材料和试剂

1.微量离心管（1.5 ml和2 ml ）（BBI，目录号：F600620-0001）
2.移液器吸头
3.塑料P ETRI培养皿（直径90mm）
4. Jiffy pots（直径41 mm）（Jiffy International，克里斯蒂安桑，挪威）
5.分光光度计塑料比色皿（BRAND，目录号：759015）
6.针筒式滤器（0.45微米）（的Millex，的Millex ® -HV，目录号：SLHV033RB）
7.番茄种子（Solanum lycopersicum cv . Moneymaker ）
8.标准盆栽土（Pindstrup，目录号：1034593214）
9.蛭石（通用）
10.蒸馏无菌水
11. 75％的乙醇（国药化学试剂有限公司，SCR ® ，目录号：801769610 ）
12.氯化三苯基四唑鎓（TTC）（Sigma-Aldrich，目录号：T8877-5G）
13.葡萄糖（国药化学试剂有限公司，SCR ® ，目录号：63005518 ）
14. Bacto蛋白胨（BD ，目录号：211677）
15.酵母提取物（OXOID，目录号：LP0021）
16.酪蛋白ħ ydrolysate（酪蛋白氨基酸）（Sigma-Aldrich公司，目录号：22090-500G）
17.琼脂（国药化学试剂有限公司，SCR ® ，目录号：10000561 ）
18. Phi 培养基（见食谱）
19. 1% (W/V) TTC 溶液（见配方）
20. 20% (W/V) 葡萄糖溶液（见配方）

设备

微量样品注射器10μl （Sangon Biotech，目录号：E718LD0023）
无菌手术刀
EasySpiral ®自动连续稀释器和平板（可选）（Interscience，E asysprial ® ，目录号：412000 ）
植物生长室（Percival，型号：I-36VL）
高压釜（SANYO，型号：MLS-3780）
离心机（Eppendorf，型号：C entrifuge 5424）
pH计（Sartorius，型号：PB-10）
28 °C培养皿培养箱（松下，型号：MIR-262-PC）
28 °C管式培养箱（振荡器）（Eppendorf，New Brunswick TM ，目录号：m1324-0006）
纳米d ROP分光光度计（Thermo Scientific的，纳米滴2000C）
蒸馏水/消毒器（Millipore公司，型号：祢升升I-Q可积10L）
Vortex（科学工业，型号：Vortex-Genie 2，目录号：S1-0246）

软件

GraphPad Prism 7 ( https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ )

程序

种植番茄植物
在标准盆栽土壤和蛭石的 1:2 混合物中发芽番茄种子（Solanum lycopersicum cv. Moneymaker）。在生长室（25°C，16 小时光照/8 小时黑暗光周期，130 mE m -2 s -1 ，65% 湿度）中生长一周的幼苗(图1A)。
用自来水彻底浸泡的Jiffy盆无肥料（过量的肥料的可能引起应力的番茄幼苗）（小号EE注1）。将番茄幼苗转移到含有预包装土壤混合物（图 1B）（见注 1）的单个浸水瞬间盆中。在同一个生长室中再种植番茄植物三周（图 1C）（见注 2）。建议每次处理大约 6-8 株植物以获得稳健的结果。

图 1. Jiffy 盆中番茄幼苗的生长。A.番茄种子（Solanum lycopersicum cv. Moneymaker）在标准盆栽土和蛭石的 1:2 混合物中发芽。B.转移番茄幼苗到个人水渍瞬间盆含有预包装的土壤混合物。C. 4 周龄的番茄植株准备接种Ralstonia 。

青枯菌接种物的制备
制备固体和液体披培养基（参见ř ecipes）按照标准程序（Yu和马霍，2021）。
条纹出青枯雷尔氏菌在含有TTC和葡萄糖固体披培养基平板株（见ř ecipes;于和马霍，2021 ），并如先前所述（制备细菌悬浮液于和马霍，2021 ）。
稀释在蒸馏水中的最终细菌悬浮液至OD 600 = 0.1，其对应于约10 8 CFU / ml的（莫瑞尔等人，2018）。执行使用蒸馏水细菌悬浮液的系列稀释液以达到10 6 CFU / ml的在在无菌2的1ml体积- ml离心管（见注3）（图2）。考虑在特定实验条件下测试不同剂量特定菌株毒力的可能性。在我们的条件下，我们选择了 10 6 CFU/ml 作为合适的浓度，以允许在接种后的前 3 天 (dpi) 内番茄茎内逐渐但可重复的细菌复制，而不会在实验过程中引起坏死症状的发展（图 3） .

图 2.青枯菌接种物的制备

接种（茎注射）和木质部汁液取样
使用10 -微升微量，注入5μl的细菌悬浮液到茎的4周龄的番茄植株小号（见注4）。接种部位应该是低于约2厘米子叶EMERG ENCE站点（图3A和3B）。进行茎注射时，注射器和茎之间使用大约30°的角度，以促进细菌悬浮液的注射。
代替接种番茄植株在生长室中（28℃，12小时光照/ 12小时黑暗，130 ME米-2小号-1 ，75％湿度）36 - 72小时，直到随后在适当的时间点取样。
横切杆用无菌解剖刀只是子叶EMERG下面ENCE位点（图3C）。
使用两个手指，轻轻挤压的下部番茄茎以允许木质部汁液出现，然后收集2.5微升木质部汁液用一个2.5 -微升移液管（见注5）（图3D）。

图 3. 木质部汁液的茎注射和取样。A. 4周龄的番茄植株的Jiffy锅小号。B.使用10 -微升微量，注入5μl的细菌悬浮液入的4周龄的番茄植物的茎小号。C.断面的番茄干小号用无菌手术刀就在子叶下方EMERG ENCE网站。D.使用微量移液器在切割部位收集 2.5 μl 木质部汁液。

细菌孔定量Ť通货膨胀
将木质部汁液溶解在无菌 1.5 - ml 微量离心管中的 1 ml 无菌水中（图 4A）。
稀和传播细菌（50微升）ø N使用标准方法披培养基平板，先前所描述的（Yu和马霍，2021）。扩展可以使用无菌涂布器，手动执行塑料珠，或1.5的底部- ml离心管，或使用旋转接种仪（于和马霍，2021）。
孵育所述板直立在28°C 2 天。计数的菌落并处理的数据（图4B）（见注6）。

图4.连续稀释和细菌传播的制备ING 。A.溶解含有木质部汁液青枯在1ml无菌水中在无菌1.5 - ml离心管; 将悬浮液稀释 10 至 10 4倍。B.扩散的稀释细菌升悬浮液（我们试图传播10 -1或10 -3 ）ö使用标准程序Ñ披培养基平板，如先前所描述（于和马霍，2021）。孵育的在直立板28 ℃，2天，并计数的菌落直径：Ñ固体披培养基平板。B 中的照片显示了使用螺旋平板进行平板接种后的常见菌落模式（Yu 和 Macho，2021 年）。

数据分析

使用菌落数ø n各自可读板，计算在采样木质部汁液细菌数。如果电镀是手动进行的，请应用以下公式：
青枯菌在木质部汁液中的数量（CFU/ml）=菌落数×20×10 3 ×10 （稀释因子）/2.5
注：“菌落数”：可读板上的菌落数。“20”对应于将1000 μl 最终稀释的细菌在 50 μl 细菌溶液涂在板上的结果。“10 3 ”对应于CFU/ μl到CFU/ml的转换。“2.5”对应于2.5微升木质部汁液作为一个样品，并溶于1ml水中。“10 （稀释因子）”对应于木质部汁液的额外系列稀释。
如果使用螺旋电镀机进行电镀，请按照前面描述的额外计算（Yu 和 Macho，2021 年）。
重复实验至少 3 次。将最终数据输入到 Graph P ad Prism 7 或类似程序进行统计分析。要单独比较结果，执行一个学生的牛逼-测试和报告的平均值，SEM和p值来表示的差异有统计学意义。使用对数刻度和单个数据点以及平均值± SE M可以更好地显示结果（图 5）。

图5. ř的epresentation的生长青枯雷尔氏菌GMI1000野生型，突变体在番茄茎，和补偿菌株小号。不同的颜色代表不同的菌株，水平条代表平均值（每个菌株n = 6 株植物）。数据被表示为在平均值± SE中号。星号表示显着差异（*** P < 0.0001，t检验）。ģ拍摄和使用格拉夫绘制P广告棱镜7。

食谱

Phi 介质
10 克 Bacto 蛋白胨
1 克酵母提取物
1 克酪蛋白氨基酸
加水达到1大号。到prepar ë固体培养基，琼脂添加15克至1种大号介质和高压釜
1％（W / V）TTC搜索解决方案Ñ
将TTC溶解在蒸馏水中
注意：将1% TTC 溶液储存在室温或 4°C 的黑暗环境中。
20% (W/V) 葡萄糖溶液
葡萄糖应溶解在蒸馏水中并高压灭菌。STO再在4℃下。
注：加1％TTC和20％克lucose当prepar ING固体披介质板小号诱导粉红青枯结肠IES 。
笔记

如果该自来水具有一个高矿物质含量或包含过多的杂质，也可以使用纯净水。
生长不超过24番茄植物中的每个托盘（29 × 20cm）中，并分离的植物，以避免单个植物中缠结根。通常每两天给植物浇一次水，并保持花盆湿润。
对于连续稀释，使用一个1 ：10稀释度的每一个步骤。
可选地，移动的番茄植株的生长室（28℃，12小时光照/ 12小时黑暗，130 ME米-2小号-1 ，75％湿度）12小时前青枯菌注射以减少所造成的改变干扰接种后的生长室。在我们的条件下，这并没有什么不同。
番茄取样时，用无菌纸轻轻取出渗出的汁液，用手指夹住茎顶部，将木质部汁液推出取样。
垃圾处理：一utoclave都在这个实验中使用dispos前的材料人到避免释放青枯菌在环境。实验后用 75% 酒精清洁工作台和流罩。

致谢

除了Macho 实验室的所有成员不断改进本协议和有益的讨论外，我们还感谢 Xinyu Jian 在这项工作中提供的技术和行政协助。Macho实验室的工作得到了中国科学院战略重点研究计划（XDB27040204）、中国千人计划和上海植物胁迫生物学中心（中国科学院）的支持。

利益争夺

作者没有要声明的竞争利益。

参考

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