ; 我们要感谢该出版物的所有合著者。我们还感谢 James Cumming 和 Diana Khananisho 测试协议。

利益争夺

这些协议和设计这里描述的是从知识产权的自由。然而，合成的演变过程用于识别TIR-1和TIR-2是专利-保护的（PCT / SE2015 / 051343;欧洲专利没有3234146）。这些专利是 CloneOpt AB 的财产，其中 PJS 是前雇员，DOD 是股东。

参考

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