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本实验方案简略版
May 2020
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本文章节


 

Preparation and Characterization of Internally Modified DNA Templates for Chemical Transcription Roadblocking
用于化学转录障碍的内部修饰 DNA 模板的制备和特征分析    

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Abstract

Site-specific transcription arrest is the basis of emerging technologies that assess nascent RNA structure and function. Cotranscriptionally folded RNA can be displayed from an arrested RNA polymerase (RNAP) for biochemical manipulations by halting transcription elongation at a defined DNA template position. Most transcription “roadblocking” approaches halt transcription elongation using a protein blockade that is non-covalently attached to the template DNA. I previously developed a strategy for halting Escherichia coli RNAP at a chemical lesion, which expands the repertoire of transcription roadblocking technologies and enables sophisticated manipulations of the arrested elongation complexes. To facilitate this chemical transcription roadblocking approach, I developed a sequence-independent method for preparing internally modified dsDNA using PCR and translesion synthesis. Here, I present a detailed protocol for the preparation and characterization of internally modified dsDNA templates for chemical transcription roadblocking experiments.


Graphic abstract:


Precise transcription roadblocking using functionalized DNA lesions


Keywords: Transcription (转录), RNA (核糖核酸), DNA lesion (DNA病变), PCR (聚合酶链反应), Translesion synthesis (跨损伤合成), Cotranscriptional RNA folding (RNA共转录折叠)

Background

RNA begins to fold as it emerges from an RNA polymerase (RNAP) during transcription (Pan and Sosnick, 2006). Our ability to investigate the biological roles of nascent RNA structure and function therefore depends on the development of tools that can assess RNA cotranscriptionally. One successful approach towards this goal has been to leverage the extraordinary stability of the ternary RNAP-DNA template-nascent RNA complex to measure and manipulate nascent RNA in the context of arrested transcription elongation complexes (TECs) (Buenrostro et al., 2014; Tome et al., 2014; Watters et al., 2016; Strobel et al., 2017; Widom et al., 2018).


Multi-subunit RNAPs are remarkably processive enzymes that are capable of transcribing multi-kilobase operons in bacteria and tens of kilobases to megabases in eukaryotic genes (Core et al., 2008; Belogurov and Artsimovitch, 2019). The molecular forces that enable processive transcription elongation (Korzheva et al., 2000; Vassylyev et al., 2007a and 2007b) also render TECs notoriously resistant to dissociation in general. For example, when RNAP encounters a roadblock, such as a DNA-bound protein or a chemical DNA lesion, the TEC typically remains intact until either the roadblock is removed or a termination factor evicts RNAP from the DNA (Selby and Sancar, 1993 and 1994). When constructed in vitro by halting RNAP at a transcription roadblock, arrested TECs persist for exceptionally long periods of time. RNAP arrest by transcription roadblocking has consequently become the method of choice for structural and functional studies that require the display of nascent RNA molecules.


The development of high-throughput methods that use arrested RNAPs to display RNA underscores the need for versatile transcription roadblocking tools. Several roadblocking strategies that halt transcription elongation by colliding RNAP with a DNA-bound protein blockade have been developed: Sequence-specific protein roadblocks, such as the catalytically inactive EcoRIE111Q mutant (Pavco and Steege, 1990) and the E. coli DNA replication terminator Tus (Tome et al., 2014), are attached to a DNA template by their respective recognition sequences. Streptavidin can be stably attached to template DNA using precisely (Frieda and Block, 2012) or randomly positioned (Strobel et al., 2017) biotin modifications. dCas9 can be reversibly loaded onto arbitrary DNA sequences to halt RNAP sequentially at multiple DNA positions (Widom et al., 2019). In contrast to the abundance of approaches for protein-mediated transcription roadblocking, methods for halting RNAP at DNA lesions have been conspicuously lacking despite the long-established fact that DNA damage causes transcription arrest. I previously addressed this technological gap by developing a sequence-independent method for preparing internally modified linear dsDNA using translesion synthesis and characterizing the transcription roadblocking properties of several DNA modifications (Strobel et al., 2020).


My chemical transcription roadblocking method complements the properties of protein-mediated roadblocking strategies in several ways. First, like biotin-streptavidin roadblocking, chemical transcription roadblocking is sequence-independent and therefore compatible with the preparation of complex sequence libraries. Second, chemical stall sites are fully functional in a minimal in vitro transcription reaction and are therefore compatible with diverse experimental conditions. Third, functionalized chemical stall sites can enable TEC manipulations that are not otherwise possible. For example, I previously showed that TECs that are arrested at a desthiobiotin stall site can be enriched by exclusion from streptavidin-coated magnetic particles. The primary disadvantage of chemical transcription roadblocking is that E. coli RNAP can bypass some DNA lesions over time. Nonetheless, in many cases, lesion bypass is extremely slow and will therefore not be prohibitive for most experiments: in the transcription reactions described below, TECs remain at a desthiobiotin-TEG stall site with a half-life of ~600 min, whereas unimpeded bacterial transcription occurs at 50-100 nt/s. Furthermore, these arrested TECs can persist stably for hours following nucleotide depletion (Strobel et al., 2020).


Here, I provide a detailed protocol for the preparation and characterization of internally modified linear dsDNA templates for chemical transcription roadblocking. I first describe considerations that must be taken into account during oligonucleotide design and provide a set of validated sequences for PCR amplification. I then present a straightforward protocol for the preparation of internally modified DNA using PCR and translesion synthesis and describe how to assess DNA template quality using denaturing and native polyacrylamide gel electrophoresis. Lastly, I present a single-round in vitro transcription protocol that can be used to verify the transcription roadblocking activity of the DNA template. Together, these protocols will enable any researcher with basic molecular biology expertise to successfully design and prepare internally modified DNA templates for the display of nascent RNA from arrested TECs.

Materials and Reagents

  1. Consumables

    1. Low retention 10 μl pipette tips (e.g., Neptune Scientific, catalog number: 2342S3.S)

    2. Low retention 200 μl pipette tips (e.g., Neptune Scientific, catalog number: 2102.S)

    3. Low retention 1,000 μl pipette tips (e.g., Neptune Scientific, catalog number: 2372.S)

    4. 200 μl, 0.4 mm flat gel loading pipette tips (e.g., Laboratory Product Sales, catalog number: L113761)

    5. Nuclease-Free 1.7 ml Microcentrifuge Tubes (e.g., Thomas Scientific, catalog number: 1149K01)

    6. Nuclease-Free 2.0 ml Microcentrifuge Tubes (e.g., VWR, catalog number: 20170-170)

    7. 2.0 ml Screw-Cap Tubes, w/ O-ring (e.g., Laboratory Product Sales, catalog number: L233226)

    8. 0.2 ml 8-Strip PCR tube w/ dome cap (e.g., Laboratory Product Sales, catalog number: L216380)

    9. QubitTM Assay Tubes (InvitrogenTM, catalog number: Q32856)

    10. 15 ml Conical Tubes (e.g., Laboratory Product Sales, catalog number: TR2000)

    11. 20 ml Conical Tubes (e.g., Laboratory Product Sales, catalog number: TR2003)

    12. 5 ml serological pipette (e.g., Laboratory Product Sales, catalog number: L310500)

    13. 10 ml serological pipette (e.g., Laboratory Product Sales, catalog number: L311000)

    14. 25 ml serological pipette (e.g., Laboratory Product Sales, catalog number: L312510)

    15. Weigh boats (any source)

    16. 10 ml Syringe (e.g., BD, catalog number: 302995)

    17. 60 ml Syringe (e.g., BD, catalog number: 309653)

    18. 20G 1½” Needle (e.g., BD, catalog number: 305176)

    19. 0.2 μm Polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile (e.g., VWR catalog number: 28145-501)

    20. 150 mm Culture Dish (e.g., Corning® catalog number: 430599)

    21. Small 1-Ply Light-Duty Tissue Wipers (e.g., VWR, catalog number: 82003-820)

    22. Large 1-Ply Light-Duty Tissue Wipers (e.g., VWR, catalog number: 82003-822)

    23. Plastic-backed bench paper (e.g., Fisher Scientific, catalog number: 14-127-47)

    24. Nitrile Gloves

    25. Vaseline® Petroleum Jelly Original

    26. Rain-X® Original Glass Water Repellent

    27. Large binder clips (e.g., Staples 2” Binder Clips, Staples, catalog number: 10669)

    28. AEP 30510400 ZipSafe Sealwrap, 18” × 2000’ (Amazon)

    29. Razor blades

    30. Aluminum foil

    31. Dish soap

    32. Plastic brush for cleaning sequencing gel plates


  2. Reagents

    Note: Chemicals should be Molecular Biology/Biotechnology Grade.

    1. Nuclease-Free Water (e.g., InvitrogenTM, catalog number: 10977015), store at room temperature (RT)

    2. Milli-Q Water, store at RT

    3. Deionized Water, store at RT

    4. Diethyl pyrocarbonate (DEPC), >97%, (Thermo ScientificTM, AAJ14710AC), store at -20°C

      Note: Handle DEPC in a chemical fume hood.

    5. Tris (1 M), pH 8.0, RNase-free (InvitrogenTM, catalog number: AM9855G), store at RT

    6. EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free (InvitrogenTM, catalog number: AM9260G), store at RT

    7. Potassium Chloride (KCl) (2 M), RNase-free (InvitrogenTM, catalog number: AM9640G), store at RT

    8. Magnesium Chloride (MgCl2), 1 M, RNase-free (InvitrogenTM, catalog number: AM9530G), store at RT

    9. Sodium Acetate (NaOAc) (3 M), pH 5.5 RNase-free (InvitrogenTM, catalog number: AM9740), store at RT

    10. 1× Tris-EDTA (TE) Solution (10 mM Tris pH 7.5, 0.1 mM EDTA), (e.g., Integrated DNA Technologies, catalog number: 11-05-01-05), store at RT

    11. Tris Base (e.g., VWR, catalog number: 97061-794), store at RT

    12. EDTA, Disodium Salt, Dihydrate (e.g., InvitrogenTM, catalog number: 15576028), store at RT

    13. Hydrochloric Acid (HCl) (e.g., Sigma-Aldrich, catalog number: 320331), store at RT with other acids beneath a fume hood.

      Caution: Hydrochloric acid is highly corrosive and must be handled in a chemical fume hood.

    14. Sodium hydroxide (NaOH) (e.g., Sigma-Aldrich, catalog number: S8045), store at RT with other bases

      Caution: Sodium hydroxide is highly corrosive.

    15. Boric Acid (e.g., Fisher Scientific, catalog number: BP168-500), store at RT

    16. Sodium dodecyl sulfate sodium salt (SDS) (e.g., Millipore, catalog number: 7910-500GM), store at RT

    17. Dithiothreitol (DTT) (e.g., Gold Biotechnology, catalog number: DTT100), store desiccated at -20°C

    18. 100% Ethanol (200 Proof) (e.g., Decon Labs, catalog number: 2716), store at RT

    19. Isopropanol (e.g., Sigma-Aldrich, catalog number: I9516-4L), store at RT

    20. Glycerol (e.g., Sigma-Aldrich, catalog number: G5516-4L), store at RT

    21. Phenol:Chloroform + Tris Buffer (e.g., Thermo ScientificTM, catalog number: 17909), store at 4°C

      Caution: Phenol:chloroform should be handled in a chemical fume hood.

    22. OmniPur Formamide, Deionized (e.g., Millipore, catalog number: 4650-500ML), store at 4 °C

      Caution: Formamide should be handled in a chemical fume hood.

    23. Dimethyl sulfoxide (DMSO) (e.g., Fisher Scientific, catalog number: D128-500), store at RT

      Caution: Dimethyl sulfoxide should be handled in a chemical fume hood.

    24. Ammonium persulfate (APS) (e.g., Sigma-Aldrich, catalog number: A3678-100G), store at RT

    25. TEMED (Tetramethylethylenediamine) (e.g., Bio-Rad, catalog number: 1610801), store at RT

    26. Bromophenol blue (e.g., Bio-Rad, catalog number: 1610404), store at RT

    27. Xylene cyanole FF (e.g., Bio-Rad, catalog number: 1610423), store at RT

    28. Ethidium bromide, 10 mg/ml (e.g., InvitrogenTM, catalog number: 15585011), store at RT

      Note: Handle ethidium bromide in accordance with institutional guidelines.

    29. Quick-Load® Purple 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs, catalog number: N0551L), store at RT

    30. Low Range ssRNA Ladder (New England BioLabs, catalog number: N0364S), store at RT

    31. SYBR Gold Nucleic Acid Stain (InvitrogenTM, catalog number: S11494), store at -20°C

    32. Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (New England Biolabs, catalog number: N0447L), store at -20°C

    33. dNTP Set (100 mM) (InvitrogenTM, catalog number: 10297018), store at -20°C

    34. 2-Amino-dATP (TriLink Biotechnologies, catalog number: N-2003), store at -20°C

    35. 5-Propynyl-dCTP (TriLink Biotechnologies, catalog number: N-2016), store at -20°C

    36. High Purity rNTP Set, 100 mM Solutions (ATP, CTP, GTP, UTP) (Cytiva Life Sciences, catalog number: 27202501), store at -20°C

    37. UltraPureTM BSA (InvitrogenTM, catalog number: AM2616), store at -20°C

    38. Rifampicin (Gold Biotechnology, catalog number: R-120-10), store dessicated at -20°C

    39. GlycoBlueTM Coprecipitant (InvitrogenTM, catalog number: AM9516), store at -20°C

    40. QubitTM dsDNA HS Assay Kit (InvitrogenTM, catalog number: Q32854), some components stored at 4°C

    41. QubitTM dsDNA BR Assay Kit (InvitrogenTM, catalog number: Q32853), some components stored at 4°C

    42. SeaKem GTGTM Agarose (Lonza, catalog number: 50074), store at RT

      Critical: Agarose must be preparatory grade.

    43. UreaGel 19:1 Denaturing Gel System (National Diagnostics, catalog number: EC-833), store at RT

      Caution: Contains acrylamide. Acrylamide is a neurotoxin and should be handled cautiously.

    44. ProtoGel (30%) (National Diagnostics, catalog number: EC-890), store at RT

      Caution: Contains acrylamide. Acrylamide is a neurotoxin and should be handled cautiously.

    45. QIAquick PCR purification kit (Qiagen, catalog number: 28106), store at RT

    46. QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, catalog number: 28706), store at RT

    47. Internally modified oligonucleotides (Integrated DNA Technologies, see Table 1)

    48. UTP, [α-32P]-3000 Ci/mmol 10 mCi/ml (PerkinElmer, catalog number: BLU007H), store at -20°C

      Note: [α-32P]-UTP must be handled in accordance with institutional radiation safety protocols.


  3. Enzymes

    1. Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, catalog number: M0491L), store at -20°C

    2. Vent® (exo-) DNA Polymerase (New England Biolabs, catalog number: M0257L), store at -20°C

    3. Sulfolobus DNA Polymerase IV (New England Biolabs, catalog number: M0327S), store at -20°C

    4. Thermolabile exonuclease I (New England Biolabs, catalog number: M0568L), store at -20°C

    5. E. coli RNA Polymerase Holoenzyme (New England Biolabs, catalog number: M0551S), store at -20°C

      Note: E. coli RNA polymerase core and 70 can be purified by well-established protocols (Marr and Roberts, 1997; Svetlov and Artsimovitch, 2015) and used to reconstitute the holoenzyme.


  4. Prepared Solutions (see Recipes section)

    1. DEPC-Treated Milli-Q Water

    2. 10 mM Tris-HCl, pH 8.0

    3. 10 mM Thermostability-enhancing dNTP Solution

    4. 1× Tris-Borate-EDTA Buffer

    5. 70% Ethanol

    6. 10% SDS

    7. 6× DNA Loading Dye (+SDS, XC only)

    8. 10% APS

    9. 1× Formamide Loading Dye

    10. 3× Tris-Borate-EDTA Buffer

    11. 6× DNA Loading Dye (non-denaturing)

    12. 1 M DTT

    13. 100 mM DTT

    14. 10× Transcription Buffer

    15. 20× NTP Solution

    16. 5 mg/ml BSA

    17. 2 mg/ml Rifampicin

    18. 1 M Tris-HCl, pH 8.0

    19. 0.5 M EDTA, pH 8.5

    20. Stop Solution

Equipment

  1. Autoclave

  2. Fume Hood

  3. -20°C and -80°C freezers (any source)

  4. Refrigerator (4°C) (any source)

  5. 2 μl, 20 μl, 200 μl, and 1,000 μl micropipettes (any source)

  6. Pipette Controller (e.g., Drummond, catalog number: 4-000-101)

  7. Plastic tube racks for 1.7 ml, 15 ml, and 50 ml tubes (any source)

  8. Lab Timer (e.g., Traceable®, catalog number: 5004CC)

  9. Ice bucket (e.g., SCIENCEWARE®, catalog number: M16807-4002)

  10. Erlenmeyer flasks (500 ml, 4 L) (any source)

  11. Beakers (1 L, 2 L) (any source)

  12. Autoclavable media bottles (500 ml, 1 L, and 2 L) (any source)

  13. Graduated cylinders (10 ml, 50 ml, 200 ml, 0.5 L, 1 L, and 2 L) (any source)

  14. Plastic 250 ml beaker (any source)

  15. 4 L polypropylene bottle (any source)

  16. 20 L carboy (any source)

  17. Microwave (any source)

  18. Vortex (e.g., Scientific Industries, catalog number: SI-0236)

  19. Thermal cycler (e.g., Bio-Rad S1000 w/ 96-Deep Well Reaction Module, catalog number: 1852197)

    Critical: 100 μl PCRs require a deep well thermal cycler. If 100 μl exceeds the maximum sample volume of your thermal cycler, aliquot the reaction into additional PCR tubes.

  20. Refrigerated microcentrifuge (e.g., Eppendorf 5424 R, catalog number: 5406000046)

  21. Mini centrifuge (e.g., VWR, catalog number: 76269-064)

  22. Digital Dry Bath (e.g., Thermo ScientificTM, catalog number: 88870001)

  23. Lab ArmorTM Beads (GibcoTM, catalog number: A1254301)

  24. Aluminum block for 1.7 ml tubes (e.g., Thermo ScientificTM, catalog number: 88880130)

  25. Aluminum heating/block, holds 96 × 0.2 ml tubes (Sigma-Aldrich, catalog number: Z740270-1EA)

  26. Analog thermometer (e.g., VWR, catalog number: 89095-600)

  27. Digital thermometer (e.g., VWR, catalog number: 89094-750)

  28. QubitTM 4 Fluorometer (InvitrogenTM, catalog number: Q33238)

  29. Rocking platform (e.g., Corning, catalog number: 6703)

  30. Rotator (e.g., ATR, Rotamix Rotator RKVSD and end-over end rod, catalog numbers: 10101 and 10110)

  31. pH meter (e.g., Mettler Toledo, S220-Bio, catalog number: 30019031)

    Critical: The pH meter electrode must be compatible with Tris solutions.

  32. Balance (e.g., Ohaus, catalog number: 30253007RM)

  33. Analytical balance (e.g., Mettler Toledo, catalog number: 30029076)

  34. Flat Spatula (e.g., VWR, catalog number: 82027-532)

  35. Weighing Spatulas (any source)

  36. Stir Plate (e.g., Corning PC-610D, catalog number: 6795620D)

  37. Magnetic stir bars (e.g., VWR, catalog number: 58948-025)

  38. Horizontal Gel Apparatus (e.g., Horizon 11-14 Midi Gel System, Gel Company, HZ1114)

    Note: Comb should hold at least 50 μl.

  39. Mini-PROTEAN Tetra Cell, 2-gel, for 1.0 mm handcast gels (Bio-Rad, catalog number: 1658003FC)

  40. Sequencing Gel Apparatus (e.g., BRL Model S2; Gel Company, catalog number: S2-3040)

    Note: Spacers and comb should be 0.4 mm thickness.

  41. Basic power supply (e.g., Bio-Rad, catalog number: 1645050)

  42. High voltage power supply (e.g., Bio-Rad, catalog number: 1645056)

  43. UV Transilluminator (e.g., UVP catalog number: UV95045901)

    Caution: Never expose eyes or skin to UV radiation.

  44. Dark Reader Blue light Transilluminator (Clare Chemical, catalog number: DR89X)

  45. Cardboard exposure cassette (e.g., Sigma-Aldrich, catalog number: E-9135, discontinued)

  46. Storage Phosphor Screen, 35 × 43 cm (Cytiva Life Sciences, catalog number: 28956476)

  47. Storage Phosphor Screen Image Eraser (Cytiva Life Sciences, catalog number: 29187190)

  48. Typhoon Biomolecular RGB Biomolecular Imager (Cytiva Life Sciences, catalog number: 29187194)

  49. Acrylic shielding for high-energy beta radiation

    Note: I have found the items below useful when performing experiments with 32P.

    1. Vertical Bench-Top Beta Shield, 3/8” Thick (e.g., RPI, catalog number: BR-201)

    2. 24-place Beta Block (e.g., Laboratory Product Sales, catalog number: 172644)

    3. Sample Beta Box w/ ice compartment (e.g., Fisher Scientific, catalog number: S29137)

    4. Acrylic Waste Box (e.g., ThermoScienticTM, catalog number: 67459024)

    5. Large Vertical Acrylic Shield (Denville Scientific, catalog number S0260-S)

    6. Medium Vertical Acrylic Shield (Denville Scientific, catalog number S0180-S)

    7. Large Acrylic Storage Container (e.g., Mitchell Plastics, catalog number: RP-400)

    8. Small Acrylic Storage Container (e.g., IBI Scientific, catalog number: RB-100)

    9. Pipette tip disposal box (Thomas Scientific, catalog number: 1216J05)

Procedure

  1. Overview of the procedure

    My procedure for preparing internally modified linear dsDNA comprises three primary steps (Figure 1): First, an internal modification is introduced into the DNA template by PCR amplification (Procedure C). PCR amplification yields a truncated DNA product because DNA modifications that halt transcription elongation are also likely to halt elongation by the DNA polymerases that are typically used for PCR. Next, the remainder of the truncated DNA strand is synthesized using the translesion polymerase Sulfolobus DNA Polymerase IV (Procedure D). Finally, the completed dsDNA product is purified to remove excess oligonucleotides and the template DNA that was used for PCR amplification (Procedure E or Procedure F). The purified DNA is then subjected to three quality control steps to verify the efficiency of translesion synthesis (Procedure G), the purity of the dsDNA (Procedure H), and the activity of the internal modification as a transcription roadblock (Procedure I). The resulting internally modified linear dsDNA is then ready to be used to cotranscriptionally display nascent RNA from arrested TECs.



    Figure 1. Overview of the procedure for enzymatically preparing internally modified dsDNA. PCR with an internally modified primer yields a DNA product with one truncated strand. The truncated strand is then completed using translesion DNA synthesis with Sulfolobus DNA Polymerase IV, which bypasses the internal modification site, and Vent® (exo-). The resulting internally modified dsDNA is then purified and assessed for quality prior to use as a DNA template for in vitro transcription experiments.


  2. Priming site and oligonucleotide sequences

    Successful DNA template preparation depends on the careful design of PCR priming sites. My standard protocol uses two constant DNA regions that have been validated for efficient amplification without detectable side products (Table 1).


    Table 1. Priming sites and primers used to prepare linear DNA templates. The region of each oligonucleotide that anneals to its corresponding adapter is underlined. ‘/iMod/’ indicates the position of an internal DNA modification. Validated modifications include desthiobiotin-TEG, biotin-TEG, etheno-dA, and UniLinkTM Amino-Modifier (Figure 2).

    1The PRA1 promoter (Strobel, 2021) is a derivative of the λPR and T7A1 promoters and can be substituted in place of λPR by using the PRA1.F primer instead of LPR.F.

    Critical: Order the LPR.F, PRA1.F, dRP1iMod.R, and dRP1.R primers at 100 nmol or greater scale with HPLC purification. Oligonucleotides can be from any source. I use Integrated DNA Technologies.


    1. Design PCR primer sequences.

      I recommend using the sequences described in Table 1, which have been extensively validated for use in the procedures below. If your application requires different sequences, use oligonucleotide design tools such as Integrated DNA Technologies OligoAnalyzerTM to verify that your sequences do not contain significant secondary structure and are unlikely to yield primer dimers due to stable homo- or heterodimers. Ideally, primers should be less than 60 nts in length, and the internally modified oligo should have ~30 nts between the modification and the 5’ end to ensure duplex stability downstream of the modification site in the final dsDNA product. The region of each primer that anneals to the PCR adapters should have a GC content of ~50%. Tm will vary with the polymerase used; when using Q5® DNA polymerase I aim to anneal primers at 65°C. The New England Biolabs Tm Calculator is useful for assessing annealing temperatures when using NEB polymerases.

        Priming sites can be added to the PCR template DNA in several ways depending on the intended application. First, if the PCR template will be plasmid DNA, priming sites can be included in the DNA sequence during cloning. Similarly, if the PCR template will be a synthetic oligonucleotide, the priming sites (which together total 52 nts) can be introduced during oligonucleotide synthesis. It is also possible to append priming sites to DNA or RNA of cellular origin by modifying existing protocols for the preparation of genomic or transcriptomic sequence libraries. However, these applications are beyond the scope of this protocol and their implementation will require application-specific expertise.


    2. Select an internal modification. I have validated four internal DNA modifications for use with this protocol (Figure 2) and describe their properties below.



      Figure 2. Validated internal DNA modifications. Validated DNA modifications include (A) desthiobiotin-TEG, (B) etheno-dA, and (C) UniLinkTM Amino-Modifier. Biotin-TEG has also been validated for use in the protocols below (Strobel, 2021).


      1. Desthiobiotin-TEG/Biotin-TEG: Desthiobiotin (Figure 2A) is biotin analog that can be eluted from streptavidin by the addition of free biotin. Sulfolobus DNA Polymerase IV primarily bypasses desthiobiotin-TEG without incorporating a nucleotide opposite the modification site. Desthiobiotin-TEG is a potent transcription roadblock: ~100% of TECs stall 1 nt upstream of the modification site, and ~87% of TECs remain at the stall site after 32 min in the presence of 500 μM NTPs (Strobel et al., 2020). When stalled at a desthiobiotin-TEG roadblock, RNAP blocks desthiobiotin from binding streptavidin, thereby enabling the enrichment of TECs based on their position along the DNA template. I have also performed the protocols below using an internal biotin-TEG modification (Strobel, 2021).

      2. Etheno-dA: Etheno-dA (Figure 2B) is an adenosine analog in which an etheno bridge between N1 and N6 of adenine prevents hydrogen bonding. Sulfolobus DNA Polymerase IV tends to incorporate a dA nucleotide opposite the modification site when bypassing the etheno-dA modification. Pupov et al. (2019) showed that etheno-dA is a potent transcription blockade using a TEC scaffold system. My analysis of etheno-dA-modified DNA templates agreed with the findings of Pupov et al. (2019): ~100% of TECs stall 1 nt upstream of the modification site, and ~84% of TECs remain at the stall site after 32 min in the presence of 500 μM NTPs (Strobel et al., 2020). Etheno-dA is useful as a functionally inert chemical transcription roadblock.

      3. Uni-LinkTM Amino-Modifier: The Uni-LinkTM Amino-Modifier (Figure 2C) comprises a primary amine attached to a six-carbon spacer and is designed to preserve natural nucleotide spacing in the phosphodiester backbone. Sulfolobus DNA Polymerase IV incorporates a dA nucleotide opposite the modification site ~50% of the time when bypassing the Uni-LinkTM Amino-Modifier. In comparison to desthiobiotin-TEG and etheno-dA, the Uni-LinkTM Amino-Modifier is a weak transcription roadblock: although ~100% of TECs initially stall at the modification site, RNAP can bypass the stall site efficiently so that only ~40% of TECs remain at the stall site after 32 min in the presence of 500 μM NTPs (Strobel et al., 2020). Nonetheless, the free amino group may be useful for functionalizing the DNA template in some experiments.

    3. Upon receipt of the oligonucleotides described above, dissolve the lyophilized oligonucleotide and prepare working stocks:

      1. Centrifuge the oligonucleotide tubes in a mini centrifuge for several seconds to ensure that the lyophilized oligonucleotide is at the bottom of the tube.

      2. Add 1× TE, pH 7.5, to dissolve the oligonucleotide to a concentration of 100 μM.

        Note: The oligonucleotides used in this protocol are critical and costly reagents. For this reason, I recommend using commercial nuclease-free TE to resuspend primary oligonucleotide stocks so that storage and handling is standardized.

      3. Shake thoroughly and spin down the dissolved oligonucleotide in a mini centrifuge.

      4. Prepare a 10 μM working primer stock by combining 180 μl of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 with 20 μl of 100 μM oligonucleotide stock in a 2 ml screw-cap tube with an O-ring. Vortex and spin down the working primer stock in a mini centrifuge.

        Critical: Store working primer stocks in a screw cap tube with an O-ring to reduce the possibility of cross-contamination.

      5. Store both the 100 μM and 10 μM primer stocks at -20°C.

        Critical: When thawing primer stocks, mix the oligonucleotide solution and then spin the tube in a mini centrifuge so that no liquid remains at the cap.


  3. PCR amplification

    The internal DNA modification is incorporated by PCR using the modified primer dRP1iMod.R (Table 1) to yield a dsDNA with a 5’ overhang downstream of the DNA modification site (Figure 1).

    Note: An unmodified version of the template can be prepared in a separate 500 μl PCR by substituting dRP1iMod.R with the unmodified dRP1.R primer. The unmodified template can be prepared in parallel with the internally modified template using the same procedures except that Procedure D: Translesion DNA Synthesis is omitted. The unmodified DNA template is a useful control for the QC analyses described in Procedures G, H, and I.

    Note: My laboratory typically uses Q5® or Q5U® DNA polymerase for PCR. Other polymerases can be substituted if desired. See Note 2 for additional information.


    1. Prepare 620 μl of Q5® PCR master mix (Table 2) in a 1.7 ml microcentrifuge tube on ice. Add each reagent in the order listed in Table 2 and mix as follows:

      Note: When the DNA template will be purified using Procedure F, the PCR can be scaled down if desired because sample recovery is efficient. The smallest scale preparation my laboratory typically performs uses 200 μl of the initial Q5 PCR.

      1. After adding Q5® Reaction Buffer, vortex and spin down the master mix in a mini centrifuge.

      2. After adding every reagent except Q5® DNAP, vortex and spin down the master mix again.

      3. Add Q5® DNA polymerase and gently mix the completed master mix by pipetting.


        Table 2. Reaction master mix for Q5® PCR. The Q5® PCR master mix is based on the New England Biolabs protocol for PCR Using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase.

        Reagent Stock Conc. Final Conc. 100 μl Rxn. 6.2 Rxn. Vols.
        Nuclease-Free Water - - 71.0 440.2 μl
        Q5® Reaction Buffer 20.0 μl 124.0 μl
        dNTP Solution1 10 mM 0.200 mM 2.0 μl 12.4 μl
        LPR.F 10 μM 0.250 μM 2.5 μl 15.5 μl
        dRP1iMod.R 10 μM 0.250 μM 2.5 μl 15.5 μl
        Template DNA2 - - 1.0 μl 6.2 μl
        Q5® DNAP 2 U/μl 0.020 U/μl 1.0 μl 6.2 μl
        Total Volume 100.0 μl 620.0 μl

      1Standard dNTP solution containing dATP, dGTP, dTTP, and dCTP at 10 mM each.

      2The DNA template used for PCR can vary by application. Adjust the volume added accordingly.


    2. Aliquot 100 μl reaction volumes into six thin-walled 200 μl PCR tubes.

      Critical: If the thermal cycler does not accommodate 100 μl reactions, use a smaller aliquot.

    3. Start the thermal cycling protocol shown in Table 3. Place the reactions on the thermal cycler block once the thermal cycler lid is fully heated.


      Table 3. Thermal cycling protocol for PCR amplification. Thermal cycling protocol for the PCR described in Table 2. Always perform the PCR using a heated lid set to 105°C. Adjust the annealing temperature if primers other than those described above or a DNA polymerase other than Q5® High-Fidelity DNA polymerase are used. Adjust the extension time to account for the length of the DNA template. The final hold is at 10°C to reduce energy consumption and extend thermal cycler life.

      Step Temperature Time
      Initial Denaturation 98°C 30 s
      30 Cycles Denature 98°C 10 s
      Anneal1 65°C 20 s
      Extend 72°C 30 s/kb
      Final Extension 72°C 5 min
      Final Hold 10°C Forever

      1Adjust the annealing temperature as needed. I recommend using the NEB Tm Calculator to determine annealing temperature.



    4. After thermal cycling is complete, place the reactions on ice.

    5. Quantify PCR yield using a QubitTM dsDNA HS assay (Table 4) to ensure that the PCR yielded sufficient DNA for the downstream processing steps. Multiply the sample concentration by 500 (five reaction volumes, representing the five reactions used for translesion synthesis) to estimate the total PCR yield. Yield can vary depending on DNA template length and composition; for reference, a 121 bp DNA template that was used when validating this protocol typically measured ~10 ng/μl by Qubit for an estimated total of ~5 μg of input DNA for the subsequent steps. This is likely an underestimate of DNA quantity because the initial PCR product contains a 5’ ssDNA overhang that is not detected efficiently in the QubitTM dsDNA HS assay.


      Table 4. Protocol for QubitTM dsDNA assays. The protocol for QubitTM dsDNA HS and BR assays is presented here for convenience. The protocol is written in general terms to include both assays. Please refer to the QubitTM 4 Fluorometer, QubitTM dsDNA HS Assay Kit, and QubitTM dsDNA BR Assay Kit User Guides for more information.

      Step Action
      1 Gather one 2.0 ml microcentrifuge tube and a QubitTM assay tube for each sample plus two assay tubes for the QubitTM standards.
      2 Dilute the QubitTM dsDNA Reagent 1:200 in QubitTM dsDNA Buffer in the 2.0 ml tube. Prepare enough QubitTM working solution to accommodate both standards and each sample, e.g., for two standards and one sample, prepare four volumes of QubitTM working solution. Vortex thoroughly and spin down in a mini centrifuge.
      3 Aliquot 190 μl of QubitTM working solution per tube to each standard assay tube. Aliquot 199 μl of QubitTM working solution to each sample assay tube.
      41 Add 10 μl of QubitTM Standards #1 and #2 to the respective assay tubes.
      5 Add 1 μl of sample to the respective assay tubes.
      6 Vortex the assay tubes and incubate at room temperature for 2 min.
      7 Read each standard and the samples using the QubitTM 4 Fluorometer.
  4.            1QubitTM standards must be prepared fresh for each assay.


  5. PCR purification and translesion DNA synthesis

    Procedure C yields a truncated dsDNA with a 5′ overhang. Translesion DNA synthesis using Sulfolobus DNA Polymerase IV fills this overhang so that the DNA template is fully double-stranded (Figure 1). The PCR product from Procedure C is first purified using a spin-column kit to exchange the reaction buffer and deplete dNTPs. This clean-up step ensures that reaction conditions are optimal for translesion synthesis using Sulfolobus DNA Polymerase IV regardless of which DNA polymerase is used for PCR amplification.


    1. Purify the six 100 μl PCRs using the QIAquick PCR Purification Kit, which will exchange the reaction buffer and deplete dNTPs (see Note 2):

      1. Transfer each 100 μl PCR into a corresponding 1.7 ml microcentrifuge tube.

      2. Add 500 μl of Buffer PB to each PCR. Vortex thoroughly and spin down in a mini centrifuge.

      3. Apply each sample to a separate QIAquick spin column.

      4. Centrifuge the samples at 18,000 × g and 4°C for 1 min. Discard the flow-through.

      5. Apply 750 μl of Buffer PE to each column.

      6. Centrifuge the samples at 18,000 × g and 4°C for 1 min. Discard the flow-through.

      7. Centrifuge the samples at 18,000 × g and 4°C for 3 min to pull down residual liquid.

      8. Transfer the columns to clean 1.7 ml microcentrifuge tubes.

      9. For five of the six columns, apply 50 μl of Buffer EB. These samples will be pooled for translesion synthesis. For the sixth column, apply 30 μl of Buffer EB. This will be a negative control for denaturing PAGE QC (Procedure G).

        Critical: Always elute with Buffer EB. Do not elute with water. The DNA must remain buffered. See Note 1b. Buffer EB is 10 mM Tris-HCl, pH 8.5.

      10. Centrifuge samples at 18,000 × g and 4°C for 1 min to elute DNA.

    2. Store the sample that was eluted in a 30 μl volume at -20°C for use in Procedure G.

    3. Pool the five samples that were eluted in 50 μl volumes into a 1.7 ml microcentrifuge tube.

    4. Estimate the volume of the eluted sample by transferring 200 μl to a new 1.7 ml microcentrifuge tube, adjusting the pipette so that it barely aspirates the remaining sample, and transferring the remaining volume. The sample volume will be used in Step D5.

    5. Prepare a 500 μl translesion synthesis reaction (Table 5) in a 1.7 ml microcentrifuge tube on ice. Add each reagent in the order listed in Table 5 and mix as follows:

      1. After adding ThermoPol® Buffer, vortex and spin down the master mix in a mini centrifuge.

      2. After adding the purified PCRs, vortex and spin down the master mix again.

      3. Add Vent® (exo-) DNA Polymerase and Sulfolobus DNA Polymerase IV and gently mix the completed master mix by pipetting.

        Note: Although Sulfolobus DNA polymerase IV alone is sufficient to complete the translesion synthesis reaction, including Vent (exo-) DNA polymerase may improve the fidelity of DNA synthesis beyond the internal lesion (see Note 3).


        Table 5. Reaction master mix for translesion DNA synthesis. The translesion DNA synthesis master mix is used for preparatory scale translesion primer extension.

        Reagent Stock Conc. Final Conc. 500 μl Rxn.
        Nuclease-Free Water - - See footnote 1
        ThermoPol® Buffer 10× 50.0 μl
        Std./Thermostable dNTP Solution2,3 10 mM 0.200 mM 10.0 μl
        Purified PCRs - - See Step D4
        Vent® (exo-) DNA Polymerase4 2 U/μl 0.020 U/μl 5 μl
        Sulfolobus DNA Polymerase IV 2 U/μl 0.020 U/μl 5 μl
        Total Volume 500.0 μl

        1Add nuclease-free water so that the total reaction volume including all reagents is 500 μl.

        2Translesion synthesis can be performed using either standard dNTPs or thermostability-enhancing dNTPs. Standard dNTPs are suitable for most applications. Thermostability-enhancing dNTPs are useful as a safeguard against DNA end-fraying when downstream protocols require prolonged heating to high (>65°C) temperatures.

        3See Recipe 3 for the composition of thermostability-enhancing dNTP solution.

        4See Note 3.


    6. Aliquot 100 μl reaction volumes into five thin-walled 200 μl PCR tubes.

    7. Start the thermal cycler protocol shown in Table 6. Place the reactions on the thermal cycler once the block temperature is 55°C, then advance the thermal cycler to the next step.


      Table 6. Thermal cycling protocol for translesion DNA synthesis. The translesion synthesis reaction proceeds at 55°C for one hour in a thermal cycler with a heated lid set to 105°C. The final hold is at 12°C to reduce energy consumption and extend thermal cycler life.

      Step Temperature Time
      55°C Hold 55°C Forever
      Extension 55°C 1 h
      Final Hold 12°C Forever


    8. After translesion synthesis, the completed dsDNA must be purified using either Procedure E (agarose gel purification) or Procedure F (exonuclease I clean-up). If the purification cannot be performed immediately, the reactions can be stored at -20°C.


  6. Purification option 1: Agarose gel purification of the completed dsDNA templates

    When plasmid DNA is used as the template for PCR Amplification (Procedure C), gel purification is required to remove plasmid DNA and any excess primers. If an ssDNA oligonucleotide was used as the template for PCR amplification, Procedure F (Purification option 2: Thermolabile exonuclease I clean-up) can be used to purify the dsDNA transcription template instead of agarose gel extraction.

    1. Pool the five 100 μl translesion synthesis reaction aliquots into a 1.7 ml microcentrifuge tube.

    2. Add 50 μl of 3M sodium acetate, pH 5.5, and 1 ml of cold 100% ethanol to the pooled sample. Mix the sample thoroughly by vortexing and inverting the tube.

    3. Precipitate the DNA by chilling the sample at -20°C overnight or at -80°C for 30 min.

    4. When the sample has chilled sufficiently, pour a 1× TBE, 1% agarose gel containing 0.5 μg/ml ethidium bromide. Use a gel comb that holds at least 50 μl per well.

      Critical: Use preparatory grade agarose (such as SeaKem GTG Agarose) for gel purification.

      Critical: The gel must contain ethidium bromide so that the DNA is stained while the gel runs.

      Note: Ethidium bromide should be handled and disposed of according to institutional guidelines.

    5. Centrifuge the sample at 18,000 × g and 4°C for 30 min to pellet the precipitated DNA.

    6. Aspirate and discard the supernatant by pipetting. Be careful to avoid the pellet.

      Tip: To aspirate large supernatant volumes with precision, a 10 μl pipette tip can be loaded onto the end of a 1,000 μl pipette tip. This enables aspiration of ~1 ml with precise control.

    7. Add 1 ml of cold 70% ethanol to the sample and gently invert the tube several times. Do not dislodge the pellet.

    8. Centrifuge the sample at 18,000 × g and 4°C for 2 min.

    9. Aspirate and discard the supernatant by pipetting.

    10. Centrifuge the sample for several seconds to spin down residual supernatant.

    11. Aspirate and discard the residual supernatant by pipetting.

    12. Cover the open tube with a tissue wiper and set it on a bench to dry for several minutes.

    13. Assemble and fill a horizontal gel tank with enough 1× TBE to cover the agarose gel.

    14. Resuspend the pellet in 30 μl of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0.

      Critical: Always resuspend the pellet in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0. Do not resuspend the pellet in water. The sample must remain buffered. See Note 1b.

    15. Add 6 μl of 6× DNA Loading Dye (+SDS, XC only) to the sample and mix by pipetting.

    16. Load the sample into the agarose gel and run the gel at 100 V for 1-2 h.

      Note: Because the sample contains several micrograms of DNA, a red band should become visible as the ethidium bromide co-migrates with the DNA (Figure 3A). This enables gel extraction to be performed without exposing the DNA to any UV light.



      Figure 3. DNA band excision without UV light. A. The PCR product can be visualized as a red band under visible light because ethidium bromide co-migrates with the large quantity of DNA in the gel. B. Visualization of the gel from (A) on a UV transilluminator after the PCR product was excised to assess the quality of the PCR and the band excision. No side products were detected.


    17. Without exposing the gel to UV light, excise the PCR product with a clean razor blade (Figure 3).

    18. Trim the gel slice to remove as much excess agarose as possible.

      Critical: Removing excess agarose improves DNA yield and quality.

    19. Tare a balance with a 2.0 ml tube. Add the gel slice to the 2.0 ml tube, weigh the gel slice, and record the mass. The mass of the gel slice will be used below in Steps E21a and E21b.

    20. Visualize the gel on a UV transilluminator to confirm that the band was excised precisely and assess whether any side products are present (Figure 3B).

    21. Recover the DNA from the excised gel slice using the QIAquick Gel Extraction Kit. Use the following protocol, which includes every optional step recommended by the manufacturer and reduces gel melting temperature to minimize the possibility of DNA end fraying:

      Note: For more information, refer to theQiagen QIAquick®Gel Extraction Kit Quick-Start Protocol.

      1. If the gel slice weighs more than 400 mg, divide it into several 2.0 ml tubes so that each tube contains <400 mg of gel.

      2. Add 3 volumes of Buffer QG to 1 volume gel  (1 mg gel ~1 μl).

      3. Incubate the sample at 30°C and occasionally vortex until the gel slice has dissolved.

        Critical: The gel slice is melted at 30°C to minimize DNA template end fraying.

      4. Add 1 gel volume of isopropanol to the sample. Mix by inverting the tube and spin down in a mini centrifuge.

      5. Apply 700 μl of the sample to a QIAquick spin column and centrifuge at 18,000 × g and 4°C for 1 min. Discard the flow-through and repeat until the entire sample has been applied.

      6. Add 500 μl of Buffer QG to the column and centrifuge at 18,000 × g and 4°C for 1 min. Discard the flow-through.

      7. Add 750 μl of Buffer PE to the column and centrifuge at 18,000 × g and 4°C for 1 min. Discard the flow-through.

      8. Centrifuge the samples at 18,000 × g and 4°C for 3 min to spin down residual liquid.

      9. Place the column into a clean 1.7 ml microcentrifuge tube.

      10. Apply 30 μl of 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 to the center of the QIAquick column.

        Critical: Always elute with 10 mM Tris-HCl, pH 8.0. Do not elute with water. See Note 1b.

      11. Centrifuge the column at 18,000 × g and 4°C for 1 min.

      12. Transfer the eluted sample to a clean 1.7 ml microcentrifuge tube.

    22. Quantify the DNA template concentration using the QubitTM dsDNA BR Assay Kit (Table 4).

    23. Convert the DNA concentration from ng/μl to μM. A typical prep yields 30 μl of DNA at a concentration between 0.75 μM and 1.25 μM.

      Tip: Promega has a web-based tool for converting μg of DNA to pmol of DNA. Enter the DNA length in base pairs and the number of μg of DNA in 1 μl of sample to calculate the concentration of your sample in pmol/μl; pmol/μl equals μM.

    24. Prepare 200 μl of 50 nM working stock for each template by diluting the primary stock into 10 mM Tris-HCl, pH 8.0. Both the primary stock and the working stock should be stored at -20°C.

      Critical: Always prepare working stocks using 10 mM Tris-HCl, pH 8.0. Do not use water. The DNA must remain buffered to prevent fraying of the duplex downstream of the modification site. See Note 1b.


  7. Purification option 2: Thermolabile exonuclease I clean-up

    When an ssDNA oligonucleotide is used as the template for PCR Amplification (Procedure C), the final dsDNA product can be purified by using thermolabile exonuclease I (exoI) to degrade excess primers and a PCR purification kit to exchange the reaction buffer. This alternate purification protocol yields approximately two times more DNA template than agarose gel purification and, consequently, does not require as much input DNA (Note 1c). However, the success of the thermolabile exoI clean-up procedure is contingent upon the specificity of the PCR because it does not select for DNA size.

    1. Purify the five 100 μl translesion synthesis reactions using the QIAquick PCR Purification Kit, which depletes dNTPs and enzymes:

      Critical: Sulfolobus DNA polymerase IV is active at 37°C. If substantial amounts of primer remain when the thermolabile exoI reaction is incubated at 37°C, exoI-resistant primer dimers that do not occur at higher temperatures can form. PCR purification before thermolabile exoI treatment removes dNTPs and Sulfolobus DNA polymerase IV, which prevents the formation of primer dimers.

      1. Transfer each 100 μl PCR into a corresponding 1.7 ml microcentrifuge tube.

      2. Add 500 μl of Buffer PB to each PCR. Vortex thoroughly and spin down in a mini centrifuge.

      3. Apply the samples to QIAquick spin columns by adding 600 μl of sample to the column, centrifuging at 18,000 × g and 4°C for 1 min, and discarding the flow-through. Multiple samples can be loaded onto one column by repeating this procedure as long as the column capacity (10 μg DNA) is not exceeded.

      4. Apply 750 μl of Buffer PE to each column.

      5. Centrifuge the samples at 18,000 × g and 4°C for 1 min. Discard the flow-through.

      6. Centrifuge the samples at 18,000 × g and 4°C for 3 min to pull down residual liquid.

      7. Transfer the columns to clean 1.7 ml microcentrifuge tubes.

      8. Apply 50 μl of Buffer EB to each column.

        Critical: Always elute with Buffer EB. Do not elute with water. The DNA must remain buffered. See Note 1b. Buffer EB is 10 mM Tris-HCl, pH 8.5.

      9. Centrifuge the samples at 18,000 × g and 4°C for 1 min to elute the DNA.

    2. Pool the eluted samples into one 1.7 ml microcentrifuge tube.

    3. Estimate sample volume by adjusting a pipette so that it barely aspirates the sample and transferring it to a new 1.7 ml microcentrifuge tube. This sample volume is used in Step F4.

    4. Prepare a 500 μl thermolabile exoI reaction (Table 7) in a 1.7 ml microcentrifuge tube on ice.


      Table 7. Reaction master mix for thermolabile exonuclease I digestion

      Reagent Stock Conc. Final Conc. 500 μl Rxn.
      Nuclease-Free Water - - See footnote 1
      ThermoPol® Buffer2 10× 50.0 μl
      Purified PCRs - - Determined in Step F3
      Thermolabile Exonuclease I 20 U/μl 0.1 U/μl 2.5 μl
      Total Volume 500.0 μl

      1Add nuclease-free water so that the total reaction volume including all reagents is 500 μl.

      2ThermoPol® Buffer is used here because thermolabile exoI is heat inactivated 80°C.


    5. Aliquot 100 μl reaction volumes into five thin-walled 200 μl PCR tubes.

    6. Set a thermal cycler to 37°C with a heated lid set to 45°C. Place the reactions in the thermal cycler once the block temperature reaches 37°C and incubate for 4 min.

    7. Move the reactions to ice.

    8. Start the thermal cycler protocol shown in Table 8. Place the reactions on the thermal cycler once the block temperature reaches 80°C, then advance the thermal cycler to the next step.


      Table 8. Thermal cycling protocol for thermolabile exonuclease I heat inactivation. Heat inactivation proceeds at 80°C for 1 min in a thermal cycler with a heated lid set to 105°C.

      Step Temperature Times
      80°C Hold 80°C Forever
      Inactivation 80°C 1 min
      Final Hold 12°C Forever


    9. Repeat the PCR purification described in Step F1 with the following modifications to purify the dsDNA template:

      1. Perform the 750 μl Buffer PE wash described in steps F1d/e twice.

      2. In step F1i, elute the samples in 30 μl of 10 mM Tris-HCl pH 8.0 instead of Buffer EB.

    10. Quantify DNA template concentration and prepare a working stock as described in Steps E22-E24.


  8. Internally modified DNA template quality control by denaturing PAGE

    The quality of an internally modified DNA template preparation should be assessed by using denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE) to confirm that the translesion synthesis reaction proceeded to completion. Successful DNA template QC requires complete denaturation of the DNA template so that the size of each strand can be assessed. It is therefore critical that the gel is run at a high temperature (~50°C). The protocol below is designed to achieve this using a Bio-Rad Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell.

    Note: Experienced readers will be able to perform denaturing PAGE QC and native PAGE QC (Procedure H) in parallel.


    1. Thoroughly clean a 1.0 mm spacer plate, a short plate, and a 1.0 mm 10-well comb with deionized water. Rinse the plates with 70% ethanol and allow them to air-dry.

    2. Assemble the glass plates in the Mini-PROTEAN casting frame. When securing the plates in the casting frame, be sure that the bottom edges of the plates are flush.

    3. Secure the assembled casting frame on a gasket in the Mini-PROTEAN casting stand.

    4. Combine 1 ml UreaGel Buffer, 5 ml UreaGel Diluent, and 4 ml UreaGel Concentrate in a 15 ml conical tube. Invert the tube to mix. This mixture will prepare a 10% acrylamide gel.

      Caution: Acrylamide is a neurotoxin and should be handled cautiously.

      Note: Adjust the gel percentage as needed depending on DNA template length. My laboratory has used 10% gels to assess DNA templates from 121 to 273 nt in length.

    5. Add 80 μl of 10% APS to the UreaGel mixture and invert the tube to mix.

    6. Add 4 μl of TEMED to the UreaGel mixture and invert the tube to mix and start polymerization.

    7. Pipette the UreaGel mixture carefully but quickly to fill the space between the glass plates.

    8. Insert the 1.0 mm 10-well comb and allow the gel to polymerize for at least 30 min.

    9. Once the gel has polymerized, assemble the Mini-PROTEAN Electrode Assembly. Secure the gel plates on one side of the electrode assembly and a buffer dam on the other.

    10. Place the electrode assembly in the Mini-PROTEAN gel tank.

    11. Fill the chamber between the gel plates and buffer dam with 1× TBE. Add 1× TBE to the outer gel chamber so that it covers the lower gel gasket.

      Critical: It is important to cover only the bottom of the gel gasket. Using more buffer will disperse heat while the gel is running and result in poor DNA denaturation.

    12. Rinse the wells with 1× TBE by pipetting until the buffer in each well appears homogenous.

    13. Pre-run the gel at 480 V for ~30 min to warm the gel.

    14. Set a heat block to 95°C once the gel is pre-running.

    15. For each sample that will be assessed, combine 15 μl of 1× Formamide Loading Dye with 1 μl of 50 nM DNA template in a 1.7 ml microcentrifuge tube. The negative control and positive control (if performed) should also be prepared this way.

      Critical: A 16 μl sample volume is used to further dilute the sample so that re-annealing of DNA duplexes after denaturation is reduced.

    16. Combine 19 μl of 1× Formamide Loading Dye with 1 μl of Low Range ssRNA Ladder. Aliquot 5 μl into a separate tube and store the remaining 15 μl at -20°C for future use.

      Note: An ssRNA ladder is used due to the lack of commercially available ssDNA ladders in the required size range. The ladder is therefore intended to be a rough approximation of DNA size.

    17. After the gel has pre-run for ~25 min, place all samples on the 95°C heat block for 5 min. Place an aluminum block on top of the samples to prevent the tubes from opening.

    18. Remove the samples from the heat block and immediately place them on ice to snap cool. Leave the samples on ice for 2 min.

      Critical: Snap cooling minimizes re-annealing of DNA duplexes.

    19. Turn off the power supply and quickly rinse the wells with 1× TBE by pipetting.

    20. Load the samples onto the gel using gel-loading pipette tips. Take care to fill as little of the well as possible so that the resulting bands are sharp despite the large sample volume.

      Critical: Load the samples quickly so that the gel remains warm.

    21. Run the gel at 480 V until the bromophenol blue dye band reaches the lower gel gasket.

      Note: Monitor the gel closely. At 480 V, electrophoresis will be complete in ~10 min.

    22. Turn off the power supply, disassemble the gel tank, and set the gel plates on a bench to cool.

    23. Add 3 μl of SYBR Gold Nucleic Acid Stain to 30 ml of 1× TBE in a 150 mm culture dish. Gently swirl the dish to disperse the stain.

    24. Pry apart the gel plates using the Mini-PROTEAN gel releaser.

    25. Carefully lift the gel off the plate while touching only the edges. Submerge the gel in the SYBR Gold stain. Cover the dish in aluminum foil and rock gently for 10 min.

    26. Visualize and document the gel. Gel visualization can be performed in several ways: I prefer to use a Typhoon Biomolecular Imager or equivalent laser scanner due to its high sensitivity. The Typhoon should be run in fluorescence mode using the settings recommended for SYBR Gold (488 nm laser with the 520 BP 40 emission filter on a Typhoon 9400). Set the PMT voltage to 475 V for the first scan and adjust it as needed. If you do not have access to a laser scanner that is capable of imaging SYBR Gold Nucleic Acid Stain, the gel can also be viewed and documented on a Dark Reader Blue Light Transilluminator.

    27. Evaluate the quality of the DNA template preparation for the following expected outcomes:

      1. The negative control should have two DNA template bands (Figure 4). The upper (modified) strand should correspond to full DNA template length. The lower (unmodified) band should correspond to the length of the DNA template minus the number of nucleotides downstream of the internal modification site. Some excess primers may be present.

      2. The DNA template preparation should contain a single band that corresponds to the full length of the DNA template (Figure 4). No primers should be present.

        Critical: Only a single band of the expected length should be present. The translesion synthesis reaction can and should go to completion (see Note 1a).

      3. The positive control (if performed) should contain a single band that corresponds to the full length of the DNA template (Figure 4). Some excess oligonucleotide may be present if the positive control sample was not gel extracted.

        Note: The positive control is a useful indicator for the effectiveness of DNA duplex denaturation. If a gel-extracted positive control contains multiple bands, this suggests that DNA denaturation is incomplete and should be optimized.



        Figure 4. Example of a denaturing PAGE QC gel. Analysis of denaturing gel QC. Denaturation of the dsDNA duplex enables the length of each DNA strand to be assessed. The negative control, which contains a desthiobiotin modification and did not undergo translesion synthesis, contains a truncated DNA strand. In contrast, the internally desthiobiotinylated sample that was treated by translesion synthesis contains only full length DNA and is indistinguishable from the unmodified positive control. The gel image is adapted from Strobel et al. (2020) Figure 1E and was acquired using a Typhoon 9400 Biomolecular Imager.


  9. Internally modified DNA template quality control by native PAGE.

    After confirming that translesion synthesis went to completion using denaturing PAGE (Procedure G), the internally modified DNA template preparation should be assessed by native PAGE to confirm the purity of intact dsDNA duplexes.

    1. Thoroughly clean a 1.0 mm spacer plate, a short plate, and a 1.0 mm 10-well comb with deionized water. Rinse the plates with 70% ethanol and allow them to air-dry.

    2. Assemble the glass plates in the Mini-PROTEAN casting frame. When securing the plates in the casting frame, be sure that the bottom edges of the plates are flush.

    3. Secure the assembled casting frame on a gasket in the Mini-PROTEAN casting stand.

    4. Combine 3.6 ml Milli-Q water, 3 ml 3× TBE, and 2.4 ml ProtoGel (30%), in a 15 ml conical tube. Invert the tube to mix. This mixture will prepare an 8% acrylamide gel.

      Caution: Acrylamide is a neurotoxin and should be handled cautiously.

      Note: Adjust the gel percentage as needed depending on DNA template length. An 8% gel will be suitable for DNA up to ~500 bp in length. Use a 6% gel for DNA that is longer than ~500 bp.

    5. Add 100 μl of 10% APS to the acrylamide mixture and invert the tube to mix.

    6. Add 10 μl of TEMED to the acrylamide mixture and invert the tube to mix.

    7. Pipette the acrylamide mixture carefully but quickly to fill the space between the glass plates.

    8. Insert the 1.0 mm 10-well comb and allow the gel to polymerize for at least 30 min.

    9. Once the gel has polymerized, assemble the Mini-POTEAN Electrode Assembly. Secure the gel plates on one side of the electrode assembly and a buffer dam on the other.

    10. Place the electrode assembly in the Mini-PROTEAN gel tank.

    11. Fill the chamber between the gel plates and buffer dam with 1× TBE. Add 1× TBE to the outer gel chamber up to the 2-gel fill line.

    12. Rinse the wells with 1× TBE by pipetting.

    13. For each sample that will be assessed, combine 4 μl of 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 μl 6× DNA Loading Dye (non-denaturing), and 1 μl of 50 nM DNA template in 1.7 ml microcentrifuge tube. The positive control (if performed) should also be prepared this way. Mix by vortexing and spin down in a mini centrifuge.

      Critical: The samples must be prepared using 10 mM Tris-HCl, pH 8.0. See Note 1b.

    14. Load the samples onto the gel using gel-loading pipette tips.

    15. Load 3 μl of Quick-Load® Purple 100 bp DNA ladder (or a comparable 100 bp DNA ladder).

    16. Run the gel at 100 V until the bromophenol blue loading dye reaches the lower gel gasket.

    17. Turn off the power supply and disassemble the gel apparatus.

    18. Add 3 μl of SYBR Gold Nucleic Acid stain to 30 ml of 1× TBE in a 150 mm culture dish. Gently swirl the dish to disperse the stain.

    19. Pry apart the gel plates using the Mini-PROTEAN gel releaser.

    20. Carefully lift the gel off the plate while touching only the edges. Submerge the gel in the SYBR Gold stain. Cover the dish in aluminum foil and rock gently for 10 min.

    21. Visualize and document the gel using a Typhoon Biomolecular Imager (preferred method) or a Dark Reader Blue Light Transilluminator.

    22. Evaluate the quality of the DNA template preparation. The DNA template preparation should contain a single band that corresponds to the expected full length dsDNA product. No side products or excess primer should be detectable (Figure 5). If a slow-migrating band is observed by native PAGE after a template preparation passes denaturing PAGE QC, this suggests that the DNA was mishandled during preparation (e.g., diluted into an unbuffered solution; see Note 1b).



      Figure 5. Example of a native PAGE QC gel. The dsDNA template preparation contains no detectable side products or oligonucleotides and is the expected length (121 bp). Note that the internally modified DNA template migrates slightly slower than an unmodified control. The gel image is adapted from Strobel et al. (2020) Supplementary Figure S2B and was acquired using a Typhoon 9400 Biomolecular Imager.


  10. Assess the efficiency of transcription roadblocking using single-round in vitro transcription (optional)

    The transcription roadblocking activity of an internally modified DNA template can be evaluated using a single-round in vitro transcription time course. This quality control step is optional when using a previously validated DNA modification. However, it may be useful to perform this analysis to be confident that the internally modified DNA template has the expected transcription roadblocking activity, particularly if you are new to the protocols described above.

    Note: (1) When assessing a new DNA template sequence, prepare an additional transcription reaction using an unmodified version of the DNA template to distinguish halted TECs from run-off transcripts. (2) The experiment described below uses [α-32P]-UTP as a radioactive tracer. Perform this experiment using appropriate radiation shielding and in compliance with institutional protocols. (3) The procedure includes phenol:chloroform extraction and subsequent ethanol precipitation remove protein and concentrate the sample prior to sequencing gel electrophoresis. These steps are not strictly required but ensure that RNA mobility is not influenced by residual protein.


    1. Set a heat block to 37°C at least 30 min before starting the experiment.

    2. Prepare in vitro transcription Master Mix (Table 9) in a 1.7 ml microcentrifuge tube on ice. Add each reagent in the order listed in Table 9 and mix as follows:

      1. After adding 10× Transcription Buffer, vortex and spin down the master mix.

      2. After adding every reagent except E. coli RNAP, vortex and spin down the master mix again.

      3. Add E. coli RNAP holoenzyme and gently mix the completed Master Mix by pipetting.


        Table 9. Reaction master mix for single-round in vitro transcription. Individual in vitro transcription reactions have a total volume of 25 μl. MgCl2 is omitted from the master mix so that transcription is only initiated upon addition of 10× Start Solution.

        Reagent Stock Conc. Final Conc. 25 μl Rxn. 10 Rxn. Vols.
        Nuclease-Free Water - - 14.85 μl 148.5 μl
        Transcription Buffer 10× 2.50 μl 25.0 μl
        NTP Solution1 20× 1.25 μl 12.5 μl
        BSA2 5 mg/ml 0.1 mg/ml 0.50 μl 5.0 μl
        DNA template 50 nM 5 nM 2.50 μl 25.0 μl
        E. coli RNAP holo 1 U/μl 0.016 U/μl 0.40 μl 4.0 μl
        [α-32P]-UTP3 - - 0.50 μl 5.0 μl
        Total Volume (omits 10× Start Solution) 22.50 μl 225.0μl

        1NTP concentration is 200 μM ATP, 200 μM GTP, 200 μM CTP, and 50 μM UTP to promote [α-32P]-UTP incorporation. Adjust the NTP mix accordingly if a different radioactive tracer is used.

        2Critical: BSA must be molecular biology grade.

        3Critical: Use [α-32P]-NTPs within two weeks of receipt, assuming the stock is from a fresh lot.


    3. Prepare 10× Start Solution.

      Critical: 10× Start Solution must be prepared fresh for each experiment.

      1. Pipette 200 μl of 100 mM MgCl2 into a 1.7 ml microcentrifuge tube.

      2. Pipette 10 μl of 2 mg/ml rifampicin into the 100 mM MgCl2.

        Note: Rifampicin inhibits bacterial RNAPs by blocking extension of transcripts beyond 2-3 nt. Starting transcription by adding MgCl2 and rifampicin simultaneously permits pre-formed open complexes to initiate but blocks further initiation so that transcription is single-round.

      3. Vortex thoroughly and spin down the 10× Start Solution in a mini centrifuge.

      4. Cover the 10× Start Solution in foil to protect from light and keep at RT.

    4. Prepare a 1.7 ml microcentrifuge tube containing 125 μl of Stop Solution for each time point and label the tubes accordingly. Keep these tubes on ice throughout the experiment.

    5. Perform the single-round in vitro transcription time course. An example time course with eight time points is shown in Table 10.

      Note: In vitro transcription time courses require fast sample manipulation. Inexperienced users should practice these manipulations with mock samples before performing the experiment.


      Table 10. Single-round in vitro transcription time course. Open promoter complexes are formed by incubating the transcription Master Mix at 37°C for 10 min. Single-round transcription is initiated by adding 10× Start Solution, and at each time point, a 25 μl aliquot of Master Mix is transferred to a tube containing 125 μl of Stop Solution, vortexed briefly, and kept on ice.

      Time (MM:SS) Action Purpose
      00:00 Place Master Mix (MM) at 37°C Form open promoter complexes
      10:00 Add 25 μl of 10× Start Solution (2.5 μl/rxn) Initiate transcription
      10:15 Transfer 25 μl of MM to 125 μl of Stop Solution Take a 15 s time point
      10:30 Transfer 25 μl of MM to 125 μl of Stop Solution Take a 30 s time point
      11:00 Transfer 25 μl of MM to 125 μl of Stop Solution Take a 1 min time point
      12:00 Transfer 25 μl of MM to 125 μl of Stop Solution Take a 2 min time point
      14:00 Transfer 25 μl of MM to 125 μl of Stop Solution Take a 4 min time point
      18:00 Transfer 25 μl of MM to 125 μl of Stop Solution Take an 8 min time point
      26:00 Transfer 25 μl of MM to 125 μl of Stop Solution Take a 16 min time point
      42:00 Transfer 25 μl of MM to 125 μl of Stop Solution Take a 32 min time point

    6. Add 150 μl phenol:chloroform:isoamyl alcohol, pH 8.0 to each sample.

    7. Vortex the samples thoroughly.

    8. Centrifuge the samples at 18,000 × g and 4°C for 5 min.

    9. For each sample, prepare a 1.7 ml microcentrifuge tube containing 450 μl 100% ethanol, 15 μl 3 M sodium acetate, pH 5.5, and 1 μl GlycoBlue Coprecipitant.

    10. Carefully transfer the aqueous phase (upper layer) of each sample to the corresponding 1.7 ml microcentrifuge tube prepared in Step H9. Invert the tube several times to mix.

    11. Store the samples at -20°C overnight to precipitate the RNA.

    12. The next morning, prepare a 0.4 mm, 12% acrylamide, 7.5 M urea sequencing gel as follows:

      Caution: Acrylamide is a neurotoxin and should be handled cautiously.

      Notes:

      1. It is essential to wear a lab coat and safety glasses while pouring sequencing gels to protect against acrylamide splashes – occasionally, inserting the gel comb between the glass plates can cause the acrylamide to splash.

      2. Gel percentage and running conditions are dictated by the length of the RNA. According to the National Diagnostics UreaGel System Protocol, 12% acrylamide monomer is appropriate for 10 to 50 nt RNAs, 8% for 40 to 100 nt, and 6% for 60 to 150 nts.

      1. Clean the long and short sequencing gel plates thoroughly with a mild detergent and a plastic brush and rinse with deionized water. Rinse the gel plates with 70% ethanol and wipe dry with a light-duty tissue wiper.

        Note: Periodically treat the short plate with Rain-X to assist with releasing the gel plates.

      2. Clean a 0.4 mm comb and 0.4 mm spacers with soap and deionized water and dry using a light-duty tissue wiper.

      3. Assemble the sequencing gel for pouring. See Video 1 for a demonstration of the recommended assembly.

      4. In a 250 ml plastic beaker, combine 7 ml UreaGel Buffer, 29.4 ml UreaGel Diluent, 33.6 ml UreaGel Concentrate, and 400 μl 10% APS. Swirl the beaker carefully to mix.

        Note: This prepares a 12% acrylamide gel. Adjust as needed.

      5. Add 25 μl TEMED to the UreaGel mixture and swirl to begin polymerization. Draw the mixture into a 60 ml syringe and carefully expel the mixture once to ensure that it is fully mixed. Draw the UreaGel mixture into the syringe again.

        Note: This protocol uses less 10% APS and TEMED than recommended in the National Diagnostics UreaGel System protocol to slow polymerization for easier gel pouring.

      6. Pour the sequencing gel. See Video 1 for a demonstration of the recommended procedure.

      7. Allow the gel to polymerize for 60 to 90 min.

        Video 1. Recommended procedure for pouring a sequencing gel. A straightforward and reliable procedure for pouring a 0.4 mm large format sequencing gel is demonstrated.


    13. While the gel is polymerizing, centrifuge the samples at 20,000 × g and 4°C for 30 min.

    14. Aspirate the supernatant from each sample while taking care not to disturb the small blue pellet.

    15. Centrifuge the samples for several seconds to spin down residual liquid.

    16. Aspirate residual liquid with a 10 μl pipette tip.

    17. Add 6.5 μl of 1× Formamide Loading Dye to each sample.

    18. Briefly vortex the samples and spin down the liquid.

    19. Once the gel has polymerized, assemble the sequencing gel apparatus. Rinse the wells by drawing 1× TBE from the upper buffer chamber into a 60 ml syringe with a bent 20G 1½” needle and expelling the TBE into the wells. See Video 2 for a demonstration of how to assemble a BRL Model S2 sequencing gel apparatus.


      Video 2. Assembly of the BRL Model S2 sequencing gel system. The procedure for assembling a gel onto the Model S2 sequencing gel system is demonstrated.

    20. Close the safety lids, attach the leads, and pre-run the gel at 1,500 V for ~20 min.

    21. Place the samples into the 95°C heat block for 5 min. Place a second aluminum block on top of the samples to prevent the tubes from opening.

    22. Snap cool the samples by immediately placing on ice.

    23. Using a Sharpie, label the sequencing gel plates to indicate what sample each well will contain. Mark any wells that will be left blank between samples.

    24. Once the sequencing gel has pre-run for ~20 min, turn off the power supply and rinse the wells a second time by drawing 1× TBE from the upper buffer chamber into a 60 ml syringe with a bent 20G 1½” needle and expelling the TBE into the wells.

    25. Carefully load each sample into its corresponding well using a 0.4 mm gel loading tip.

      Tip: Set the pipette volume several microliters higher than the sample volume. This generates an air buffer between the sample and the tip. When loading a sample, dispense the air buffer first and move the tip toward the base of the well as the sample is ejected. The air bubble will either float free of the well or can be gently aspirated.

      Caution: It is not feasible to load a sequencing gel behind acrylic shielding. Wear a lab coat and safety glasses, and minimize radiation exposure by keeping every sample except the one you are loading shielded. Radiation exposure can be monitored using a dosimetry badge.

    26. Load 6.5 μl of 1× Formamide Loading Dye into any blank wells that are next to sample wells. This helps the sample lanes to run straight.

    27. Close the upper buffer chamber lid and reattach the leads.

    28. Run the gel at 1,400 V for 2.5-3 h.

    29. Blank a storage phosphor screen using the Storage Phosphor Screen Image Eraser.

    30. Turn off the power supply and disassemble the Model S2 apparatus. See Video 3 for a demonstration of how to disassemble the BRL Model S2 sequencing gel apparatus.

      Caution: The transcription reactions contain free [α-32P]-UTP, which will typically migrate into the lower buffer chamber. The buffer in the lower chamber will therefore be radioactive.


      Video 3. Disassembly of the BRL Model S2 sequencing gel system. The procedure for removing a gel from the Model S2 sequencing gel system is demonstrated.


    31. Prepare the gel for exposure to a storage phosphor screen by opening the plates and covering the exposed gel in plastic wrap. See Video 4 for a demonstration of this procedure.

      Critical: It is absolutely critical that the outer surface of the plastic wrap, which will contact the storage phosphor screen, remains perfectly clean. This is easily achievable by changing your gloves frequently while applying the plastic wrap.

      Note: It is not typically necessary to dry the gel if the exposure time is short (i.e., <16 h).


      Video 4. Preparation of a sequencing gel for storage phosphor screen exposure. The procedure for opening and covering the sequencing gel with plastic wrap is demonstrated.


    32. Place the wrapped gel into a cardboard exposure cassette.

    33. Put on a clean pair of gloves. Open the storage phosphor cassette and, handling only the edges, set the screen onto the wrapped gel. Close the cardboard exposure cassette and place the storage phosphor cassette on top to prevent the screen from moving during exposure.

      Critical: The quality of the gel image depends on the condition of the storage phosphor screen. Handle the storage phosphor screen with care.

    34. Expose the storage phosphor screen. Exposure time depends on sample activity. I find that 4-6 h is usually sufficient for a clear image. It is essential to not overexpose the screen, particularly if you wish to quantify your results. I typically perform a scan after a short exposure (e.g., 4-6 h), blank the storage phosphor screen, and perform a second overnight exposure.

    35. Scan the phosphor screen on a Typhoon Biomolecular Imager using phosphorimaging mode.

    36. Evaluate the transcription roadblocking activity of the DNA template (Figure 6). Because 100% of TECs are expected to stall at the internal modification site, this analysis can typically be qualitative. For example, in the experiment below run-off transcripts only begin to become visible at the 4 min time point, indicating that the internal DNA modification efficiently halts RNAP.



      Figure 6. Example of a single-round in vitro transcription time course. Single-round in vitro transcription time course performed as described in this protocol except with 24 time points for kinetic analysis; the 8 time points suggested in this protocol are more than sufficient to assess transcription roadblocking activity. An unmodified positive control was not performed in this experiment because the precise location of stalled and run-off transcripts had already been determined. Data is adapted from Strobel et al. (2020) Figure 4.

Notes

  1. Notes on reproducibility and variability. At the time of writing, I have performed this protocol numerous times in two laboratory settings, and the procedures described above have become routine in my laboratory. Most preparations have used desthiobiotin-TEG or biotin-TEG as the internal modification, the templates encoded six distinct RNAs, and Q5® High-Fidelity DNA polymerase, Q5U® Hot Start High-Fidelity DNA polymerase, and Vent® (exo-) DNA polymerase have been used for PCR. The sections below describe my general observations.

    1. Translesion synthesis efficiency. Translesion synthesis by Sulfolobus DNA Polymerase IV is exceptionally efficient and has gone to completion (within the limit of detection of denaturing PAGE QC) in every internally modified DNA template preparation I have performed using the validated modifications described in Procedure B. This is consistent with my assessment of DNA modification bypass by Sulfolobus DNA Polymerase IV by primer extension: there was no discernable difference between the efficiency of primer extension across the DNA modifications shown in Figure 2 and an unmodified control (Strobel et al., 2020). The only case in which I have observed detectably incomplete translesion synthesis was during an attempt to construct a DNA template with a complex stall site containing consecutive internal biotin-TEG, 5-propynyl-dC, and biotin-11-dT modifications; even in this case, translesion synthesis was ~99% complete. In such cases, it may be possible to bring the translesion synthesis reaction to completion by substituting Vent® DNA polymerase in place of Vent (exo-) so that stalled lesion bypass attempts can be rescued by 3’5’ exonuclease-mediated degradation. However, my laboratory has not yet tested this procedure extensively.

    2. DNA duplex stability. In most experiments, the DNA duplex downstream of the modification site will be short (29 and 31 bp in the configurations I have used so far) because it is appended by a primer. Consequently, it is possible for this region of the DNA template to fray if mishandled (e.g., diluted into an unbuffered solution). End fraying is detectable by native PAGE QC as a slow-migrating product despite the observation of only full length product by denaturing PAGE QC (Figure 7). End fraying can be avoided simply by keeping the DNA template buffered at all times. As an additional safeguard, translesion synthesis can be performed using the thermostability-enhancing dNTPs 2-amino-dATP and 5-propynyl-dCTP alongside dGTP and dTTP, which I originally described as an alternate protocol in anticipation of end-fraying as a potential issue (Strobel et al., 2020). The thermostability-enhancing dNTPs reduce the occurrence of end-fraying when DNA is diluted in water (Figure 7B) but are not a substitute for proper sample buffering.



      Figure 7. Occurrence of slow-migrating DNA products. A. After translesion synthesis, only the full length product is detectable by denaturing PAGE QC both when translesion synthesis is performed with standard (S) and thermostability-enhancing (TS) dNTPs. B. Native PAGE QC of the templates shown in (A) after diluting the primary DNA template stock into nuclease-free water or 10 mM Tris-HCl, pH 8.0. Thermostability-enhancing dNTPs reduce the formation of slow-migrating products when DNA is diluted into water, and no slow-migrating products are observed in either preparation following dilution into 10 mM Tris-HCl, pH 8.0.


    3. Yield. Yield depends on the scale of PCR and the purification procedure used. In my experience, a 500 μl Q5® PCR will yield ~20 to ~40 pmols of DNA template if purified by agarose gel extraction (Procedure E) and ~70 to ~100 pmols if purified by exoI treatment and silica column clean-up (Procedure F).

  2. Choice of PCR polymerase. The protocol above has been validated for use with Q5® High-Fidelity DNA polymerase, Q5U® Hot Start High-Fidelity DNA polymerase, and Vent® (exo-) DNA polymerase. My laboratory currently uses the Q5® family of enzymes for most applications because of their fidelity. For routine applications that do not require a high-fidelity polymerase, Vent® (exo-) is ideal because it uses the same reaction buffer as Sulfolobus DNA polymerase IV. Consequently, for DNA preparations that use Vent® (exo-) for PCR and standard dNTPs for translesion synthesis, it is possible to perform the translesion synthesis reaction simply by adding 1 μl of Sulfolobus DNA polymerase IV per 100 μl of PCR, incubating the reaction at 55°C for 1 h, and proceeding with purification and QC as written above. In principle, the DNA polymerase used for PCR should not impact the outcome of the procedures above because, as written, the protocol includes a silica column purification step to exchange the reaction buffer after PCR so that translesion synthesis is always performed under optimal conditions.

  3. Inclusion of Vent (exo-) during translesion synthesis. Although Sulfolobus DNA polymerase IV alone is sufficient to complete translesion synthesis (Strobel et al., 2020), my current protocol includes Vent (exo-) during translesion synthesis to reduce the likelihood of errors in the dsDNA downstream of the modification site: because DNA polymerase IV only incorporates 1-2 nts per binding event, it is possible for Vent (exo-) to complete synthesis of the truncated DNA strand once the internal modification has been bypassed by Sulfolobus DNA polymerase IV. The misincorporation frequency of Vent (exo-) was reported to be 1.9 × 10-4 (Mattila et al., 1991), whereas the misincorporation frequency of Sulfolobus solfataricus DNA polymerase IV is between 8 × 10-3 and 3 × 10-4, depending on sequence context (Boudsocq et al., 2001).

  4. Tips for successful execution of the protocol. The tips below describe several ways in which I maximize precision and minimize variability in sample handling. These suggestions are general and will be familiar to experienced readers but may help less experienced researchers to successfully execute the procedures described above.

    1. Wear nitrile gloves during every step, both for personal protection and to minimize the likelihood of sample contamination. Change gloves regularly to prevent cross-contamination.

    2. Perform all biochemical manipulations in an RNase-free environment.

    3. Prepare solutions for small-scale biochemical reactions using commercial RNase-Free water and solutions when possible.

    4. Use quantitative pipetting practices. Read the Gilson Guide to Pipetting for more information.

      1. Choose an appropriate pipette for the volume you are pipetting.

      2. Be sure your pipettes are calibrated.

      3. Use low retention pipette tips.

      4. Keep the pipette vertical when aspirating liquid.

      5. Aspirate and dispense liquid smoothly and gently.

      6. Immerse the pipette tip to an appropriate depth to minimize the accumulation of excess liquid on the outside of the tip – this varies by pipette tip, but ~3 mm is typically appropriate. The exception is when pipetting volumes <1 μl for which the tip should only be immersed ~1 mm into the liquid.

      7. If excess liquid does accumulate on the outside of the pipette tip, wipe the tip on the edge of the tube you are pipetting from to remove any droplets.

      8. Most pipette tips have graduations that can be used to approximate the volume of liquid in the tip – visually inspect the tip to confirm that the volume you are pipetting is correct and consistent.

      9. After dispensing a concentrated reagent into another liquid, pipette up and down several times to rinse residual liquid from the tip.

      10. Change the tip after each sample. Reusing tips reduces accuracy and increases the likelihood of cross-contamination errors.

    5. Ensure adequate sample mixing.

      1. With the exception of enzymes, always mix and spin down reaction components once they are thawed.

      2. After diluting a concentrated buffer into water, vortex and spin down the sample before adding other reaction components.

      3. Once an enzyme has been added to the reaction, all subsequent mixing should be done by gentle pipetting.

      4. Visually inspect your samples during handling, particularly when working with small volumes.

    6. Ensure adequate sample heating and cooling.

      1. Verify digital heat block temperature using either a high-accuracy digital thermometer with a probe or an analog thermometer before use – do not assume the digital readout on the heat block is correct.

      2. Perform heat block incubations using Lab ArmorTM beads to ensure efficient sample heating. Alternatively, partially fill the wells of an aluminum heat block with deionized water. I prefer Lab ArmorTM beads to keep the tubes dry.

      3. When preparing enzymatic reactions on ice, use an aluminum block as a tube holder to minimize the accumulation of liquid on the outside of tubes. This helps to keep gloves dry during sample handling.

    7. Set centrifuges to count up if possible. This ensures a tight pellet because your samples will continue spinning until you stop the centrifuge just before you begin processing them.

Recipes

  1. DEPC-treated Milli-Q water (makes 1.5 L)

    1. Add 1.5 L of Milli-Q water to a 2 L autoclavable media bottle.

    2. Add a large stir bar to the bottle.

    3. Add 1.5 ml of DEPC the Milli-Q water for a concentration of 0.1% v/v. Close the bottle tightly.

      Caution: DEPC must be handled in a chemical fume hood.

    4. Set the bottle on a magnetic stir plate to stir overnight.

    5. The next morning, place the bottle in a chemical fume hood and open the cap to release the carbon dioxide gas that has accumulated.

    6. Autoclave the DEPC-treated water for 30 min using the liquid cycle.

      Caution: The media bottle cap must be loose when autoclaving.

    7. Store at room temperature.

  2. 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 (makes 1 ml)

    1. Pipette 990 μl of nuclease-free water into a 1.7 ml microcentrifuge tube.

    2. Add 10 μl of RNase-Free Tris-HCl, pH 8.0.

    3. Vortex thoroughly and spin down in a mini centrifuge.

    4. Store at RT.

  3. Thermostability-enhancing dNTP Solution

    1. Prepare a 1.7 ml microcentrifuge tube containing the reagents in Table 11.

    2. Vortex the solution thoroughly and spin down in a mini centrifuge.

    3. Store at -20°C.


      Table 11. Recipe for Thermostability-enhancing dNTP Solution

      Reagent Stock Conc. Final Conc. For 100 μl
      Nuclease-Free Water - - 60 μl
      2-Amino-dATP 100 mM 10 mM 10 μl
      dTTP 100 mM 10 mM 10 μl
      dGTP 100 mM 10 mM 10 μl
      5-Propynyl-dCTP 100 mM 10 mM 10 μl
      Total Volume 100 μl

  4. 1× TBE (tris-borate-EDTA) Buffer (makes 20 L)

    (89 mM tris base, 89 mM boric acid, 2 mM Na2EDTA, pH 8.3)

    Notes:

    1. TBE will precipitate rapidly if prepared at5× concentration. I recommend preparing TBE at a maximum concentration of 3×. This recipe is for 1× TBE, which will remain in solution.

    2. It is useful to determine and mark a 20 L fill line on the carboy that will hold the TBE solution by filling it with 20 L of deionized water using a 2 L graduated cylinder.


    1. Fill a 4 L flask with ~3 L of Milli-Q water.

    2. Add a large stir bar and place the flask on a magnetic stir plate.

    3. Begin stirring at ~180 RPM.

    4. Weigh 215.6 g of tris base (MW 121.14 g/mol) and slowly add it to the flask.

    5. Weigh 110 g of boric acid (MW 61.83 g/mol) and slowly add it to the flask.

    6. Weigh 14.89 g of Na2EDTA·2H2O (MW 372.24 g/mol) and slowly add it to the flask.

    7. Allow the reagents to dissolve. It may be necessary to add additional Milli-Q water at this time.

    8. Transfer the contents of the 4 L flask to a 20 L carboy.

    9. Fill the 4 L flask with ~3.5 L of Milli-Q water and pour it into the carboy.

    10. Fill the 20 L carboy with Milli-Q water to the previously determined 20 L fill line. Rock the carboy periodically to mix the solution.

    11. Store at RT.

  5. 70% (v/v) Ethanol (makes 50 ml)

    1. Pipette 15 ml of nuclease-free water into a 50 ml conical tube.

    2. Pipette 35 ml of 100% ethanol into the conical tube.

    3. Shake vigorously to mix.

    4. Store at -20°C.

  6. 10% (w/v) SDS (makes 50 ml)

    1. Dissolve 5 g of SDS in ~40 ml of DEPC-treated Milli-Q water in a 50 ml conical tube.

      Note: Slow rotation will help the SDS dissolve without causing excessive bubbles to form.

    2. Transfer the solution to a 50 ml graduated cylinder and adjust the volume to 50 ml using DEPC-treated Milli-Q water.

    3. Transfer the solution back to the 50 ml conical tube and gently mix by inverting the tube.

    4. Store at room temperature.

  7. 6× DNA Loading Dye, +SDS, xylene cyanole only (makes 25 ml)

    [10 mM Tris pH 8.0, 30% glycerol, 0.48% SDS, 0.05% (w/v) xylene cyanole FF]

    Notes:

    1. SDS is used to evict protein complexes from DNA.

    2. Bromophenol blue is not used in this recipe because it typically migrates close to DNA template bands and therefore obscures the visibility of the DNA unless UV light is applied. It is important not to use bromophenol blue as a loading dye so that the DNA template band can be excised without UV exposure.

    1. Weigh 9.38 g of glycerol in a 50 ml conical tube.

    2. Weigh ~12.5 mg of xylene cyanole FF in a 1.7 ml microcentrifuge tube.

    3. Dissolve the xylene cyanole FF in 1 ml DEPC-treated Milli-Q water and add to the 50 ml tube.

    4. Add 15.05 ml of DEPC-treated Milli-Q water to the 50 ml tube and mix thoroughly by vortexing and inverting the tube.

    5. Add 0.25 ml of nuclease-free 1 M Tris pH 8.0 and mix thoroughly by vortexing.

    6. Add 1.2 ml of 10% SDS to the conical tube and mix by gently inverting the tube.

    7. Transfer 1 ml aliquots to a 1.7 ml microcentrifuge tube as needed.

    8. Store at RT.

  8. 10% (w/v) APS (makes 10 ml)

    1. Add 1 g of APS to a 50 ml conical tube.

    2. Add 7 ml of autoclaved Milli-Q water and vortex to dissolve.

    3. Raise the volume to 10 ml.

    4. Transfer 410 μl aliquots to a 1.7 ml microcentrifuge.

    5. Store at -20°C. Each aliquot is enough to pour one sequencing gel.

  9. 1× Formamide Loading Dye (makes 10 ml)

    [90% (v/v) deionized formamide, 1× transcription buffer, 0.05% (w/v) bromophenol blue]

    Caution: The formamide stock bottle must be handled in a chemical fume hood.

    1. Weigh ~5 mg of bromophenol blue into a 1.7 ml microcentrifuge tube.

    2. Dissolve the bromophenol blue with 1 ml of 10× Transcription buffer and transfer to a 50 ml conical tube.

    3. Add 9 ml of deionized formamide and vortex thoroughly.

    4. Store at 4°C.

  10. 3× TBE Buffer (makes 4 L)

    (267 mM tris base, 267 mM boric acid, 6 mM Na2EDTA, pH 8.3)

    1. Fill a 4 L flask with ~3 L of Milli-Q water.

    2. Add a large stir bar and place the flask on a magnetic stir plate.

    3. Begin stirring at ~180 RPM.

    4. Weigh 129.4 g of tris base (MW 121.14 g/mol) and slowly add it to the flask.

    5. Weigh 66 g of boric acid (MW 61.83 g/mol) and slowly add it to the flask.

    6. Weigh 8.93 g of Na2EDTA·2H2O (MW 372.24 g/mol) and slowly add it to the flask.

    7. Allow the reagents to dissolve. It may be necessary to add additional Milli-Q water at this time.

    8. Transfer 3 L of the solution to 4 L carboy 1 L at a time using a 1 L graduated cylinder.

    9. Pour the remaining solution into the graduated cylinder.

    10. Raise the volume to 1 L with Milli-Q water and transfer to the carboy.

    11. Shake the carboy to mix.

    12. Store at RT.

  11. 6× DNA Loading Dye (non-denaturing) (makes 25 ml)

    [10 mM Tris pH 8.0, 30% glycerol, 0.05% (w/v) bromophenol blue]

    1. Weigh 9.38 g of glycerol in a 50 ml conical tube.

    2. Weigh ~12.5 mg of bromophenol blue in a 1.7 ml microcentrifuge tube.

    3. Dissolve the bromophenol blue in 1 ml DEPC-treated Milli-Q water and add to the 50 ml tube.

    4. Add 16.25 ml of DEPC-treated Milli-Q water to the 50 ml tube and mix thoroughly by vortexing and inverting the tube.

    5. Add 0.25 ml of nuclease-free 1 M Tris pH 8.0 and mix thoroughly by vortexing.

    6. Transfer 1 ml aliquots to a 1.7 ml microcentrifuge tube as needed.

    7. Store at RT.

  12. 1 M DTT (makes 10 ml)

    1. Weigh 1.54 g of DTT (MW 154.25 g/mol).

    2. Dissolve the DTT in 7 ml of nuclease-free water in a 50 ml conical tube.

    3. Transfer the solution to a 10 ml graduated cylinder.

    4. Adjust the volume to 10 ml using nuclease-free water.

    5. Attach a 0.2 μm PES syringe filter to a 10 ml syringe.

    6. Pre-wet the filter by drawing 5 ml of nuclease-free water into the syringe. Discard the water.

    7. Dispense the 1 M DTT stock through the syringe filter into a clean 50 ml tube.

    8. Transfer 1 ml aliquots of the sterile 1M DTT solution into 1.7 ml microcentrifuge tubes.

    9. Store at -20°C.

  13. 100 mM DTT (makes 10 ml)

    1. Combine 9 ml of nuclease-free water and 1 ml of sterile 1 M DTT in a 50 ml conical tube.

    2. Vortex thoroughly.

    3. Transfer 1 ml aliquots of the 100 mM DTT solution into 1.7 ml microcentrifuge tubes.

    4. Store at -20°C.

  14. 10× Transcription Buffer (makes 10 ml)

    1. Prepare a 50 ml conical tube containing the reagents in Table 12.

    2. Vortex the solution thoroughly.

    3. Transfer 1 ml aliquots of the 10× transcription buffer to 1.7 ml tubes.

    4. Store at -20°C.


      Table 12. Recipe for 10× Transcription Buffer

      Reagent Stock Conc. Final Conc. For 10 ml
      Nuclease-Free Water - - 4.48 ml
      Tris, pH 8.0, RNase-Free 1 M 0.2 M 2.00 ml
      KCl, RNase-Free 2 M 0.5 M 2.50 ml
      DTT 100 mM 10 mM 1.00 ml
      EDTA, pH 8.0 RNase-Free 500 mM 1 mM 20 ml
      Total Volume 10.00 ml


  15. 20× NTP Solution (makes 0.5 ml)

    Critical: NTP stocks must be prepared using high purity rNTP solutions. I recommend using the High Purity rNTP set from Cytiva Life Sciences (catalog number: 27202501).

    Note: The 20× NTP solution described below limits UTP concentration to promote internal RNA labeling with [α-32P]-UTP. If you use a different nucleotide as a radioactive tracer, you must prepare a separate 20× NTP solution in which the concentration of the nucleotide used for radiolabeling is limited.

    1. Prepare a 1.7 ml microcentrifuge tube containing the reagents in Table 13.

    2. Vortex thoroughly and spin down in a mini centrifuge.

    3. Store at -20°C.


      Table 13. Recipe for 20× NTP Solution

      Reagent Stock Conc. Final Conc. For 500 μl
      Nuclease-Free Water - - 435 μl
      ATP 100 mM 4 mM 20 μl
      GTP 100 mM 4 mM 20 μl
      CTP 100 mM 4 mM 20 μl
      UTP 100 mM 1 mM 5 μl
      Total Volume 500 μl


  16. 5 mg/ml BSA (makes 200 μl)

    1. Add 180 μl of nuclease-free water to a 1.7 ml microcentrifuge tube.

    2. Add 20 μl UltraPureTM BSA (50 mg/ml) to the tube.

    3. Vortex thoroughly and spin down in a mini centrifuge.

    4. Store at -20°C.

  17. 2 mg/ml Rifampicin (makes 10 ml)

    Note: Rifampicin is light sensitive. Rifampicin stock solution should be protected from light using aluminum foil during handling.

    1. Weigh 20 mg of rifampicin in a 1.7 ml microcentrifuge tube.

    2. Dissolve the rifampicin in 1 ml of DMSO and transfer to a 50 ml conical tube.

      Caution: The DMSO stock bottle must be handled in a chemical fume hood.

    3. Pipette 9 ml of DMSO into the conical tube.

    4. Vortex thoroughly.

    5. Transfer 1 ml aliquots of the 2 mg/ml rifampicin solution to 1.7 ml microcentrifuge tubes.

    6. Store at -20°C protected from light.

  18. 1 M Tris-HCl, pH 8.0 (makes 1 L)

    1. Weigh 121.14 g of tris base (MW 121.14 g/mol).

    2. Dissolve the tris base in ~800 ml of Milli-Q water using a magnetic stir plate.

    3. Clean and calibrate the pH meter while the tris dissolves. Rinse the electrode thoroughly with Milli-Q water before inserting it into the tris solution.

      Notes:

      1. It is crucial to use an appropriate electrode to measure the pH of tris solutions. I use the Mettler Toledo S220-Bio SevenCompact Benchtop pH/Ion Meter (Mettler Toledo, S220-Bio).

      2. It is good practice to calibrate the pH meter using fresh standards immediately before you begin preparing solutions.

    4. While measuring the pH of the tris solution, carefully adjust the pH to 8.0 by slowly adding of concentrated HCl while monitoring the pH.

      Note: pH is temperature dependent. The solution should be RT when making final adjustments to the pH.

      Caution: Concentrated HCl is highly corrosive and should be handled using appropriate PPE and in a chemical fume hood.

    5. Transfer the tris solution to a 1 L graduated cylinder and adjust the volume to 1 L with Milli-Q water.

    6. Transfer the tris solution back to the 2 L beaker and turn the stir plate on so that the solution is fully mixed. Verify that the pH is 8.0 once more.

    7. Aliquot 500 ml of 1 M Tris-HCl solution into two 1 L autoclavable media bottles and sterilize by autoclaving for 30 min using the liquid cycle.

      Caution: Media bottle caps must be loose when autoclaving.

    8. Store at RT.

  19. 0.5 M EDTA, pH 8.5 (makes 0.5 L)

    1. Clean and calibrate the pH meter. Rinse the electrode thoroughly with Milli-Q water.

    2. Weigh 93.06 g of Na2EDTA·2H2O (MW 372.24 g/mol).

    3. Mix the Na2EDTA·2H2O with ~400 ml of Milli-Q water using a magnetic stir plate and insert the pH meter electrode into the solution.

    4. Slowly add NaOH pellets while stirring.

      Note: Na2EDTA·2H2O will not dissolve until the solution is ~pH 8.0. Take care not to add too many NaOH pellets at once, or you will overshoot the desired pH.

    5. Once the Na2EDTA·2H2O is fully dissolved and the pH is 8.5, transfer the solution to a 500 ml graduated cylinder and adjust the volume to 500 ml.

    6. Transfer the solution back to the beaker, turn the stir plate on so that the solution is fully mixed. Verify that the pH is 8.5 once more.

    7. Transfer the solution into a 1 L autoclavable media bottle and sterilize by autoclaving for 30 min using the liquid cycle.

      Caution: The media bottle cap must be loose when autoclaving.

    8. Store at RT.

  20. Stop Solution (makes 50 ml)

    1. Prepare a 50 ml conical tube containing the reagents in Table 14.

    2. Vortex thoroughly.

    3. Transfer 10 ml aliquots to 15 ml conical tubes.

    4. Store at -20°C.


      Table 14. Recipe for Stop Solution

      Reagent Stock Conc. Final Conc. For 50 ml
      DEPC-treated Milli-Q Water - - 18.8 ml
      Tris, pH 8.0 1 M 0.6 M 30 ml
      EDTA, pH 8.5 500 mM 12 mM 1.2 ml
      Total Volume 50 ml

Acknowledgments

This work was supported by startup funds from the University at Buffalo Research Foundation (to E.J.S). The protocol is derived from the original research presented in Strobel et al. (2020).

Competing interests

No competing interests are declared.

References

  1. Belogurov, G. A. and Artsimovitch, I. (2019). The Mechanisms of Substrate Selection, Catalysis, and Translocation by the Elongating RNA Polymerase. J Mol Biol 431(20): 3975-4006.
  2. Boudsocq, F., Iwai, S., Hanaoka, F. and Woodgate, R. (2001). Sulfolobus solfataricus P2 DNA polymerase IV (Dpo4): an archaeal DinB-like DNA polymerase with lesion-bypass properties akin to eukaryotic poleta. Nucleic Acids Res 29(22): 4607-4616.
  3. Buenrostro, J. D., Araya, C. L., Chircus, L. M., Layton, C. J., Chang, H. Y., Snyder, M. P. and Greenleaf, W. J. (2014). Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes. Nat Biotechnol 32(6): 562-568.
  4. Core, L. J., Waterfall, J. J. and Lis, J. T. (2008). Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science 322(5909): 1845-1848.
  5. Frieda, K. L. and Block, S. M. (2012). Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. Science 338(6105): 397-400.
  6. Korzheva, N., Mustaev, A., Kozlov, M., Malhotra, A., Nikiforov, V., Goldfarb, A. and Darst, S. A. (2000). A structural model of transcription elongation. Science 289(5479): 619-625.
  7. Marr, M. T. and Roberts, J. W. (1997). Promoter recognition as measured by binding of polymerase to nontemplate strand oligonucleotide. Science 276(5316): 1258-1260.
  8. Mattila, P., Korpela, J., Tenkanen, T. and Pitkanen, K. (1991). Fidelity of DNA synthesis by the Thermococcus litoralis DNA polymerase--an extremely heat stable enzyme with proofreading activity. Nucleic Acids Res 19(18): 4967-4973.
  9. Pan, T. and Sosnick, T. (2006). RNA folding during transcription. Annu Rev Biophys Biomol Struct 35: 161-175.
  10. Pavco, P. A. and Steege, D. A. (1990). Elongation by Escherichia coli RNA polymerase is blocked in vitro by a site-specific DNA binding protein. J Biol Chem 265(17): 9960-9969.
  11. Pupov, D., Ignatov, A., Agapov, A. and Kulbachinskiy, A. (2019). Distinct effects of DNA lesions on RNA synthesis by Escherichia coli RNA polymerase. Biochem Biophys Res Commun 510(1): 122-127.
  12. Selby, C. P. and Sancar, A. (1993). Molecular mechanism of transcription-repair coupling. Science 260(5104): 53-58.
  13. Selby, C. P. and Sancar, A. (1994). Mechanisms of transcription-repair coupling and mutation frequency decline. Microbiol Rev 58(3): 317-329.
  14. Strobel, E. J. (2021). Preparation of E. coli RNA polymerase transcription elongation complexes by selective photoelution from magnetic beads. J Biol Chem 297: 100812.
  15. Strobel, E. J., Lis, J. T. and Lucks, J. B. (2020). Chemical roadblocking of DNA transcription for nascent RNA display. J Biol Chem 295(19): 6401-6412.
  16. Strobel, E. J., Watters, K. E., Nedialkov, Y., Artsimovitch, I. and Lucks, J. B. (2017). Distributed biotin-streptavidin transcription roadblocks for mapping cotranscriptional RNA folding. Nucleic Acids Res 45(12): e109.
  17. Svetlov, V. and Artsimovitch, I. (2015). Purification of bacterial RNA polymerase: tools and protocols. Methods Mol Biol 1276: 13-29.
  18. Tome, J. M., Ozer, A., Pagano, J. M., Gheba, D., Schroth, G. P. and Lis, J. T. (2014). Comprehensive analysis of RNA-protein interactions by high-throughput sequencing-RNA affinity profiling. Nat Methods 11(6): 683-688.
  19. Vassylyev, D. G., Vassylyeva, M. N., Perederina, A., Tahirov, T. H. and Artsimovitch, I. (2007a). Structural basis for transcription elongation by bacterial RNA polymerase. Nature 448(7150): 157-162.
  20. Vassylyev, D. G., Vassylyeva, M. N., Zhang, J., Palangat, M., Artsimovitch, I. and Landick, R. (2007b). Structural basis for substrate loading in bacterial RNA polymerase. Nature 448(7150): 163-168.
  21. Watters, K. E., Strobel, E. J., Yu, A. M., Lis, J. T. and Lucks, J. B. (2016). Cotranscriptional folding of a riboswitch at nucleotide resolution.Nat Struct Mol Biol 23(12): 1124-1131.
  22. Widom, J. R., Nedialkov, Y. A., Rai, V., Hayes, R. L., Brooks, C. L., 3rd, Artsimovitch, I. and Walter, N. G. (2018). Ligand Modulates Cross-Coupling between Riboswitch Folding and Transcriptional Pausing. Mol Cell 72(3): 541-552 e546.
  23. Widom, J. R., Rai, V., Rohlman, C. E. and Walter, N. G. (2019). Versatile transcription control based on reversible dCas9 binding. RNA 25(11): 1457-1469.

简介

[摘要] 位点特异性转录停滞是评估新生 RNA 结构和功能的新兴技术的基础。通过在定义的 DNA 模板位置停止转录延伸,可以从停滞的 RNA 聚合酶 (RNAP) 中展示共转录折叠的 RNA,用于生化操作。大多数转录“障碍”方法使用非共价连接到模板 DNA 的蛋白质阻断来停止转录延伸。我之前开发了一种在化学损伤处阻止大肠杆菌RNAP的策略,该策略扩展了转录障碍技术的全部内容,并能够对停滞的延伸复合物进行复杂的操作。为了促进这种化学转录障碍方法,我开发了一种序列独立的方法,用于使用 PCR 和转移合成制备内部修饰的 dsDNA。在这里,我提出了一个详细的协议,用于化学转录障碍实验的内部修饰 dsDNA 模板的制备和表征。



图文摘要:
使用功能化 DNA 损伤进行精确的转录障碍。


[背景] RNA 在转录过程中从 RNA 聚合酶 (RNAP) 中出现时开始折叠(Pan 和 Sosnick ,2006 年)。因此,我们研究新生 RNA 结构和功能的生物学作用的能力取决于可以评估 RNA 共转录的工具的开发。实现这一目标的一种成功方法是利用三元 RNAP-DNA 模板-新生 RNA 复合物的非凡稳定性在转录延伸复合物 (TEC)停滞的情况下测量和操纵新生 RNA (Buenrostro等人,2014 年;Tome等,2014;Watters等,2016;Strobel等,2017;Widom等,2018)。

多亚基 RNAP 是一种显着的进行性酶,能够将细菌中的多千碱基操纵子和真核基因中的数十千碱基转录为兆碱基(Core等人,2008 年;Belogurov 和 Artsimovitch ,2019 年)。分子力,使持续性转录延伸(Korzheva 。等人,2000; Vassylyev 。等人,2007和2007年b )也呈现出了名的TECs,以解离性一般。例如,当 RNAP 遇到障碍,例如 DNA 结合蛋白或化学 DNA 损伤时,TEC 通常保持完整,直到障碍被移除或终止因子从 DNA 中驱逐 RNAP (Selby 和 Sancar ,1993和1994 ) 。当通过在转录障碍处停止 RNAP在体外构建时,被捕获的 TECs 会持续很长时间。因此,通过转录障碍阻止 RNAP 已成为需要展示新生 RNA 分子的结构和功能研究的首选方法。

使用捕获的 RNAP 来展示 RNA 的高通量方法的发展强调了对多功能转录障碍工具的需求。已经开发了几种通过将 RNAP 与 DNA结合蛋白阻断剂碰撞来阻止转录延伸的阻滞策略: 序列特异性蛋白阻滞剂,例如无催化活性的 EcoRI E111Q突变体(Pavco 和 Steege 1990)和大肠杆菌DNA 复制终止子 Tus (Tome et al. , 2014) ,通过它们各自的识别序列连接到 DNA 模板。链霉亲和素可以使用精确(Frieda 和 Block ,2012)或随机定位(Strobel等,2017)生物素修饰稳定连接到模板 DNA 。dCas9 可以可逆地加载到任意 DNA 序列上,以在多个 DNA 位置顺序停止 RNAP (Widom等人,2019 年)。与蛋白质介导的转录障碍的大量方法相反,尽管 DNA 损伤导致转录停滞这一事实早已确立,但在 DNA 损伤处阻止 RNAP 的方法明显缺乏。我之前通过开发一种使用跨损伤合成制备内部修饰线性 dsDNA 的序列独立方法并表征几种 DNA 修饰的转录障碍特性来解决这一技术差距(Strobel等人,2020 年)。

我的化学转录路障方法以多种方式补充了蛋白质介导的路障策略的特性。首先,与生物素-链霉亲和素阻滞剂一样,化学转录阻滞剂与序列无关,因此与复杂序列库的制备兼容。其次,化学摊位是在最小的全功能的体外转录反应,并因此与不同的实验兼容人的条件。第三,功能化的化学失速位点可以实现原本不可能的 TEC 操作。例如,我之前表明,可以通过从链霉亲和素包被的磁性颗粒中排除来富集在脱硫生物素停滞位点被捕的 TEC。化学转录障碍的主要缺点是随着时间的推移,大肠杆菌RNAP 可以绕过一些 DNA损伤。尽管如此,在许多情况下,病变旁路非常缓慢,因此不会禁止大多数实验:在下面描述的转录反应中,TEC 保留在脱硫生物素-TEG 停滞位点,半衰期约为 600 分钟,而不受阻碍的细菌转录发生在 50 - 100 nt/s。此外,这些被捕获的 TEC 可以在核苷酸耗尽后稳定持续数小时(Strobel等,2020)。

在这里,我提供了用于化学转录障碍的内部修饰线性 dsDNA 模板的制备和表征的详细协议。我首先描述了在寡核苷酸设计过程中必须考虑的因素,并提供一组经过验证的用于 PCR 扩增的序列。然后,我提出了一个使用 PCR 和转移合成制备内部修饰 DNA 的简单方案,并描述了如何使用变性和天然聚丙烯酰胺凝胶电泳评估 DNA 模板质量。最后,我提出了一个单轮体外转录协议,可用于验证 DNA 模板的转录障碍活动。总之,这些协议将使任何具有基本分子生物学专业知识的研究人员能够成功设计和制备内部修饰的 DNA 模板,用于展示来自被捕 TEC 的新生 RNA。

关键字:转录, 核糖核酸, DNA病变, 聚合酶链反应, 跨损伤合成, RNA共转录折叠

 
材料和试剂
 
耗材
1.低保留10 μ升移液管尖端(例如,海王星科学,目录号:2342S3.S)      
2.低保留200 μ升移液管尖端(例如,海王星科学,目录号:2102.S)      
3.低保留1 ,000 μ升移液管尖端(例如,海王星科学,目录号:2372.S)      
4. 200 μ l、0.4 mm 扁平凝胶上样移液器吸头(例如,Laboratory Product Sales,目录号:L113761)      
5. 无核酸酶1.7 ml 微量离心管(例如,Thomas Scientific,目录号:1149K01)      
6. 无核酸酶 2.0 ml 微量离心管(例如,VWR,目录号:20170-170)      
7. 2.0 ml 螺旋盖管,带 O 形圈(例如,实验室产品销售,目录号:L233226)      
8. 0.2 ml 8-Strip PCR 管带圆顶盖(例如,实验室产品销售,目录号:L216380)      
9. Qubit TM检测管(Invitrogen TM ,目录号:Q32856)      
10. 15 ml 锥形管(例如,实验室产品销售,目录号:TR2000)   
11. 20 ml锥形管(例如,实验室产品销售,目录号:TR2003)   
12. 5 ml 血清移液管(例如,Laboratory Product Sales,目录号:L310500)   
13. 10 ml 血清移液管(例如,Laboratory Product Sales,目录号:L311000)   
14. 25 ml 血清移液管(例如,Laboratory Product Sales,目录号:L312510)   
15.称重船(任何来源)   
16. 10 ml 注射器(例如BD,目录号:302995)   
17. 60 ml 注射器(例如BD,目录号:309653)   
18. 20G 1½” 针(例如,BD,目录号:305176)   
19. 0.2 μm 聚醚砜 (PES) 注射器过滤器,无菌(例如,VWR 目录号:28145-501)   
20. 150 毫米培养皿(例如,康宁目录号:430599)   
21.小型 1 层轻型纸巾擦拭器(例如,VWR,目录号:82003-820)   
22.大型 1 层轻型纸巾擦拭器(例如,VWR,目录号:82003-822)   
23.塑料背衬工作台纸(例如,Fisher Scientific ,目录号:14-127-47)   
24.丁腈手套   
25.凡士林凡士林原味   
26. Rain-X 原装玻璃防水剂   
27.大型活页夹(例如,Staples 2” Binder Clips,Staples,目录号:10669)   
28. AEP 30510400 ZipSafe Sealwrap,18”    × 2000'(亚马逊)
29.剃须刀片   
30.铝箔   
31.洗洁精   
32.清洗测序凝胶板的塑料刷   
 
试剂
注意:化学品应为分子生物学/生物技术级。
无核酸酶水(例如,Invitrogen公司TM ,目录号:10977015),小号撕在室温erature (RT)
毫- Q水,小号撕RT
去离子水,小号撕RT
焦碳酸二乙酯(DEPC),> 97%,(Thermo Scientific的TM ,AAJ14710AC),小号撕在-20 ℃下
Ñ OTE :手柄DEPC在化学通风橱中。
三(1 M),pH为8.0,无RNase (Invitrogen公司TM ,目录号:AM9855G),小号撕在室温
EDTA(0.5 M),pH为8.0,无RNase (Invitrogen公司TM ,目录号:AM9260G),小号撕在室温
氯化钾(KCl)中(2 M),无RNA酶(Invitrogen公司TM ,目录号:AM9640G),小号撕在室温
氯化镁(氯化镁2 ),1M,无RNase (Invitrogen公司TM ,目录号:AM9530G),小号撕在室温
乙酸钠(的NaOAc)(3 M),pH 5.5的无RNA酶(Invitrogen公司TM ,目录号:AM9740),小号撕在室温
1 ×的Tris-EDTA(TE)溶液(10mM的Tris pH值7.5,0.1mM的EDTA),(例如,集成DNA技术,目录号:11-05-01-05),小号撕在室温
Ť RIS库(例如,VWR,目录号:97061-794),小号撕在室温
EDTA,二钠盐,二水合物(例如,Invitrogen公司TM ,目录号:15576028),小号撕在室温
盐酸(HCl)(例如,Sigma-Aldrich公司,目录号:320331),小号在RT撕带通风橱下的其它酸。
注意:盐酸具有很强的腐蚀性,必须在化学通风橱中处理。
氢氧化钠(NaOH)(例如,Sigma-Aldrich公司,目录号:S8045),小号在RT撕下与其它碱
注意:氢氧化钠具有很强的腐蚀性。
硼酸(例如,Fisher Scientific公司,目录号:BP168-500),小号撕在室温
十二烷基硫酸钠的钠盐(SDS)(例如,Millipore公司,目录号:7910-500GM),小号撕在室温
二硫苏糖醇(DTT)(例如,金生物技术,目录号:DTT100),小号撕desic Ç在-20 ated ℃下
100%的乙醇(200标准强度)(例如,DECON实验室,目录号:2716),小号撕在室温
异丙醇(例如,Sigma-Aldrich公司,目录号:I9516-4L),小号撕在室温
甘油(例如,Sigma-Aldrich公司,目录号:G5516-4L),小号撕在室温
苯酚:氯仿+ Tris缓冲液(例如,Thermo Scientific的TM ,目录号:17909),小号撕4 ℃下
注意:苯酚:氯仿应在化学通风橱中处理。
OmniPur甲酰胺,去离子(例如,Millipore公司,目录号:4650-500ML),小号撕4 ℃下
注意:甲酰胺应在化学通风橱中处理。
二甲亚砜(DMSO)(例如,Fisher Scientific公司,目录号:D128-500 ),小号撕在室温
注意:二甲基亚砜应在化学通风橱中处理。
过硫酸铵(APS)(例如,Sigma-Aldrich公司,目录号:A3678-100G),小号撕在室温
TEMED(四甲基乙二胺)(例如,Bio-Rad公司,目录号:1610801),小号撕在室温
溴酚蓝(例如,Bio-Rad公司,目录号:1610404),小号撕在室温
二甲苯青FF(例如,Bio-Rad公司,目录号:1610423),小号撕在室温
溴化乙锭,10毫克/毫升(例如,Invitrogen公司TM ,目录号:15585011),小号撕在室温
注意:按照机构指南处理溴化乙锭。
快速加载紫色100 bp的DNA梯(New England Biolabs公司,目录号:N0551L),小号撕在室温
低浓度范围的单链RNA梯(新英格兰生物实验室,目录号:N0364S),小号撕RT
SYBR金核酸染色剂(Invitrogen公司TM ,目录号:S11494),小号撕在-20 ℃下
脱氧核苷酸(的dNTP)混合溶液(New England Biolabs公司,目录号:N0447L),小号撕在-20 ℃下
的dNTP集(100毫摩尔)(Invitrogen公司TM ,目录号:10297018) ,小号撕在-20 ℃下
2-氨基的dATP(TriLink是Biotechnologies公司,目录号:N-2003),小号撕在-20 ℃下
5丙炔基-的dCTP(TriLink是Biotechnologies公司,目录号:N-2016),小号撕在-20 ℃下
高纯度的rNTP集,100mM的解决方案(ATP,CTP,GTP,UTP)(Cytiva生命科学,目录号:27202501),小号撕在-20 ℃下
超纯TM BSA(Invitrogen公司TM ,目录号:AM2616 ),小号撕在-20 ℃下
利福平(金生物技术,目录号:R-120-10),小号撕dessicated在-20 ℃下
GlycoBlue TM共沉淀(Invitrogen公司TM ,目录号:AM9516),小号撕在-20 ℃下
量子位TM的dsDNA HS测定试剂盒(Invitrogen公司TM ,目录号:Q32854),š OME组分储存在4 ℃下
量子位TM的dsDNA BR测定试剂盒(Invitrogen公司TM ,目录号:Q32853),š OME组分储存在4 ℃下
SeaKem GTG TM琼脂糖(龙沙,目录号:50074),小号撕在室温
关键:琼脂糖必须是准备级的。
UreaGel 19:1变性凝胶系统(国家诊断,目录号:EC-833),小号撕在室温
注意:含有丙烯酰胺。丙烯酰胺是一种神经毒素,应谨慎处理。
ProtoGel(30%)(国家诊断,目录号:EC-890),小号撕在室温
注意:含有丙烯酰胺。丙烯酰胺是一种神经毒素,应谨慎处理。
QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,目录号:28106),小号撕在室温
QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,目录号:28706),小号撕在室温
内部修饰的寡核苷酸(集成DNA技术,š EE表1)
UTP,[ α- 32 P] -3000次/毫摩尔10毫居里/毫升(珀金埃尔默,目录号:BLU007H) ,小号撕在-20 ℃下
注意:[ α- 32 P]-UTP 必须按照机构辐射安全协议进行处理。
 
酵素
Q5 高保真DNA聚合酶(New England Biolabs公司,目录号:M0491L ),小号撕在-20 ℃下
泄 (外切)DNA聚合酶(New England Biolabs公司,目录号:M0257L) ,小号撕在-20 ℃下
硫化叶DNA聚合酶IV(New England Biolabs公司,目录号:M0327S) ,小号撕在-20 ℃下
耐热切核酸酶I (新英格兰生物实验室,目录号:M0568L) ,小号撕在-20 ℃下
大肠杆菌RNA聚合酶全酶(New England Biolabs公司,目录号:M0551S) ,小号撕在-20 ℃下
注意:大肠杆菌 RNA 聚合酶核心和 70可以通过完善的方案(Marr 和 Roberts ,1997 年;Svetlov 和 Artsimovitch ,2015 年)进行纯化,并用于重组全酶。
 
准备好的解决方案(参见食谱部分)
DEPC 处理的 Milli - Q Water
10 mM Tris-HCl,pH 8.0
10 mM 热稳定性增强 dNTP 溶液
1 × Tris-硼酸盐-EDTA 缓冲液
70% 乙醇
10% 安全数据表
6 × DNA 上样染料(仅 +SDS、XC)
10% APS
1 ×甲酰胺负载染料
3 × Tris-硼酸盐-EDTA 缓冲液
6 × DNA 加载染料(非变性)
1 M 数字电视
100 毫米 DTT
10 ×转录缓冲液
20 × NTP 解决方案
5 毫克/毫升 BSA
2 毫克/毫升利福平
1 M Tris-HCl,pH 8.0
0.5 M EDTA,pH 8.5
停止解决方案
 
设备
 
高压釜
通风柜
-20 °C和 -80 °C 冰柜(任何来源)
冰箱 (4 °C)(任何来源)
2微升,20微升,200微升,和1 ,000微升微量(任何来源)
移液器控制器(例如,Drummond,目录号:4-000-101)
用于 1.7 ml、15 ml 和 50 ml 试管的塑料管架(任何来源)
实验室计时器(例如,Traceable  ,目录号:5004CC)
冰桶(例如,SCIENCEWARE  ,目录号:M16807-4002)
锥形烧瓶(500 毫升,4升)(任何来源)
烧杯(1 L、2 L)(任何来源)
可高压灭菌的培养基瓶(500 毫升、1 升和2 升)(任何来源)
量筒(10 ml、50 ml、200 ml、0.5 L、1 L 和 2 L)(任何来源)
塑料 250 毫升烧杯(任何来源)
4 L 聚丙烯瓶(任何来源)
20 L carboy(任何来源)
微波(任何来源)
Vortex(例如,Scientific Industries,目录号:SI-0236)
热循环仪(例如,Bio-Rad S1000 w/96-Deep Well Reaction Module,目录号:1852197)
关键:100 μl PCR 需要深孔热循环仪。如果 100 μl超过了热循环仪的最大样品体积,请将反应分装到额外的 PCR 管中。
冷冻微量离心机(例如,Eppendorf 5424 R,目录号:5406000046)
微型离心机(例如,VWR,目录号:76269-064)
数字干浴(例如,Thermo Scientific TM ,目录号:88870001)
Lab Armor TM Beads(Gibco TM ,目录号:A1254301)
用于 1.7 ml 管的铝块(例如Thermo Scientific TM ,目录号:88880130)
铝加热/块,可容纳 96 × 0.2 ml 管(Sigma-Aldrich,目录号:Z740270-1EA)
模拟温度计(例如,VWR,目录号:89095-600)
数字温度计(例如,VWR,目录号:89094-750)
Qubit TM 4 荧光计(Invitrogen TM ,目录号:Q33238)
摇摆平台(例如,康宁,目录号:6703)
旋转器(例如,ATR,Rotamix转子RKVSD和翻滚端杆,目录号小号:10101和10110)
pH计(例如,Mettler Toledo,S220-Bio,目录号:30019031)
关键:pH计电极必须是兼容牛逼RIS解决方案。
天平(例如,Ohaus,目录号:30253007RM)
分析天平(例如,Mettler Toledo,目录号:30029076)
Flat Spatula(例如,VWR,目录号:82027-532)
称重抹刀(任何来源)
搅拌板(例如,Corning PC-610D,目录号:6795620D)
磁力搅拌棒(例如,VWR,目录号:58948-025)
水平凝胶装置(例如,Horizon 11-14 Midi Gel System,Gel Company,HZ1114)
注意:梳子应至少容纳 50 μl。
Mini-PROTEAN Tetra Cell,2 凝胶,用于 1.0 mm 手工凝胶(Bio-Rad,目录号:1658003FC)
测序凝胶装置(例如,BRL Model S2 ;Gel Company,目录号:S2-3040)
注意:垫片和梳子的厚度应为 0.4 毫米。
基本电源(例如,Bio-Rad,目录号:1645050)
高压电源(例如,Bio-Rad,目录号:1645056)
UV Transilluminator(例如,UVP目录号:UV95045901)
注意:切勿将眼睛或皮肤暴露在紫外线辐射下。
Dark Reader Blue light Transilluminator(Clare Chemical,目录号:DR89X)
纸板曝光盒(例如,Sigma-Aldrich,目录号:E-9135,已停产)
存储荧光屏,35 × 43 cm(Cytiva Life Sciences,目录号:28956476)
存储荧光屏图像橡皮擦(Cytiva Life Sciences,目录号:29187190)
Typhoon Biomolecular RGB Biomolecular Imager(Cytiva Life Sciences,目录号:29187194)
用于高能 β 辐射的丙烯酸屏蔽
注意:在使用32 P进行实验时,我发现以下项目很有用。
立式台式 Beta 屏蔽,3/8” 厚(例如,RPI,目录号:BR-201)
24 位 Beta Block(例如,实验室产品销售,目录号:172644)
带冰室的样品 Beta 盒(例如,Fisher Scientific,目录号:S29137)
亚克力垃圾箱(例如,ThermoScientic TM ,目录号:67459024)
大型垂直丙烯酸屏蔽(Denville Scientific,目录号 S0260-S)
中型垂直丙烯酸屏蔽(Denville Scientific,目录号 S0180-S)
大型丙烯酸存储容器(例如,Mitchell Plastics,目录号:RP-400)
小型亚克力储存容器(例如,IBI Scientific,目录号:RB-100)
移液器吸头处理盒(Thomas Scientific,目录号:1216J05)
 
程序
 
程序概述
我制备内部修饰线性 dsDNA 的程序包括三个主要步骤(图 1):首先,通过 PCR 扩增将内部修饰引入 DNA 模板(程序 C)。PCR 扩增产生截短的 DNA 产物,因为停止转录延伸的 DNA 修饰也可能停止通常用于 PCR 的 DNA 聚合酶的延伸。接下来,使用易位聚合酶Sulfolobus DNA Polymerase IV(程序 D)合成截短的 DNA 链的其余部分。最后,纯化完成的 dsDNA 产物以去除多余的寡核苷酸和用于 PCR 扩增的模板 DNA(程序 E 或程序 F)。然后对纯化的 DNA 进行三个质量控制步骤,以验证跨损伤合成的效率(程序 G)、dsDNA 的纯度(程序 H)以及作为转录障碍的内部修饰的活性(程序 I)。得到的内部修饰的线性 dsDNA 然后准备用于共转录显示来自被捕的 TECs 的新生 RNA。
 
 
图1 。酶促制备内部修饰 dsDNA 的过程概述。使用内部修饰的引物进行 PCR 可产生具有一条截短链的 DNA 产物。然后使用跨损伤 DNA 合成与Sulfolobus DNA 聚合酶 IV合成截短的链,该酶绕过内部修饰位点和 Vent  (exo -)。然后在用作体外转录实验的 DNA 模板之前,对得到的内部修饰的 dsDNA 进行纯化和质量评估。
 
引发位点和寡核苷酸序列
成功的 DNA 模板制备取决于 PCR 引发位点的精心设计。我的标准协议使用两个恒定的 DNA 区域,这些区域已经过验证可进行有效扩增,而没有可检测的副产物(表 1)。
 
表 1. 用于制备线性 DNA 模板的引发位点和引物。每个寡核苷酸与其相应接头退火的区域都标有下划线。'/iMod/' 表示内部 DNA 修饰的位置。经验证的修饰包括脱硫生物素-TEG 、生物素-TEG、etheno-dA 和 UniLink TM氨基修饰剂(图 2)。
 
1 P RA1启动子(Strobel , 2021)是λ P R和 T7A1 启动子的衍生物,可以使用 PRA1.F 引物代替 LPR.F 代替λ P R。
关键:订购 100 nmol 或更大规模的 LPR.F、PRA1.F、dRP1iMod.R 和 dRP1.R 引物,使用 HPLC 纯化。寡核苷酸可以来自任何来源。我使用集成 DNA 技术。
 
设计 PCR 引物序列。
我建议使用所述序列在表1中,已在下面的程序被广泛验证使用。如果您的应用需要不同的序列,请使用寡核苷酸设计工具,例如Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer TM来验证您的序列不包含重要的二级结构,并且由于稳定的同二聚体或异二聚体而不太可能产生引物二聚体。理想情况下,引物的长度应小于 60 nt,内部修饰的寡核苷酸在修饰和 5' 端之间应有 ~30 nt,以确保最终 dsDNA 产品中修饰位点下游的双链稳定性。每个引物与 PCR 接头退火的区域应具有 ~50% 的 GC 含量。Tm 会随所用的聚合酶而变化;当使用Q5  DNA 聚合酶时,我的目标是在 65 °C 下退火引物。在新英格兰生物实验室的Tm计算器是使用NEB聚合酶时评估的退火温度是有用的。
  根据预期的应用,可以通过多种方式将引发位点添加到 PCR 模板 DNA 中。首先,如果 PCR 模板是质粒 DNA,则在克隆过程中 DNA 序列中可以包含引物位点。类似地,如果 PCR 模板是合成的寡核苷酸,则可以在寡核苷酸合成过程中引入引发位点(总共 52 个核苷酸)。还可以通过修改用于制备基因组或转录组序列库的现有协议,将引发位点附加到细胞来源的 DNA 或 RNA。但是,这些应用程序超出了本协议的范围,它们的实现将需要特定于应用程序的专业知识。
 
选择内部修改。我已经验证了与此协议一起使用的四个内部 DNA修改(图 2),并在下面描述了它们的特性。
 
 
图2 。经验证的内部 DNA 修饰。经验证的 DNA 修饰包括 (A) 脱硫生物素-TEG、(B) etheno-dA 和 (C) UniLink TM氨基修饰剂。生物素-TEG 也已被验证可用于以下方案(Strobel , 2021) 。
 
脱硫生物素-TEG/生物素-TEG :脱硫生物素(图 2A)是生物素类似物,可通过添加游离生物素从链霉亲和素中洗脱。Sulfolobus DNA 聚合酶 IV 主要绕过脱硫生物素-TEG,而不掺入与修饰位点相对的核苷酸。脱硫生物素-TEG 是一个有效的转录障碍:约 100% 的 TECs 停留在修饰位点上游 1 nt,在 500 μM NTPs存在下,约 87% 的 TECs 在 32 分钟后保留在停滞位点(Strobel等人,2020)。当在脱硫生物素-TEG 障碍处停滞时,RNAP 会阻止脱硫生物素与链霉亲和素结合,从而能够根据 TEC 沿 DNA 模板的位置对其进行富集。我还使用内部生物素-TEG 修饰(Strobel ,2021)执行了以下协议。
Etheno-dA:Etheno-dA(图 2B)是一种腺苷类似物,其中腺嘌呤的 N1 和 N6 之间的乙烯桥阻止氢键。当绕过 etheno-dA 修饰时,硫叶菌DNA 聚合酶 IV 倾向于在修饰位点对面掺入一个 dA 核苷酸。普波夫等人。(2019)表明,etheno-dA 是一种使用 TEC 支架系统的有效转录阻断剂。我对 etheno-dA 修饰的 DNA 模板的分析与 Pupov等人的发现一致。(2019 年):~100% 的 TECs 在修饰位点上游 1 nt 处停滞,并且在 500 μM NTPs存在下 32 分钟后~84% 的 TECs 保留在停滞位点(Strobel等,2020)。Etheno-dA 可用作功能惰性的化学转录障碍。
Uni-Link TM氨基改性剂:Uni-Link TM氨基改性剂(图 2C)包含一个与六碳间隔基相连的伯胺,旨在保留磷酸二酯骨架中的天然核苷酸间距。当绕过Uni-Link TM氨基修饰剂时,硫叶菌DNA 聚合酶 IV 在约 50% 的时间内在修饰位点对面掺入了一个 dA 核苷酸。相比于脱硫生物素-TEG和亚乙烯基-DA,所述的Uni-链路TM氨基-修饰是弱转录路障:尽管的TECs的〜100%最初失速在修饰位点,RNA聚合酶可以绕过失速部位有效地使得仅〜40在存在 500 μM NTP 的情况下,32 分钟后 TEC 的百分比保留在停滞位点(Strobel等,2020)。尽管如此,游离氨基在某些实验中可用于功能化 DNA 模板。
收到上述寡核苷酸后,溶解冻干的寡核苷酸并准备工作库存:
在小型离心机中将寡核苷酸管离心几秒钟,以确保冻干的寡核苷酸位于管底部。
加入1 × TE,pH 7.5中,在寡核苷酸溶解到100浓度μ中号。
注意:本协议中使用的寡核苷酸是关键且昂贵的试剂。出于这个原因,我建议使用商业无核酸酶 TE 来重悬初级寡核苷酸库存,以便标准化存储和处理。
在小型离心机中彻底摇动并旋转溶解的寡核苷酸。
制备10 μ通过组合为180 M的工作引物库存微升10毫摩尔的Ť RIS-HCl中,用20微升的100μpH 8.0的中号寡核苷酸库存在2 ml螺旋帽管与O形环。在小型离心机中涡旋并旋转工作底漆。
关键:将工作底漆储存在带有 O 形圈的螺帽管中,以减少交叉污染的可能性。
将 100 μ M 和 10 μ M 引物库存储存在 -20 °C。
关键:在解冻引物库存时,混合寡核苷酸溶液,然后在小型离心机中旋转管,以便没有液体留在盖子上。
 
PCR扩增
使用修饰的引物 dRP1iMod.R(表 1)通过 PCR 掺入内部 DNA 修饰,以产生在 DNA 修饰位点下游具有 5' 悬垂的 dsDNA(图 1)。
注意:通过用未修饰的 dRP1.R 引物替换dRP1iMod.R,可以在单独的 500 μl PCR 中制备未修饰的模板版本。未修饰的模板可以与内部修饰的模板平行制备,使用相同的程序,只是省略了程序 D:Translesion DNA Synthesis。未修饰的 DNA 模板是程序 G、H 和 I 中描述的 QC 分析的有用对照。
注意:我的实验室通常使用 Q5 或Q5U  DNA 聚合酶进行 PCR。如果需要,可以替换其他聚合酶。有关其他信息,请参阅注释 2。
 
1.准备620微升的Q5 在冰上1.7 ml离心管PCR主混合物(表2)。按表 2 中列出的顺序添加每种试剂并按如下方式混合:      
注意:当使用程序 F 纯化 DNA 模板时,如果需要,可以缩小 PCR 规模,因为样品回收效率很高。我的实验室通常进行的最小规模制备使用 200 μl 的初始Q5 PCR 。
加入 Q5 反应缓冲液后,在小型离心机中涡旋并离心预混液。
添加除Q5  DNAP之外的所有试剂后,再次涡旋和离心预混液。
添加Q5  DNA p olymerase并轻轻混合完成的米,通过移液混合翠菊。
 
表 2. Q5  PCR 的反应预混液。Q5  PCR预混液基于新英格兰生物实验室使用 Q5 高保真 DNA 聚合酶进行PCR 的协议。
 
1标准 dNTP 溶液,分别含有 10 mM dATP、dGTP、dTTP 和 dCTP。
2用于 PCR的DNA 模板可能因应用而异。相应地调整添加的音量。
 
2.将 100 μl反应体积分装到 6 个 200 μl薄壁PCR 管中。      
关键:如果热循环仪不能容纳 100 μl反应,请使用较小的等分试样。
3.开始表 3 中所示的热循环方案。一旦热循环仪盖子完全加热,将反应放在热循环仪模块上。      
表 3. PCR 扩增的热循环方案。表 2 中描述的 PCR 的热循环协议。始终使用设置为105 °C的加热盖执行 PCR 。如果使用上述引物以外的引物或Q5  High-Fidelity DNA 聚合酶以外的 DNA 聚合酶,请调整退火温度。调整延伸时间以考虑 DNA 模板的长度。最后保持在 10 °C,以减少能耗并延长热循环仪的寿命。
 
1根据需要调整退火温度。我建议使用NEB Tm 计算器来确定退火温度。
 
4.热循环完成后,将反应置于冰上。      
5.使用 Qubit TM dsDNA HS 检测(表 4)量化 PCR 产量,以确保 PCR 为下游处理步骤产生足够的 DNA。将样品浓度乘以 500(五个反应体积,代表用于跨病变合成的五个反应)以估计 PCR 总产量。产量可能因 DNA 模板长度和组成而异;对于参考,验证该协议时使用的 121 bp DNA 模板通常由 Qubit测量~10 ng/ μl,估计总共~5 μg 输入 DNA 用于后续步骤。这可能是对 DNA 数量的低估,因为最初的 PCR 产物包含在Qubit TM dsDNA HS 检测中无法有效检测到的 5' ssDNA 悬垂。      
表 4. Qubit TM dsDNA 检测方案。为方便起见,此处提供了 Qubit TM dsDNA HS 和 BR 检测方案。该协议是用一般术语编写的,包括这两种检测。有关更多信息,请参阅Qubit TM 4 荧光计、Qubit TM dsDNA HS 检测试剂盒和Qubit TM dsDNA BR 检测试剂盒用户指南。
 
1 Qubit TM标准品必须为每次测定新鲜制备。
 
PCR纯化和吨ranslesion DNA合成
程序 C 产生具有 5 '突出端的截短 dsDNA 。使用硫叶菌DNA 聚合酶 IV进行的跨损伤 DNA 合成填补了这一突出端,使 DNA 模板完全双链(图 1)。程序 C 的 PCR 产物首先使用离心柱试剂盒进行纯化,以交换反应缓冲液并去除 dNTP。无论使用哪种 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增,该净化步骤都可确保使用Sulfolobus DNA Polymerase IV进行跨损伤合成的最佳反应条件。
 
净化六个100微升使用的PCR QIAquick PCR纯化试剂盒,其中将交换反应缓冲液和贫化的dNTP(小号EE注2):
将每 100 μl PCR转移到相应的 1.7 ml 微量离心管中。
向每个 PCR 中添加 500 μl Buffer PB。彻底涡旋并在小型离心机中离心。
将每个样品应用于单独的 QIAquick 离心柱。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心1 分钟。丢弃流过。
向每列应用 750 μl Buffer PE 。
C将样品以 18,000 × g和 4° C离心1 分钟。丢弃流过。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心3 分钟以去除残留液体。
将柱转移到清洁的 1.7 ml 微量离心管中。
对于六列中的五列,应用 50 μl Buffer EB。这些样品将汇集用于跨损伤合成。对于第六列,应用 30 μl Buffer EB。这将是变性 PAGE QC(程序 G)的阴性对照。
关键:始终使用缓冲液 EB 进行洗脱。不要用水洗脱。DNA 必须保持缓冲状态。见注 1b。缓冲液 EB 是 10 mM T r is-HCl,pH 8.5。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心1 分钟以洗脱 DNA。
将洗脱的样品以 30 μl 体积储存在 -20°C,以用于程序 G。
将在 50 μl 体积中洗脱的五个样品汇集到 1.7 ml 微量离心管中。
通过将 200 μl 转移到新的 1.7 ml 微量离心管中,调整移液器使其几乎不吸出剩余样品,然后转移剩余体积,估计洗脱样品的体积。样品体积将用于步骤 D5。
在冰上的 1.7 ml 微量离心管中制备 500 μl 转移合成反应(表 5)。按表 5 中列出的顺序添加每种试剂并按如下方式混合:
加入 ThermoPol  Buffer 后,在小型离心机中涡旋并离心预混液。
加入纯化的 PCR 后,再次涡旋和旋转主混合物。
添加Vent  (exo-) DNA 聚合酶和硫化叶DNA 聚合酶 IV,并通过移液轻轻混合完成的主混合物。
注意:虽然硫化叶DNA聚合酶IV独自是足以完成跨损伤合成反应,包括通风口(外切)DNA聚合酶可以提高DNA合成的超过内病变(保真度小号EE注3)。
 
表 5. 用于转移损伤 DNA 合成的反应预混液。Translesion DNA 合成主混合物用于制备规模的 translesion 引物延伸。
 
1加入无核酸酶的水,使包括所有试剂在内的总反应体积为 500 μl。
2 Translesion 合成可以使用标准 dNTP 或提高热稳定性的 dNTP 进行。标准 dNTP 适用于大多数应用。当下游方案需要长时间加热至高温 (>65°C) 时,热稳定性增强 dNTP 可用作防止 DNA 末端磨损的保护措施。
3见为的组合物配方3吨hermostability增强dNTP溶液。
4见注 3。
 
将 100 μl反应体积分装到五个薄壁 200 μl PCR 管中。
启动表 6 中所示的热循环仪协议。一旦模块温度为 55 °C,将反应放在热循环仪上,然后将热循环仪推进到下一步。
表 6. 跨损伤 DNA 合成的热循环方案。Translesion 合成反应在热循环仪中在 55°C 下进行一小时,加热盖设置为 105°C。的最终保持为12 ℃,以减少能量消耗,延长热循环仪的寿命。
 
转移合成后,必须使用程序 E(琼脂糖凝胶纯化)或程序 F(外切核酸酶 I 清除)纯化完整的 dsDNA。如果不能立即进行纯化,反应可以在-20°C 下保存。
 
纯化选项 1:已完成的 dsDNA 模板的琼脂糖凝胶纯化
当质粒 DNA 用作 PCR 扩增的模板(程序 C)时,需要进行凝胶纯化以去除质粒 DNA 和任何多余的引物。如果使用 ssDNA 寡核苷酸作为 PCR 扩增的模板,则可以使用程序 F(纯化选项 2:耐热外切酶 I 清理)来纯化 dsDNA 转录模板,而不是使用琼脂糖凝胶提取。
1.将 5 个100 μl转移合成反应等分试样合并到 1.7 ml 微量离心管中。       
2.将50 μl 3M 醋酸钠(pH 5.5 )和 1 ml 冷的 100% 乙醇添加到合并的样品中。通过涡旋和倒置管彻底混合样品。       
3.通过将样品在 -20°C 下过夜或在 -80°C 下冷却 30 分钟来沉淀 DNA。       
4.当样品充分冷却后,倒入含有 0.5 μg/ml 溴化乙锭的 1 × TBE、1% 琼脂糖凝胶。使用每孔至少可容纳 50 μl 的凝胶梳。       
关键:使用制备级琼脂糖(如 SeaKem GTG 琼脂糖)进行凝胶纯化。
关键:凝胶必须含有溴化乙锭,以便在凝胶运行时对 DNA 进行染色。
注意:溴化乙锭应根据机构指南进行处理和处置。
5.将样品以 18,000 × g和4°C离心30 分钟以沉淀沉淀的 DNA。       
6.通过移液吸出并弃去上清液。小心避免颗粒。       
提示:要精确吸取大量上清液,可将 10 μl移液器吸头装入 1,000 μl移液器吸头的末端。这可以通过精确控制实现 ~1 ml 的抽吸。
7.向样品中加入 1 ml 冷的 70% 乙醇,轻轻颠倒试管数次。不要移动颗粒。       
8.将样品以 18,000 × g和4°C离心2 分钟。       
9.通过移液吸出并弃去上清液。       
10.将样品离心几秒钟以减慢残留的上清液。   
11.通过移液吸出并丢弃残留的上清液。   
12.用纸巾盖住开口管并将其放在长凳上晾干几分钟。   
13.组装并用足够的 1 × TBE填充水平凝胶罐以覆盖琼脂糖凝胶。   
14.用 30 μl的 10 mM重悬沉淀    Ť RIS-HCL,pH 8.0中。
关键:始终将沉淀重悬在 10 mM T ris-HCl,pH 8.0 中。不要在水中重新悬浮颗粒。样品必须保持缓冲d.见注 1b。
15.向样品中加入 6 μl 6 × DNA Loading Dye(+SDS,仅 XC)并移液混合。   
16.将样品装入琼脂糖凝胶并在 100 V 下运行凝胶1 - 2 小时。   
注意:因为样品含有几微克 DNA,当溴化乙锭与 DNA 共同迁移时,红色条带应该变得可见(图 3A)。这使得凝胶提取能够在不将 DNA 暴露于任何紫外线下的情况下进行。
 
 
图3 。无紫外光的 DNA 条带切除。A. 由于溴化乙锭与凝胶中的大量 DNA 共同迁移,因此 PCR 产物在可见光下可以看到红色条带。B. 在 PCR 产物被切除后,在紫外透射仪上观察 (A) 中的凝胶以评估 PCR 和条带切除的质量。未检测到副产物。
 
17.不要将凝胶暴露在紫外线下,用干净的刀片切下 PCR 产物(图 3)。   
18.修剪凝胶切片以去除尽可能多的琼脂糖。   
关键:去除多余的琼脂糖可提高 DNA 产量和质量。
19.用 2.0 ml 试管称量天平的皮重。将凝胶切片加入 2.0 ml 管中,称重凝胶切片,并记录质量。凝胶切片的质量将在下面的步骤 E21a 和 E21b 中使用。   
20.在紫外透照仪上观察凝胶以确认条带被精确切除并评估是否存在任何副产物(图 3B)。   
21.使用 QIAquick Gel Extraction Kit 从切下的凝胶切片中回收 DNA。使用以下协议,其中包括制造商推荐的每个可选步骤,并降低凝胶熔解温度以最大限度地减少 DNA末端磨损的可能性:   
注意:有关更多信息,请参阅Qiagen QIAquick 凝胶提取试剂盒快速启动方案。
如果凝胶切片的重量超过 400 毫克,请将其分成几个 2.0 毫升的管,使每管含有 <400 毫克的凝胶。
将 3 倍体积的缓冲液 QG 添加到 1 倍体积的凝胶(1 毫克凝胶 ~1微升)中。
在 30 °C 下孵育样品,偶尔涡旋直到凝胶片溶解。
关键:凝胶切片在30 °C 下融化,以最大限度地减少 DNA 模板末端磨损。
向样品中加入 1 凝胶体积的异丙醇。颠倒管子并在小型离心机中旋转以进行混合。
将 700 μl样品加入 QIAquick 离心柱并以 18,000 × g和4°C离心1 分钟。丢弃流过并重复,直到应用了整个样品。
向柱中加入 500 μl Buffer QG,并以18,000 × g和4°C离心1 分钟。丢弃流过。
向柱中加入 750 μl Buffer PE,并以18,000 × g和4°C离心1 分钟。丢弃流过。
将样品以18,000 × g和4°C离心3 分钟,以减少残留液体。
将色谱柱放入干净的 1.7 ml 微量离心管中。
将 30 μl 10 mM T ris-HCl,pH 8.0 应用到 QIAquick 柱的中心。
关键:始终使用 10 mM T ris-HCl,pH 8.0 进行洗脱。不要用水洗脱。见注 1b。
将色谱柱以18,000 × g和4°C离心1 分钟。
将洗脱的样品转移到干净的 1.7 ml 微量离心管中。
22.使用 Qubit TM dsDNA BR Assay Kit量化 DNA 模板浓度(表 4)。   
23.将 DNA 浓度从 ng/ μl转换为 μM。典型的制备会产生 30 μl 浓度介于0.75 μM 和 1.25 μM之间的 DNA 。   
提示:Promega 有一个基于网络的工具,用于将微克 DNA 转换为 pmol DNA。输入以碱基对为单位的 DNA 长度和1 μl样品中 DNA 的 μg 数,以 pmol/μl 计算样品浓度;pmol/μl 等于 μM。
24.准备200微升的50nM的工作原液为每个模板通过稀释初级股票于10mM Ť RIS-HCL,pH 8.0中。初级股票和工作股票都应储存在 -20°C。   
关键:始终使用 10 mM T ris-HCl,pH 8.0制备工作库存。不要用水。DNA 必须保持缓冲状态,以防止修饰位点下游的双链体磨损。见注 1b。
 
纯化选项 2:不耐热外切核酸酶 I 清理
当使用 ssDNA 寡核苷酸作为模板进行 PCR 扩增(程序 C)时,可以使用不耐热外切核酸酶 I (exoI) 降解多余的引物并使用 PCR 纯化试剂盒更换反应缓冲液来纯化最终的 dsDNA 产物。这种替代纯化方案产生的 DNA 模板大约是琼脂糖凝胶纯化的两倍,因此不需要那么多的 DNA 输入(注 1c)。然而,不耐热 exoI 清除程序的成功取决于 PCR 的特异性,因为它不选择 DNA 大小。
使用QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化5 个 100 μl跨病变合成反应,该试剂盒会消耗 dNTP 和酶:
关键:硫叶菌 DNA 聚合酶 IV 在37°C 时具有活性。如果在 37°C 下孵育不耐热的 exoI 反应时仍有大量引物残留,则会形成在较高温度下不会出现的exoI抗性引物二聚体。不耐热外泌体处理前的 PCR 纯化可去除 dNTP 和硫叶菌 DNA 聚合酶 IV,这会阻止引物二聚体的形成。
将每 100 μl PCR转移到相应的 1.7 ml 微量离心管中。
向每个 PCR 中添加 500 μl Buffer PB。彻底涡旋并在小型离心机中离心。
通过向柱中加入 600 μl 样品,以 18,000 × g和 4°C离心1 分钟,并丢弃流出液,从而将样品应用于 QIAquick 离心柱。只要不超过色谱柱容量(10 μg DNA),就可以通过重复此过程将多个样品加载到一根色谱柱上。
向每列应用 750 μl Buffer PE。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心1 分钟。丢弃流过。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心3 分钟以去除残留液体。
将柱转移到清洁的 1.7 ml 微量离心管中。
向每列应用 50 μl Buffer EB。
关键:始终使用缓冲液 EB 进行洗脱。不要用水洗脱。DNA 必须保持缓冲状态。见注 1b。缓冲液EB为10mM Ť RIS-HCL,pH 8.5中。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心1 分钟以洗脱 DNA。
将洗脱的样品汇集到一个 1.7 ml 微量离心管中。
通过调整移液器使其几乎不吸出样品并将其转移到新的 1.7 ml 微量离心管中来估计样品体积。该样品体积用于步骤 F4。
在冰上的 1.7 ml 微量离心管中制备 500 μl 不耐热的 exoI 反应(表 7)。
 
表 7. 不耐热外切核酸酶 I 消化的反应预混液
 
1加入无核酸酶的水,使包括所有试剂在内的总反应体积为 500 μl。
2 ThermoPol 缓冲液在此使用,因为不耐热的 exoI 在80°C 下热灭活。
 
将 100 μl反应体积分装到五个薄壁 200 μl PCR 管中。
将热循环仪设置为37°C,加热盖设置为 45°C 。一旦模块温度达到37°C,将反应放入热循环仪中并孵育4分钟。
将反应移到冰上。
启动表 8 中所示的热循环仪协议。一旦模块温度达到 80 °C,将反应放在热循环仪上,然后将热循环仪推进到下一步。
 
表 8. 不耐热外切核酸酶 I 热灭活的热循环方案。在加热盖设置为 105°C 的热循环仪中,在 80°C 下热灭活1分钟。
 
重复步骤 F1 中描述的 PCR 纯化,并进行以下修改以纯化 dsDNA 模板:
执行步骤F1 d / e 中描述的 750 μl Buffer PE 洗涤两次。
在步骤F1i,ê琵琶在30样品微升10毫摩尔的Ť RIS盐酸pH为8.0,而不是缓冲液EB。
如步骤E 22- E 24 中所述,量化 DNA 模板浓度并准备工作库存。
 
通过变性 PAGE 进行内部修饰的 DNA 模板质量控制
内部修饰的 DNA 模板制备的质量应通过使用变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳 (尿素 PAGE) 进行评估, 以确认 translesion 合成反应进行到完成。成功的 DNA 模板 QC 要求 DNA 模板完全变性,以便评估每条链的大小。因此,凝胶在高温 (~50 °C)下运行至关重要。下面的协议旨在使用 Bio-Rad Mini-PROTEAN 垂直电泳槽来实现这一点。
注意:有经验的读者将能够并行执行变性 PAGE QC 和原生 PAGE QC(程序 H)。
 
1.用去离子水彻底清洁 1.0 mm 隔板、短板和 1.0 mm 10 孔梳。用 70% 乙醇冲洗盘子,让它们风干。      
2.将玻璃板组装到Mini-PROTEAN 浇铸框架中。将板固定在浇铸框架中时,确保板的底部边缘齐平。      
3.将组装好的铸造框架固定在 Mini-PROTEAN 铸造支架的垫圈上。      
4.在 15 ml 锥形管中混合 1 ml UreaGel Buffer、5 ml UreaGel Diluent 和 4 ml UreaGel Concentrate。倒转管混合。该混合物将制备 10% 丙烯酰胺凝胶。      
注意:丙烯酰胺是一种神经毒素,应谨慎处理。
注意:根据 DNA 模板长度根据需要调整凝胶百分比。我的实验室使用了 10% 的凝胶来评估长度从 121 到2 73 nt 的DNA 模板。
5.向 UreaGel 混合物中加入 80 μl 10% APS 并倒置管混合。       
6.向 UreaGel 混合物中加入 4 μl TEMED,倒置试管混合并开始聚合。       
7.小心但快速地吸取 UreaGel 混合物以填充玻璃板之间的空间。       
8.插入 1.0 mm 10 孔梳子,让凝胶聚合至少 30 分钟。       
9.凝胶聚合后,组装 Mini-PROTEAN 电极组件。固定电极组件一侧的凝胶板和另一侧的缓冲坝。      
10.将电极组件放入 Mini-PROTEAN 凝胶槽中。   
11.用 1 × TBE填充凝胶板和缓冲液坝之间的腔室。1个加入× TBE到外室凝胶使得它覆盖所述下部凝胶垫圈。   
关键:仅覆盖凝胶垫圈的底部很重要。使用更多的缓冲液会在凝胶运行时分散热量并导致 DNA 变性不佳。
12.通过移液用 1 × TBE冲洗孔,直到每个孔中的缓冲液看起来均匀。   
13.在 480 V 下预运行凝胶约 30 分钟以加热凝胶。   
14.凝胶预运行后,将加热块设置为 95 °C。   
15.对于要评估的每个样品,在 1.7 ml 微量离心管中混合 15 μl 1 ×甲酰胺上样染料和 1 μl 50 nM DNA 模板。阴性对照和阳性对照(如果进行)也应以这种方式准备。   
关键:使用 16 μl 样品体积进一步稀释样品,以便减少变性后 DNA 双链体的重新退火。
16.结合19微升1 ×甲酰胺上载染料与1μl低范围的ssRNA梯子。将 5 μl 分装到单独的管中,并将剩余的 15 μl储存在 -20° C 以备将来使用。   
注意:由于缺乏所需尺寸范围内的市售 ssDNA 梯子,因此使用 ssRNA 梯子。因此,该阶梯旨在粗略估计 DNA 大小。
17.凝胶预运行约 25 分钟后,将所有样品放在95 °C 加热块上 5 分钟。在样品顶部放置一个铝块,以防止管子打开。   
18.从加热块中取出样品并立即将它们放在冰上使其快速冷却。将样品放在冰上 2 分钟。   
关键:快速冷却最大限度地减少 DNA 双链体的重新退火。
19.关闭电源并通过移液用 1 × TBE快速冲洗孔。   
20.使用加胶移液器吸头将样品加到凝胶上。小心填充尽可能少的孔,以便尽管样本量很大,但产生的条带仍然清晰。   
关键:快速加载样品,使凝胶保持温暖。
21.在 480 V 下运行凝胶,直到溴酚蓝染料带到达下凝胶垫圈。   
注意:密切监测凝胶。在 480 V 下,电泳将在约 10 分钟内完成。
22.关闭电源,拆开凝胶槽,将凝胶板放在工作台上冷却。   
23.将 3 μl SYBR Gold Nucleic Acid Stain 添加到150 mm 培养皿中的30 ml 1 × TBE 中。轻轻旋转盘子以分散污渍。   
24.使用 Mini-PROTEAN 凝胶释放器撬开凝胶板。   
25.小心地将凝胶从板上取下,只接触边缘。将凝胶浸入 SYBR Gold 染色剂中。用铝箔盖住盘子,轻轻摇晃 10 分钟。   
26.可视化并记录凝胶。凝胶可视化可以通过多种方式进行:我更喜欢使用台风生物分子成像仪或等效的激光扫描仪,因为它具有高灵敏度。Typhoon 应使用为 SYBR Gold 推荐的设置(在 Typhoon 9400 上使用 520 BP 40 发射滤光片的 488 nm 激光)在荧光模式下运行。将第一次扫描的 PMT 电压设置为 475 V,并根据需要进行调整。如果您无法使用能够对 SYBR Gold Nucleic Acid Stain 进行成像的激光扫描仪,也可以在 Dark Reader 蓝光透射仪上查看和记录凝胶。   
27.针对以下预期结果评估 DNA 模板制备的质量:   
阴性对照应有两个 DNA 模板带(图 4)。的上部(经修饰)链应当对应于完整DNA模板长度。的下部(未修饰的)频带应该对应于DNA模板的长度减去下游的核苷酸数目间Ñ人修饰位点。可能存在一些多余的引物。
DNA 模板制剂应包含一条与 DNA 模板全长相对应的条带(图 4)。不应存在引物。
关键:只应存在预期长度的单个条带。Translesion 合成反应可以而且应该完成(见注 1a)。
阳性对照(如果执行)应包含对应于 DNA 模板全长的单个条带(图 4)。如果阳性对照样品不是凝胶提取的,则可能存在一些过量的寡核苷酸。
注意:阳性对照是 DNA 双链变性有效性的有用指标。如果凝胶提取的阳性对照包含多个条带,则表明 DNA 变性不完整,应进行优化。
 
 
图4 。变性 PAGE QC 凝胶示例。变性凝胶QC分析。dsDNA 双链体的变性可以评估每条 DNA 链的长度。阴性对照含有脱硫生物素修饰且未进行转移合成,含有截短的 DNA 链。相比之下,通过转移合成处理的内部脱硫生物素化样品仅包含全长 DNA,与未修饰的阳性对照无法区分。凝胶图像改编自 Strobel等人。(2020) 图 1E,是使用 Typhoon 9400 生物分子成像仪获得的。
 
通过原生 PAGE 进行内部修饰的 DNA 模板质量控制。
在使用变性 PAGE(程序 G)确认跨损伤合成完成后,内部修饰的 DNA 模板制备应通过本机 PAGE 进行评估,以确认完整 dsDNA 双链体的纯度。
1.用去离子水彻底清洁 1.0 mm 隔板、短板和 1.0 mm 10 孔梳。用 70% 乙醇冲洗盘子,让它们风干。      
2.将玻璃板组装到 Mini-PROTEAN 浇铸框架中。将板固定在浇铸框架中时,确保板的底部边缘齐平。      
3.将组装好的铸造框架固定在 Mini-PROTEAN 铸造支架的垫圈上。      
4.在 15 ml 锥形管中混合3.6 ml Milli - Q 水、3 ml 3 × TBE 和 2.4 ml ProtoGel (30%)。倒转管混合。这种混合物将制备 8% 的丙烯酰胺凝胶。      
注意:丙烯酰胺是一种神经毒素,应谨慎处理。
注意:根据 DNA 模板长度根据需要调整凝胶百分比。8% 的凝胶适用于长达约 500 bp 的 DNA。对于长度超过 ~500 bp 的 DNA,使用 6% 的凝胶。
5.向丙烯酰胺混合物中加入 100 μl 10% APS并倒置管混合。      
6.向丙烯酰胺混合物中加入 10 μl TEMED,并颠倒试管混合。      
7.小心但快速地吸取丙烯酰胺混合物以填充玻璃板之间的空间。      
8.插入 1.0 mm 10 孔梳子,让凝胶聚合至少 30 分钟。      
9.凝胶聚合后,组装 Mini-POTEAN 电极组件。固定电极组件一侧的凝胶板和另一侧的缓冲坝。      
10.将电极组件放入 Mini-PROTEAN 凝胶槽中。   
11.用 1 × TBE填充凝胶板和缓冲液坝之间的腔室。将 1 × TBE添加到外凝胶室,直至 2 凝胶填充线。   
12.通过移液用 1 × TBE冲洗孔。   
13.对于将被评估每个样品,结合4微升10毫摩尔的Ť RIS盐酸pH为8.0,1μl的6 × DNA上样染料(非变性),和1.7 ml离心管1μl的50nM的DNA模板。阳性对照(如果执行)也应以这种方式准备。通过涡旋混合并在小型离心机中旋转。   
关键:必须使用 10 mM T ris-HCl,pH 8.0制备样品。见注 1b。
14.使用加胶移液器吸头将样品加到凝胶上。   
15. 上样3 μl Quick-Load  Purple 100 bp DNA 阶梯(或类似的 100 bp DNA 阶梯)。   
16.在 100 V 下运行凝胶,直到溴酚蓝加载染料到达下凝胶垫圈。   
17.关闭电源,拆卸凝胶装置。   
18.将 3 μl SYBR Gold Nucleic Acid 染料加入150 mm 培养皿中的30 ml 1 × TBE。轻轻旋转盘子以分散污渍。   
19.使用 Mini-PROTEAN 凝胶释放器撬开凝胶板。   
20.小心地将凝胶从板上取下,只接触边缘。将凝胶浸入 SYBR Gold 染色剂中。用铝箔盖住盘子,轻轻摇晃 10 分钟。   
21.使用 Typhoon Biomol ecular Imager(首选方法)或 Dark Reader Blue Light Transilluminator可视化并记录凝胶。   
22.评估 DNA 模板制备的质量。DNA 模板制备应包含与预期的全长 dsDNA 产品相对应的单条带。不应检测到副产品或过量底漆(图 5)。如果在模板制备通过变性 PAGE QC 后通过天然 PAGE 观察到缓慢迁移的条带,则表明 DNA 在制备过程中处理不当(例如,稀释到无缓冲溶液中;参见注释 1b)。   
 
 
图5 。天然 PAGE QC 凝胶示例。dsDNA 模板制剂不含可检测的副产物或寡核苷酸,是预期的长度 (121 bp)。请注意,内部修改的 DNA 模板比未修改的控制迁移稍慢。凝胶图像改编自 Strobel等人。(2020) 补充图 S2B,是使用 Typhoon 9400 生物分子成像仪获得的。
 
使用单轮体外转录评估转录障碍的效率(可选)
内部修饰的 DNA 模板的转录障碍活性可以使用单轮体外转录时间过程进行评估。当使用先前经过验证的 DNA 修饰时,此质量控制步骤是可选的。但是,执行此分析以确信内部修饰的 DNA 模板具有预期的转录障碍活性可能很有用,特别是如果您不熟悉上述协议。
注意:(1)在评估新的 DNA 模板序列时,使用未修改版本的 DNA 模板准备额外的转录反应,以区分停止的 TECs 和流失的转录本。(2)实验描述如下用途[ α- 32 P] -UTP作为放射性示踪剂。使用适当的辐射屏蔽并按照机构协议执行此实验。(3)该程序包括苯酚:氯仿提取和随后的乙醇沉淀去除蛋白质并在测序凝胶电泳之前浓缩样品。这些步骤不是严格要求的,但可以确保 RNA 流动性不受残留蛋白质的影响。
 
1.在开始实验前至少 30 分钟将加热块设置为 37 °C。      
2.在冰上的 1.7 ml 微量离心管中制备体外转录 Master Mix(表 9)。按表 9 中列出的顺序添加每种试剂并按如下方式混合:      
加入 10 × Transcription Buffer 后,涡旋并离心主混合物。
添加除大肠杆菌RNAP以外的所有试剂后,再次涡旋并降速主混合物。
添加大肠杆菌RNAP 全酶,并通过移液轻轻混合完成的 Master Mix。
 
表 9. 用于单轮体外转录的反应预混液。单个体外转录反应的总体积为 25 μl。预混液中省略了MgCl 2,因此转录仅在添加 10 ×起始溶液时启动。
 
1 NTP 浓度为 200 μM ATP、200 μM GTP、200 μM CTP和50 μM UTP,以促进[ α- 32 P]-UTP 掺入。如果使用不同的放射性示踪剂,则相应地调整 NTP 混合。
2关键:BSA 必须是分子生物学级。
3关键:假设库存来自新鲜批次,请在收到后两周内使用 [ α- 32 P]-NTP。
 
3.准备 10 ×起始溶液。      
关键:必须为每个实验新鲜制备10 ×起始溶液。
将 200 μl 100 mM MgCl 2移入 1.7 ml 微量离心管中。
移取 10 μl 2 mg/ml 利福平到 100 mM MgCl 2 中。
注意:利福平通过阻止转录物延伸超过 2-3 nt 来抑制细菌 RNAP。通过添加 MgCl 2和利福平同时启动转录,允许预先形成的开放复合物启动但阻止进一步启动,因此转录是单轮的。
彻底涡旋并在小型离心机中离心10 × Start Solution。
用箔纸覆盖 10 ×起始溶液以避光并保持在室温下。
4.为每个时间点准备一个含有 125 μl 终止液的 1.7 ml 微量离心管,并相应地标记管子。在整个实验过程中将这些管子放在冰上。      
5.执行单轮体外转录时间过程。表 10 显示了具有八个时间点的示例时间课程。      
注意:体外转录时间课程需要快速的样本操作。没有经验的用户应该在进行实验之前用模拟样本练习这些操作。
 
表 10. 单轮体外转录时间过程。通过在37 °C下孵育转录主混合物10 分钟,形成开放启动子复合物。单轮转录通过加入 10 × Start Solution 开始,在每个时间点,将 25 μl 的 Master Mix 转移到含有 125 μl 终止液的试管中,短暂涡旋并保持在冰上。
 
6.向每个样品中加入 150 μl 苯酚:氯仿:异戊醇,pH 8.0。      
7.彻底涡旋样品。      
8.将样品以 18,000 × g和4 °C离心5 分钟。      
9.对于每个样品,准备一个 1.7 ml 微量离心管,其中含有 450 μl 100% 乙醇、15 μl 3 M 醋酸钠,pH 5.5 和 1 μl GlycoBlue 共沉淀剂。      
10.小心地将每个样品的水相(上层)转移到步骤 H9 中制备的相应 1.7 ml 微量离心管中。倒转管数次以混合。   
11.将样品在-20 °C 下过夜以沉淀 RNA。   
12.第二天早上,按如下方法制备 0.4 mm、12% 丙烯酰胺、7.5 M 尿素测序凝胶:注意:丙烯酰胺是一种神经毒素,应谨慎处理。   
注意小号:
在倾倒测序凝胶以防止丙烯酰胺飞溅时,必须穿着实验室外套和安全眼镜 –偶尔,将凝胶梳插入玻璃板之间会导致丙烯酰胺飞溅。
凝胶百分比和运行条件由 RNA 的长度决定。根据 National Diagnostics UreaGel System Protocol,12% 丙烯酰胺单体适用于 10 至 50 nt RNA,8% 用于 40 至 100 nt,6% 用于 60 至 150 nt。
 
用温和的清洁剂和塑料刷彻底清洁长短测序凝胶板,并用去离子水冲洗。用 70% 乙醇冲洗凝胶板,并用轻型纸巾擦干。
注意:定期用 Rain-X 处理短板以帮助释放凝胶板。
用肥皂和去离子水清洁 0.4 毫米梳子和 0.4 毫米垫片,并使用轻型纸巾擦干。
组装测序凝胶进行浇注。有关推荐组件的演示,请参见视频 1 。
在 250 ml 塑料烧杯中,混合 7 ml UreaGel Buffer、29.4 ml UreaGel Diluent、33.6 ml UreaGel Concentrate 和 400 μl 10% APS。小心地摇晃烧杯以混合。
注意:这将制备 12% 丙烯酰胺凝胶。根据需要进行调整。
将 25 μl TEMED 添加到 UreaGel 混合物中并旋转以开始聚合。将混合物吸入 60 毫升注射器,小心地将混合物排出一次以确保完全混合。再次将 UreaGel 混合物吸入注射器。
注意:该协议使用的APS 和 TEMED 比 National Diagnostics UreaGel System 协议中推荐的要少10%,以减缓聚合,以便于凝胶倾倒。
倒入测序凝胶。有关推荐程序的演示,请参见视频1 。
让凝胶聚合 60 到 90 分钟。
 
 
视频 1. 倾倒测序凝胶的推荐程序。演示了倾倒 0.4 mm 大尺寸测序凝胶的简单而可靠的程序。
 
13.当凝胶聚合时,将样品以 20,000 × g和 4°C离心30 分钟。   
14.从每个样品中吸出上清液,同时注意不要干扰蓝色小颗粒。   
15.将样品离心几秒钟以降低残留液体的转速。   
16.用 10 μl移液器吸头吸出残留液体。   
17.向每个样品中加入 6.5 μl 1 ×甲酰胺负载染料。   
18.短暂涡旋样品并使液体向下旋转。   
19.凝胶聚合后,组装测序凝胶装置。ř樱雪孔通过绘制1 ×从上缓冲液槽TBE入60ml注射器中具有弯曲20G 1.5”针和排出TBE入井。有关如何组装 BRL Model S2 测序凝胶装置的演示,请参见视频 2 。   
 
 
视频 2. BRL Model S2 测序凝胶系统的组装。的程序组装凝胶到模型S2测序凝胶系统被证明。
 
20.关闭安全盖,连接引线,并在 1,500 V 下预运行凝胶约 20 分钟。   
21.将样品放入 95 °C 加热块中 5 分钟。将第二个铝块放在样品的顶部,以防止管子打开。   
22.立即将样品置于冰上快速冷却。   
23.使用 Sharpie,标记测序凝胶板以指示每个孔将包含什么样品。标记将在样本之间留空的任何孔。   
24.测序凝胶预运行约 20 分钟后,关闭电源并通过将 1 × TBE 从上缓冲液室吸入带有弯曲 20G 1½” 针头的 60 ml 注射器并再次冲洗孔将 TBE 排入井中。   
25.使用 0.4 mm 凝胶加载尖端小心地将每个样品加载到相应的孔中。   
提示:将移液器体积设置为比样品体积高几微升。这会在样品和尖端之间产生空气缓冲。装载样品时,首先分配空气缓冲液,并在样品排出时将吸头移向孔底。气泡将漂浮在孔中或被轻轻吸出。
注意:在丙烯酸屏蔽后面加载测序凝胶是不可行的。穿上实验室外套和安全眼镜,并通过屏蔽除您加载的样本之外的每个样本来最大程度地减少辐射暴露。可以使用剂量测定徽章监测辐射暴露。
26. 将6.5 μl 1 × Formamide Loading Dye 上样到靠近样品孔的任何空白孔中。这有助于样品通道笔直运行。   
27.关闭上缓冲液室盖并重新连接导线。   
28.在 1,400 V 下运行凝胶2.5 - 3 小时。   
29.使用储能磷屏图像橡皮擦将储能磷屏涂成空白。   
30.关闭电源并拆卸 Model S2 设备。有关如何拆卸 BRL S2 型测序凝胶装置的演示,请参见视频 3 。   
注意:转录反应含有游离的 [ α- 32 P]-UTP ,它们通常会迁移到较低的缓冲室中。因此,下腔室中的缓冲液具有放射性。
 
 
视频 3. BRL Model S2 测序凝胶系统的拆卸。演示了从 Model S2 测序凝胶系统中去除凝胶的过程。
 
31.通过打开板并用塑料包装覆盖暴露的凝胶,准备暴露于储能磷屏的凝胶。有关此过程的演示,请参见视频 4 。   
关键:塑料包装的外表面将与储能磷屏接触,保持完全清洁是绝对关键的。这很容易通过在应用塑料包装时经常更换手套来实现。
注意:如果暴露时间很短(即<16 小时),通常不需要干燥凝胶。
 
 
视频 4 。制备用于存储荧光屏曝光的测序凝胶。演示了用保鲜膜打开和覆盖测序凝胶的过程。
 
32.将包裹好的凝胶放入纸板曝光盒中。   
33.戴上一副干净的手套。打开存储荧光粉盒,仅处理边缘,将屏幕设置在包裹的凝胶上。关闭纸板曝光盒并将存储荧光粉盒放在顶部,以防止屏幕在曝光过程中移动。   
关键:凝胶图像的质量取决于储能磷屏的状况。小心处理储能磷屏。
34.暴露储能磷屏。暴露时间取决于样品活性。我发现 4 - 6 小时通常足以获得清晰的图像。不要过度曝光屏幕至关重要,特别是如果您希望量化您的结果。我通常在短时间曝光(例如4 - 6 小时)后执行扫描,将储能磷屏消隐,然后进行第二次过夜曝光。   
35.使用磷光成像模式在台风生物分子成像仪上扫描磷屏。   
36.评估 DNA 模板的转录障碍活性(图 6)。由于预计 100% 的 TEC 会在内部修饰部位停滞,因此该分析通常可以是定性的。例如,在下面的实验中,径流转录本仅在 4 分钟的时间点开始变得可见,表明内部 DNA 修饰有效地停止了 RNAP。   
 
 
图6 。单轮体外转录时间过程示例。除动力学分析的 24 个时间点外,按本协议所述进行的单轮体外转录时间过程;本协议中建议的 8 个时间点足以评估转录障碍活动。在这个实验中没有进行未经修改的阳性对照,因为停滞和流失转录物的精确位置已经确定。数据改编自 Strobel等人。(2020) 图 4。
 
笔记
 
关于再现性和可变性的说明。在撰写本文时,我已在两个实验室环境中多次执行此协议,并且上述程序已成为我实验室的常规程序。大多数制剂使用脱硫生物素-TEG或生物素-TEG 作为内部修饰,模板编码六种不同的 RNA,以及 Q5 高保真 DNA 聚合酶、Q5U 热启动高保真 DNA 聚合酶和 Vent  (exo-) DNA聚合酶已用于 PCR。以下部分描述了我的一般观察。
Translesion 合成效率。Sulfolobus DNA Polymerase IV 的转移合成非常有效,并且在我使用程序 B 中描述的经过验证的修改进行的每个内部修改的 DNA 模板制备中都已经完成(在变性 PAGE QC 的检测范围内)。这与我的一致通过引物延伸对硫叶菌DNA 聚合酶 IV绕过 DNA 修饰的评估:图 2 中所示的 DNA 修饰的引物延伸效率与未修饰的对照(Strobel等,2020)之间没有明显差异。我观察到可检测到不完全转移合成的唯一情况是在尝试构建具有复杂停滞位点的 DNA 模板时,该模板包含连续的内部生物素-TEG、5-丙炔基-dC 和生物素-11-dT 修饰;即使在这种情况下,translesion 合成也完成了 ~99%。在这种情况下,有可能通过用 Vent  DNA 聚合酶代替 Vent (exo-)来完成跨损伤合成反应,这样可以通过 3'  5' 外切核酸酶介导的降解来挽救停滞的病变旁路尝试。但是,我的实验室尚未广泛测试此程序。
DNA双链稳定性。在大多数实验中,修饰位点下游的 DNA 双链体将很短(在我目前使用的配置中为 29 和 31 bp),因为它附加了引物。因此,如果处理不当(例如,稀释到无缓冲溶液中),DNA 模板的这个区域可能会磨损。尽管通过变性 PAGE QC 仅观察到全长产品,但本机 PAGE QC 可检测到末端磨损是一种缓慢迁移的产品(图 7)。只需始终保持 DNA 模板缓冲即可避免末端磨损。作为额外的保护措施,可以使用提高热稳定性的 dNTP 2-氨基-dATP 和 5-丙炔基-dCTP 以及 dGTP 和 dTTP 来进行跨损伤合成,我最初将其描述为替代方案,因为预期末端磨损是一个潜在问题(Strobel等人,2020 年)。当 DNA 在水中稀释时,增强热稳定性的 dNTP 减少了末端磨损的发生(图 7 B ),但不能替代适当的样品缓冲。
 
 
图7 。出现缓慢迁移的 DNA 产物。A.跨损伤合成后,当使用标准 (S) 和热稳定性增强 (TS) dNTP 进行跨损伤合成时,变性 PAGE QC 只能检测到全长产物。B.的稀释初级DNA模板库存到无核酸酶水或10mM之后在(A)中所示的模板变性PAGE QC Ť RIS-HCL,pH 8.0中。当 DNA 稀释到水中时,提高热稳定性的 dNTP 减少了缓慢迁移产物的形成,并且在稀释到 10 mM T ris-HCl,pH 8.0 后,在两种制剂中均未观察到缓慢迁移产物。
 
屈服。产量取决于 PCR 的规模和使用的纯化程序。根据我的经验,如果通过琼脂糖凝胶提取(程序 E)纯化,500 μl Q5  PCR 将产生~20 到 ~40 pmols 的 DNA 模板,如果通过 exoI 处理和硅胶柱清理纯化,将产生 ~70 到 ~100 pmols(程序 F)。
PCR聚合酶的选择。上述方案已经过验证,可用于 Q5 高保真 DNA 聚合酶、Q5U 热启动高保真 DNA 聚合酶和 Vent  (exo-) DNA 聚合酶。我的实验室目前使用 Q5 系列酶进行大多数应用,因为它们的保真度很高。对于不需要高保真聚合酶的常规应用,Vent  (exo-) 是理想的选择,因为它使用与Sulfolobus DNA 聚合酶 IV相同的反应缓冲液。因此,对于使用 Vent  (exo-) 进行 PCR 和标准 dNTP 进行跨损伤合成的DNA 制备,只需在每 100 μl PCR 中加入 1 μl Sulfolobus DNA 聚合酶 IV ,孵育反应即可进行跨损伤合成反应在 55°C 下保持 1小时,然后进行上述纯化和 QC。原则上,用于 PCR 的 DNA 聚合酶不应影响上述程序的结果,因为正如所写的,该协议包括硅胶柱纯化步骤,用于在 PCR 后更换反应缓冲液,以便始终在最佳条件下进行转移合成。
在跨损伤合成过程中包含 Vent (exo-)。尽管单独使用硫叶菌DNA 聚合酶 IV 就足以完成跨损伤合成(Strobel等人,2020 年),但我目前的方案在跨损伤合成期间包括 Vent (exo-),以减少修饰位点下游 dsDNA 中出现错误的可能性:因为 DNA p olymerase IV只包含每结合事件1-2 NTS,可能的是通风口(外切)到截短的DNA的完整合成链一旦内部修改已经由旁路硫化叶DNA聚合酶IV。据报道,Vent (exo-) 的错误掺入频率为 1.9 × 10 -4 (Mattila et al. , 1991) ,而硫化叶菌DNA 聚合酶 IV的错误掺入频率介于 8 × 10 -3和 3 × 10 -4 之间, 取决于序列上下文(Boudsocq et al. , 2001) 。
成功执行协议的提示。以下提示描述了几种方式,其中我在样品处理使精确度和减少可变性。这些建议是一般性的,有经验的读者会很熟悉,但可能有助于经验不足的研究人员成功执行上述程序。
在每一步都戴上丁腈手套,既是为了个人保护,也是为了最大限度地减少样品污染的可能性。定期更换手套以防止交叉污染。
在无 RNase 的环境中执行所有生化操作。
尽可能使用商用无 RNase 水和溶液为小规模生化反应制备溶液。
使用定量移液操作。阅读吉尔森移液指南了解更多信息。
根据移液量选择合适的移液器。
确保您的移液器已校准。
使用低滞留移液器吸头。
吸取液体时保持移液器垂直。
平稳、轻柔地吸出和排出液体。
将移液器吸头浸入适当的深度,以最大程度地减少吸头外侧多余液体的积聚——这因移液器吸头而异,但通常约为 3 毫米。移液体积<1时的例外是微升用于其尖端应只浸入〜1毫米到液体中。
如果移液器吸头外侧确实积聚了多余的液体,请擦拭要移液的管子边缘的吸头以去除任何液滴。
大多数移液器吸头都有刻度,可用于近似吸头中的液体体积-目视检查吸头以确认您移液的体积正确且一致。
将浓缩试剂分配到另一种液体中后,用移液器上下吸管数次以冲洗吸头上的残留液体。
每次采样后更换吸头。重复使用吸头会降低准确性并增加交叉污染错误的可能性。
确保充分混合样品。
除酶外,一旦反应组分解冻,请务必混合并减慢反应组分。
将浓缩缓冲液稀释到水中后,在加入其他反应组分之前涡旋并离心样品。
一旦将酶添加到反应中,所有后续混合都应通过轻柔移液完成。
在处理过程中目视检查您的样品,尤其是在处理小体积时。
确保充分加热和冷却样品。
验证使用一个高精度与探针数字温度计或在使用前的模拟数字温度计加热块温度-不Ñ ö吨假定热块上的数字读出是正确的。
使用 Lab Armor TM磁珠进行加热块孵育,以确保有效加热样品。或者,用去离子水部分填充铝制加热块的孔。我更喜欢 Lab Armor TM珠子来保持试管干燥。
在冰上准备酶促反应时,使用铝块作为管架,以尽量减少管外液体的积聚。这有助于在样品处理过程中保持手套干燥。
如果可能,将离心机设置为向上计数。这确保了紧密的颗粒,因为您的样品将继续旋转,直到您在开始处理它们之前停止离心机。
 
食谱
 
DEPC 处理的 Milli - Q 水(制作 1.5 L)
将 1.5 L Milli - Q 水添加到 2 L 可高温高压灭菌的介质瓶中。
在瓶子里加入一个大搅拌棒。
添加 1.5 ml DEPC the Milli - Q 水,使其浓度为 0.1% v/v。紧紧地关闭瓶子。
注意:DEPC 必须在化学通风橱中处理。
将瓶子放在磁力搅拌板上搅拌过夜。
第二天早上,将瓶子放在化学通风橱中,打开盖子释放积聚的二氧化碳气体。
使用液体循环将 DEPC 处理的水高压灭菌 30 分钟。
注意:高压灭菌时培养基瓶盖必须松开。
在室温下储存。
10 mM Tris-HCl,pH 8.0(1 毫升)
将 990 μl 无核酸酶水移入 1.7 ml 微量离心管中。
添加 10 μl 无 RNase 的 Tris-HCl,pH 8.0。
彻底涡旋并在小型离心机中离心。
存储在RT 。
提高热稳定性的 dNTP 解决方案
准备一个含有表 11 中试剂的 1.7 ml 微量离心管。
彻底涡旋溶液并在小型离心机中离心。
储存在-20 °C。
 
表 11. 提高热稳定性的 dNTP 溶液的配方
 
1 × TBE(三硼酸盐-EDTA)缓冲液(20 L)
(89 mM tris 碱、89 mM 硼酸、2 mM Na 2 EDTA,pH 8.3)
注意小号:
如果以≥ 5 ×浓度制备,TBE 会迅速沉淀。我建议以 3 ×的最大浓度制备 TBE 。此配方适用于 1 × TBE ,它将保留在溶液中。
通过使用 2 L 量筒用 20 L 去离子水填充 TBE 溶液,确定并标记用于盛装 TBE 溶液的 20 L 填充线是很有用的。
 
用 ~3 L Milli - Q 水填充 4 L 烧瓶。
添加一个大搅拌棒并将烧瓶放在磁力搅拌板上。
以 ~180 RPM 开始搅拌。
称量 215.6 克三碱 (MW 121.14 克/摩尔) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
称取 110 克硼酸 (MW 61.83 克/摩尔) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
称取 14.89 g Na 2 EDTA ·2H 2 O (MW 372.24 g/mol) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
让试剂溶解。此时可能需要添加额外的 Milli - Q 水。
将 4 L 烧瓶的内容物转移到 20 L 大瓶中。
用 ~3.5 L Milli - Q 水填充 4 L 烧瓶并将其倒入大瓶中。
用 Milli - Q 水将 20 L 瓶装满至先前确定的 20 L 加注线。定期摇动大瓶以混合溶液。
存储在RT 。
70% (v/v) 乙醇(50 毫升)
移取 15 ml 无核酸酶水到 50 ml 锥形管中。
将 35 毫升 100% 乙醇移入锥形管中。
剧烈摇晃混合。
储存在-20 °C。
10% (w/v) SDS(制作 50 毫升)
将 5 克 SDS 溶解在 50 毫升锥形管中的约 40 毫升经 DEPC 处理的 Milli - Q 水中。
注意:缓慢旋转将有助于 SDS 溶解,而不会导致形成过多气泡。
将溶液转移到 50 ml 量筒中,并使用 DEPC 处理的 Milli - Q 水将体积调节至 50 ml 。
将溶液转移回 50 ml 锥形管中,并通过倒置管轻轻混合。
在室温下储存。
6 × DNA Loading Dye,+SDS,仅二甲苯氰(25 ml)
[ 10 mM Tris pH 8.0,30 %甘油,0.48% SDS,0.05% (w/v) 二甲苯氰 FF ]
注意小号:
SDS 用于从 DNA 中去除蛋白质复合物。
本配方中不使用溴酚蓝,因为它通常会迁移到 DNA 模板条带附近,因此除非使用紫外线,否则会掩盖 DNA 的可见性。重要的是不要使用溴酚蓝作为加载染料,这样 DNA 模板带可以在没有紫外线照射的情况下被切除。
在 50 ml 锥形管中称量 9.38 g 甘油。
在 1.7 ml 微量离心管中称量 ~ 12.5 mg 二甲苯氰 FF。
将二甲苯氰 FF 溶解在 1 ml DEPC 处理过的 Milli - Q 水中,并加入到 50 ml 试管中。
将 15.05 毫升经 DEPC 处理的 Milli - Q 水加入 50 毫升管中,并通过涡旋和倒转管彻底混合。
加入 0.25 ml 无核酸酶的 1 M Tris pH 8.0,并通过涡旋彻底混合。
向锥形管中加入 1.2 ml 10% SDS ,轻轻颠倒管混合。
根据需要将 1 ml 等分试样转移到 1.7 ml 微量离心管中。
存储在RT 。
10% (w/v) APS(制作 10 毫升)
将 1 g APS 添加到 50 ml 锥形管中。
加入 7 ml 高压灭菌的 Milli - Q 水并涡旋以溶解。
将体积提高到 10 毫升。
转移410个μ升等分至1.7 ml离心。
储存在-20 °C。每份足以倒入一个测序凝胶。
1 ×甲酰胺加载染料(制作 10 毫升)
[ 90% (v/v) 去离子甲酰胺,1 ×转录缓冲液,0.05% (w/v) 溴酚蓝]
注意:甲酰胺原液瓶必须在化学通风橱中处理。
在 1.7 ml 微量离心管中称取约 5 mg 溴酚蓝。
用 1 ml 10 × Transcription 缓冲液溶解溴酚蓝并转移到 50 ml 锥形管中。
加入 9 ml 去离子甲酰胺并彻底涡旋。
储存在4 °C。
3 × TBE 缓冲液(使 4 L)
(267 mM tris 碱、267 mM 硼酸、6 mM Na 2 EDTA,pH 8.3)
用 ~3 L Milli - Q 水填充 4 L 烧瓶。
添加一个大搅拌棒并将烧瓶放在磁力搅拌板上。
以 ~180 RPM 开始搅拌。
称量 129.4 克三碱 (MW 121.14 克/摩尔) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
称取 66 克硼酸 (MW 61.83 克/摩尔) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
称取 8.93 g Na 2 EDTA ·2H 2 O (MW 372.24 g/mol) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
让试剂溶解。此时可能需要添加额外的 Milli - Q 水。
使用 1 L 量筒一次将 3 L 溶液转移到 4 L carboy 1 L。
将剩余的溶液倒入量筒中。
用 Milli - Q 水将体积提高到 1 L,然后转移到瓶中。
摇匀大瓶。
存储在RT 。
6 × DNA Loading Dye(非变性)(25 ml)
[ 10 mM Tris pH 8.0,30% 甘油,0.05% (w/v) 溴酚蓝]
在 50 ml 锥形管中称量 9.38 g 甘油。
在 1.7 ml 微量离心管中称取约 12.5 mg 溴酚蓝。
将溴酚蓝溶解在 1 ml DEPC 处理过的 Milli - Q 水中,并加入到 50 ml 管中。
将 16.25 毫升经 DEPC 处理的 Milli - Q 水加入 50 毫升管中,并通过涡旋和倒转管彻底混合。
加入 0.25 ml 无核酸酶的 1 M Tris pH 8.0,并通过涡旋彻底混合。
根据需要将 1 ml 等分试样转移到 1.7 ml 微量离心管中。
存储在RT 。
1 M DTT(制作 10 毫升)
称量 1.54 克 DTT(MW 154.25 克/摩尔)。
将 DTT 溶解在 50 ml 锥形管中的 7 ml 无核酸酶水中。
将溶液转移到 10 毫升量筒中。
使用无核酸酶的水将体积调节至 10 ml。
将 0.2 μm PES 注射器过滤器连接到 10 ml 注射器。
通过将 5 ml 无核酸酶的水吸入注射器来预湿过滤器。丢弃水。
通过注射器过滤器将 1 M DTT 库存分配到干净的 50 ml 管中。
将 1 ml 等分的无菌1M DTT 溶液转移到 1.7 ml 微量离心管中。
储存在-20 °C。
100 mM DTT(制作 10 毫升)
将 9 ml 无核酸酶水和 1 ml 无菌 1 M DTT 混合在 50 ml 锥形管中。
彻底涡旋。
将 1 ml 等分的 100 mM DTT 溶液转移到 1.7 ml 微量离心管中。
储存在-20 °C。
10 ×转录缓冲液(10 ml)
准备一个含有表 12 中试剂的 50 ml 锥形管。
彻底涡旋溶液。
将 1 ml 等分的 10 ×转录缓冲液转移到 1.7 ml 试管中。
储存在-20 °C。
 
表 12. 10 ×转录缓冲液的配方
 
20 × NTP 溶液(0.5 毫升)
关键:必须使用高纯度 rNTP 溶液制备 NTP 库存。我建议使用 Cytiva Life Sciences 的高纯度 rNTP 组(目录号:27202501)。
注意:下面描述的 20 × NTP 溶液限制了 UTP 浓度,以促进使用[ α- 32 P]-UTP 进行内部 RNA 标记。如果您使用不同的核苷酸作为放射性示踪剂,您必须准备单独的 20 × NTP 溶液,其中用于放射性标记的核苷酸浓度是有限的。
准备一个含有表 13 中试剂的 1.7 ml 微量离心管。
彻底涡旋并在小型离心机中离心。
储存在-20 °C。
 
表 13. 20 × NTP 溶液的配方
 
5 mg/ml BSA(制作 200 μl)
向 1.7 ml 微量离心管中加入 180 μl 无核酸酶水。
向管中加入 20 μl UltraPure TM BSA (50 mg/ml)。
彻底涡旋并在小型离心机中离心。
储存在-20 °C。
2 毫克/毫升利福平(10 毫升)
注意:利福平对光敏感。利福平原液在处理过程中应使用铝箔避光。
在 1.7 ml 微量离心管中称取 20 mg 利福平。
将利福平溶解在 1 ml DMSO 中并转移到 50 ml 锥形管中。
注意:DMSO 库存瓶必须在化学通风橱中处理。
将 9 ml DMSO 移入锥形管中。
彻底涡旋。
将 1 ml 2 mg/ml 利福平溶液的等分试样转移到 1.7 ml 微量离心管中。
储存在-20 °C 避光。
1 M Tris-HCl,pH 8.0(制作 1 L)
称量 121.14 克三碱 (MW 121.14 克/摩尔)。
使用磁力搅拌板将 tris 碱溶解在 ~800 ml Milli - Q 水中。
在 tris 溶解时清洁和校准 pH 计。在将电极插入 tris 溶液之前,用 Milli - Q 水彻底冲洗电极。
注意小号:
使用合适的电极测量 tris 溶液的 pH 值至关重要。我使用梅特勒托利多 S220-Bio SevenCompact 台式 pH/离子计(梅特勒托利多,S220-Bio)。
在开始制备溶液之前立即使用新鲜标准校准 pH 计是一种很好的做法。
在测量 tris 溶液的 pH 值时,通过缓慢加入浓盐酸,同时监测 pH 值,小心地将 pH 值调节至 8.0。
注意:pH 值取决于温度。在对 pH 值进行最终调整时,溶液应为室温。
注意:浓 HCl 具有很强的腐蚀性,应使用适当的 PPE 并在化学通风橱中进行处理。
将 tris 溶液转移到 1 L 量筒中,并用 Milli - Q 水将体积调节至 1 L。
将 tris 溶液转移回 2 L 烧杯并打开搅拌板,使溶液完全混合。再次验证 pH 值为 8.0。
将 500 ml 的 1 M T ris-HCl 溶液分装到两个 1 L 可高压灭菌的培养基瓶中,并使用液体循环高压灭菌 30 分钟进行灭菌。
注意:中号EDIA瓶盖必须是松散当高压灭菌。
存储在RT 。
0.5 M EDTA ,pH 8.5(制作0.5 L)
清洁和校准 pH 计。用 Milli - Q 水彻底冲洗电极。
称量 93.06 克 Na 2 EDTA ·2H 2 O(MW 372.24 克/摩尔)。
使用磁力搅拌板将Na 2 EDTA ·2H 2 O与 ~400 ml Milli - Q 水混合,并将 pH 计电极插入溶液中。
在搅拌的同时缓慢加入 NaOH 颗粒。
注意:Na 2 EDTA ·2H 2 O 直到溶液的pH 值为~8.0 才会溶解。注意不要一次添加过多的 NaOH颗粒,否则会超出所需的 pH 值。
一旦 Na 2 EDTA ·2H 2 O 完全溶解且 pH 值为 8.5,将溶液转移到 500 ml 量筒中并将体积调节至 500 ml。
将溶液转移回烧杯,打开搅拌板,使溶液充分混合。再次验证 pH 值为 8.5。
将溶液转移到 1 L 可高温高压灭菌的介质瓶中,并使用液体循环高压灭菌 30 分钟。
注意:高压灭菌时培养基瓶盖必须松开。
存储在RT 。
停止溶液(使 50 毫升)
准备一个含有表 14 中试剂的 50 ml 锥形管。
彻底涡旋。
将 10 ml 等分试样转移到 15 ml 锥形管中。
储存在-20 °C。
 
表 14. 停止溶液的配方
 
致谢
 
这项工作得到了布法罗大学研究基金会(EJS)启动资金的支持。该协议源自 Strobel等人提出的原始研究。(2020) 。
 
利益争夺
 
没有宣布竞争利益。
 
参考
 
Belogurov, GA 和 Artsimovitch, I. (2019)。延长 RNA 聚合酶的底物选择、催化和易位机制。J Mol Biol 431(20):3975-4006。
Boudsocq, F.、Iwai, S.、Hanaoka, F. 和 Woodgate, R. (2001)。Sulfolobus solfataricus P2 DNA 聚合酶 IV (Dpo4):一种古菌 DinB 样 DNA 聚合酶,具有类似于真核细胞的病变旁路特性。核酸研究29(22):4607-4616。
Buenrostro, JD, Araya, CL, Chircus, LM, Layton, CJ, Chang, HY, Snyder, MP 和 Greenleaf, WJ (2014)。大规模平行阵列上 RNA-蛋白质相互作用的定量分析揭示了生物物理和进化景观。Nat Biotechnol 32(6): 562-568。
核心,LJ,瀑布,JJ 和 Lis,JT(2008 年)。新生 RNA 测序揭示了人类启动子的广泛暂停和不同起始。科学322(5909):1845-1848。
Frieda, KL 和 Block, SM (2012)。直接观察腺嘌呤核糖开关中的共转录折叠。科学338(6105):397-400。              
Korzheva, N.、Mustaev, A.、Kozlov, M.、Malhotra, A.、Nikiforov, V.、Goldfarb, A. 和 Darst, SA (2000)。转录延伸的结构模型。科学289(5479):619-625。              
Marr, MT 和 Roberts, JW (1997)。通过聚合酶与非模板链寡核苷酸的结合来测量启动子识别。科学276(5316):1258-1260。
Mattila, P.、Korpela, J.、Tenkanen, T. 和 Pitkanen, K. (1991)。Thermococcus litoralis DNA 聚合酶的 DNA 合成保真度 - 一种具有校对活性的极其热稳定的酶。核酸研究19(18):4967-4973。              
Pan, T. 和 Sosnick, T. (2006)。转录过程中的RNA折叠。Annu Rev Biophys Biomol 结构35:161-175。              
Pavco, PA 和 Steege, DA (1990)。大肠杆菌 RNA 聚合酶的延伸在体外被位点特异性 DNA 结合蛋白阻断。J Biol Chem 265(17): 9960-9969。
Pupov, D.、Ignatov, A.、Agapov, A. 和 Kulbachinskiy, A.(2019 年)。DNA 损伤对大肠杆菌RNA 聚合酶合成 RNA 的不同影响。Biochem Biophys Res Commun 510(1): 122-127。              
Selby, CP 和 Sancar, A. (1993)。转录-修复偶联的分子机制。科学260(5104):53-58。              
Selby, CP 和 Sancar, A. (1994)。转录修复耦合和突变频率下降的机制。微生物修订版58(3):317-329。              
斯特罗贝尔,EJ(2021 年)。通过从磁珠中选择性光洗脱制备大肠杆菌RNA 聚合酶转录延伸复合物。生物化学杂志297 :100812 。
Strobel、EJ、Lis、JT 和 Lucks,JB(2020 年)。用于新生 RNA 展示的 DNA 转录的化学障碍。J Biol Chem 295(19): 6401-6412。
Strobel, EJ, Watters, KE, Nedialkov, Y., Artsimovitch, I. 和 Lucks, JB (2017)。用于绘制共转录 RNA 折叠的分布式生物素-链霉亲和素转录障碍。核酸研究45(12):e109。
Svetlov, V. 和 Artsimovitch, I. (2015)。细菌 RNA 聚合酶的纯化:工具和方案。方法 Mol Biol 1276:13-29。              
Tome, JM, Ozer, A., Pagano, JM, Gheba, D., Schroth, GP 和 Lis, JT (2014)。通过高通量测序-RNA 亲和力分析对 RNA-蛋白质相互作用进行综合分析。Nat 方法11(6): 683-688。              
Vassylyev, DG, Vassylyeva, MN, Perederina, A., Tahirov, TH 和 Artsimovitch, I. (2007 a )。细菌RNA聚合酶转录延伸的结构基础。自然448(7150):157-162。              
Vassylyev, DG, Vassylyeva, MN, Zhang, J., Palangat, M., Artsimovitch, I. 和 Landick, R. (2007 b )。细菌 RNA 聚合酶中底物装载的结构基础。自然448(7150):163-168。
Watters, KE, Strobel, EJ, Yu, AM, Lis, JT 和 Lucks, JB (2016)。核糖开关在核苷酸分辨率下的共转录折叠。Nat Struct Mol Biol 23(12): 1124-1131。
Widom, JR, Nedialkov, YA, Rai, V., Hayes, RL, Brooks, CL, 3rd, Artsimovitch, I. 和 Walter, NG (2018)。配体调节核糖开关折叠和转录暂停之间的交叉耦合。摩尔细胞72(3):541-552 e546。              
Widom, JR, Rai, V., Rohlman, CE 和 Walter, NG (2019)。基于可逆 dCas9 结合的多功能转录控制。RNA 25(11):1457-1469。
 
版权所有 © 20 21作者;独家被许可人 Bio-protocol LLC。1                                                                                                                              
材料和试剂
 
耗材
1.低保留10 μ升移液管尖端(例如,海王星科学,目录号:2342S3.S)      
2.低保留200 μ升移液管尖端(例如,海王星科学,目录号:2102.S)      
3.低保留1 ,000 μ升移液管尖端(例如,海王星科学,目录号:2372.S)      
4. 200 μ l、0.4 mm 扁平凝胶上样移液器吸头(例如,Laboratory Product Sales,目录号:L113761)      
5. 无核酸酶1.7 ml 微量离心管(例如,Thomas Scientific,目录号:1149K01)      
6. 无核酸酶 2.0 ml 微量离心管(例如,VWR,目录号:20170-170)      
7. 2.0 ml 螺旋盖管,带 O 形圈(例如,实验室产品销售,目录号:L233226)      
8. 0.2 ml 8-Strip PCR 管带圆顶盖(例如,实验室产品销售,目录号:L216380)      
9. Qubit TM检测管(Invitrogen TM ,目录号:Q32856)      
10. 15 ml 锥形管(例如,实验室产品销售,目录号:TR2000)   
11. 20 ml锥形管(例如,实验室产品销售,目录号:TR2003)   
12. 5 ml 血清移液管(例如,Laboratory Product Sales,目录号:L310500)   
13. 10 ml 血清移液管(例如,Laboratory Product Sales,目录号:L311000)   
14. 25 ml 血清移液管(例如,Laboratory Product Sales,目录号:L312510)   
15.称重船(任何来源)   
16. 10 ml 注射器(例如BD,目录号:302995)   
17. 60 ml 注射器(例如BD,目录号:309653)   
18. 20G 1½” 针(例如,BD,目录号:305176)   
19. 0.2 μm 聚醚砜 (PES) 注射器过滤器,无菌(例如,VWR 目录号:28145-501)   
20. 150 毫米培养皿(例如,康宁目录号:430599)   
21.小型 1 层轻型纸巾擦拭器(例如,VWR,目录号:82003-820)   
22.大型 1 层轻型纸巾擦拭器(例如,VWR,目录号:82003-822)   
23.塑料背衬工作台纸(例如,Fisher Scientific ,目录号:14-127-47)   
24.丁腈手套   
25.凡士林凡士林原味   
26. Rain-X 原装玻璃防水剂   
27.大型活页夹(例如,Staples 2” Binder Clips,Staples,目录号:10669)   
28. AEP 30510400 ZipSafe Sealwrap,18”    × 2000'(亚马逊)
29.剃须刀片   
30.铝箔   
31.洗洁精   
32.清洗测序凝胶板的塑料刷   
 
试剂
注意:化学品应为分子生物学/生物技术级。
无核酸酶水(例如,Invitrogen公司TM ,目录号:10977015),小号撕在室温erature (RT)
毫- Q水,小号撕RT
去离子水,小号撕RT
焦碳酸二乙酯(DEPC),> 97%,(Thermo Scientific的TM ,AAJ14710AC),小号撕在-20 ℃下
Ñ OTE :手柄DEPC在化学通风橱中。
三(1 M),pH为8.0,无RNase (Invitrogen公司TM ,目录号:AM9855G),小号撕在室温
EDTA(0.5 M),pH为8.0,无RNase (Invitrogen公司TM ,目录号:AM9260G),小号撕在室温
氯化钾(KCl)中(2 M),无RNA酶(Invitrogen公司TM ,目录号:AM9640G),小号撕在室温
氯化镁(氯化镁2 ),1M,无RNase (Invitrogen公司TM ,目录号:AM9530G),小号撕在室温
乙酸钠(的NaOAc)(3 M),pH 5.5的无RNA酶(Invitrogen公司TM ,目录号:AM9740),小号撕在室温
1 ×的Tris-EDTA(TE)溶液(10mM的Tris pH值7.5,0.1mM的EDTA),(例如,集成DNA技术,目录号:11-05-01-05),小号撕在室温
Ť RIS库(例如,VWR,目录号:97061-794),小号撕在室温
EDTA,二钠盐,二水合物(例如,Invitrogen公司TM ,目录号:15576028),小号撕在室温
盐酸(HCl)(例如,Sigma-Aldrich公司,目录号:320331),小号在RT撕带通风橱下的其它酸。
注意:盐酸具有很强的腐蚀性,必须在化学通风橱中处理。
氢氧化钠(NaOH)(例如,Sigma-Aldrich公司,目录号:S8045),小号在RT撕下与其它碱
注意:氢氧化钠具有很强的腐蚀性。
硼酸(例如,Fisher Scientific公司,目录号:BP168-500),小号撕在室温
十二烷基硫酸钠的钠盐(SDS)(例如,Millipore公司,目录号:7910-500GM),小号撕在室温
二硫苏糖醇(DTT)(例如,金生物技术,目录号:DTT100),小号撕desic Ç在-20 ated ℃下
100%的乙醇(200标准强度)(例如,DECON实验室,目录号:2716),小号撕在室温
异丙醇(例如,Sigma-Aldrich公司,目录号:I9516-4L),小号撕在室温
甘油(例如,Sigma-Aldrich公司,目录号:G5516-4L),小号撕在室温
苯酚:氯仿+ Tris缓冲液(例如,Thermo Scientific的TM ,目录号:17909),小号撕4 ℃下
注意:苯酚:氯仿应在化学通风橱中处理。
OmniPur甲酰胺,去离子(例如,Millipore公司,目录号:4650-500ML),小号撕4 ℃下
注意:甲酰胺应在化学通风橱中处理。
二甲亚砜(DMSO)(例如,Fisher Scientific公司,目录号:D128-500 ),小号撕在室温
注意:二甲基亚砜应在化学通风橱中处理。
过硫酸铵(APS)(例如,Sigma-Aldrich公司,目录号:A3678-100G),小号撕在室温
TEMED(四甲基乙二胺)(例如,Bio-Rad公司,目录号:1610801),小号撕在室温
溴酚蓝(例如,Bio-Rad公司,目录号:1610404),小号撕在室温
二甲苯青FF(例如,Bio-Rad公司,目录号:1610423),小号撕在室温
溴化乙锭,10毫克/毫升(例如,Invitrogen公司TM ,目录号:15585011),小号撕在室温
注意:按照机构指南处理溴化乙锭。
快速加载紫色100 bp的DNA梯(New England Biolabs公司,目录号:N0551L),小号撕在室温
低浓度范围的单链RNA梯(新英格兰生物实验室,目录号:N0364S),小号撕RT
SYBR金核酸染色剂(Invitrogen公司TM ,目录号:S11494),小号撕在-20 ℃下
脱氧核苷酸(的dNTP)混合溶液(New England Biolabs公司,目录号:N0447L),小号撕在-20 ℃下
的dNTP集(100毫摩尔)(Invitrogen公司TM ,目录号:10297018) ,小号撕在-20 ℃下
2-氨基的dATP(TriLink是Biotechnologies公司,目录号:N-2003),小号撕在-20 ℃下
5丙炔基-的dCTP(TriLink是Biotechnologies公司,目录号:N-2016),小号撕在-20 ℃下
高纯度的rNTP集,100mM的解决方案(ATP,CTP,GTP,UTP)(Cytiva生命科学,目录号:27202501),小号撕在-20 ℃下
超纯TM BSA(Invitrogen公司TM ,目录号:AM2616 ),小号撕在-20 ℃下
利福平(金生物技术,目录号:R-120-10),小号撕dessicated在-20 ℃下
GlycoBlue TM共沉淀(Invitrogen公司TM ,目录号:AM9516),小号撕在-20 ℃下
量子位TM的dsDNA HS测定试剂盒(Invitrogen公司TM ,目录号:Q32854),š OME组分储存在4 ℃下
量子位TM的dsDNA BR测定试剂盒(Invitrogen公司TM ,目录号:Q32853),š OME组分储存在4 ℃下
SeaKem GTG TM琼脂糖(龙沙,目录号:50074),小号撕在室温
关键:琼脂糖必须是准备级的。
UreaGel 19:1变性凝胶系统(国家诊断,目录号:EC-833),小号撕在室温
注意:含有丙烯酰胺。丙烯酰胺是一种神经毒素,应谨慎处理。
ProtoGel(30%)(国家诊断,目录号:EC-890),小号撕在室温
注意:含有丙烯酰胺。丙烯酰胺是一种神经毒素,应谨慎处理。
QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen,目录号:28106),小号撕在室温
QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,目录号:28706),小号撕在室温
内部修饰的寡核苷酸(集成DNA技术,š EE表1)
UTP,[ α- 32 P] -3000次/毫摩尔10毫居里/毫升(珀金埃尔默,目录号:BLU007H) ,小号撕在-20 ℃下
注意:[ α- 32 P]-UTP 必须按照机构辐射安全协议进行处理。
 
酵素
Q5 高保真DNA聚合酶(New England Biolabs公司,目录号:M0491L ),小号撕在-20 ℃下
泄 (外切)DNA聚合酶(New England Biolabs公司,目录号:M0257L) ,小号撕在-20 ℃下
硫化叶DNA聚合酶IV(New England Biolabs公司,目录号:M0327S) ,小号撕在-20 ℃下
耐热切核酸酶I (新英格兰生物实验室,目录号:M0568L) ,小号撕在-20 ℃下
大肠杆菌RNA聚合酶全酶(New England Biolabs公司,目录号:M0551S) ,小号撕在-20 ℃下
注意:大肠杆菌 RNA 聚合酶核心和 70可以通过完善的方案(Marr 和 Roberts ,1997 年;Svetlov 和 Artsimovitch ,2015 年)进行纯化,并用于重组全酶。
 
准备好的解决方案(参见食谱部分)
DEPC 处理的 Milli - Q Water
10 mM Tris-HCl,pH 8.0
10 mM 热稳定性增强 dNTP 溶液
1 × Tris-硼酸盐-EDTA 缓冲液
70% 乙醇
10% 安全数据表
6 × DNA 上样染料(仅 +SDS、XC)
10% APS
1 ×甲酰胺负载染料
3 × Tris-硼酸盐-EDTA 缓冲液
6 × DNA 加载染料(非变性)
1 M 数字电视
100 毫米 DTT
10 ×转录缓冲液
20 × NTP 解决方案
5 毫克/毫升 BSA
2 毫克/毫升利福平
1 M Tris-HCl,pH 8.0
0.5 M EDTA,pH 8.5
停止解决方案
 
设备
 
高压釜
通风柜
-20 °C和 -80 °C 冰柜(任何来源)
冰箱 (4 °C)(任何来源)
2微升,20微升,200微升,和1 ,000微升微量(任何来源)
移液器控制器(例如,Drummond,目录号:4-000-101)
用于 1.7 ml、15 ml 和 50 ml 试管的塑料管架(任何来源)
实验室计时器(例如,Traceable  ,目录号:5004CC)
冰桶(例如,SCIENCEWARE  ,目录号:M16807-4002)
锥形烧瓶(500 毫升,4升)(任何来源)
烧杯(1 L、2 L)(任何来源)
可高压灭菌的培养基瓶(500 毫升、1 升和2 升)(任何来源)
量筒(10 ml、50 ml、200 ml、0.5 L、1 L 和 2 L)(任何来源)
塑料 250 毫升烧杯(任何来源)
4 L 聚丙烯瓶(任何来源)
20 L carboy(任何来源)
微波(任何来源)
Vortex(例如,Scientific Industries,目录号:SI-0236)
热循环仪(例如,Bio-Rad S1000 w/96-Deep Well Reaction Module,目录号:1852197)
关键:100 μl PCR 需要深孔热循环仪。如果 100 μl超过了热循环仪的最大样品体积,请将反应分装到额外的 PCR 管中。
冷冻微量离心机(例如,Eppendorf 5424 R,目录号:5406000046)
微型离心机(例如,VWR,目录号:76269-064)
数字干浴(例如,Thermo Scientific TM ,目录号:88870001)
Lab Armor TM Beads(Gibco TM ,目录号:A1254301)
用于 1.7 ml 管的铝块(例如Thermo Scientific TM ,目录号:88880130)
铝加热/块,可容纳 96 × 0.2 ml 管(Sigma-Aldrich,目录号:Z740270-1EA)
模拟温度计(例如,VWR,目录号:89095-600)
数字温度计(例如,VWR,目录号:89094-750)
Qubit TM 4 荧光计(Invitrogen TM ,目录号:Q33238)
摇摆平台(例如,康宁,目录号:6703)
旋转器(例如,ATR,Rotamix转子RKVSD和翻滚端杆,目录号小号:10101和10110)
pH计(例如,Mettler Toledo,S220-Bio,目录号:30019031)
关键:pH计电极必须是兼容牛逼RIS解决方案。
天平(例如,Ohaus,目录号:30253007RM)
分析天平(例如,Mettler Toledo,目录号:30029076)
Flat Spatula(例如,VWR,目录号:82027-532)
称重抹刀(任何来源)
搅拌板(例如,Corning PC-610D,目录号:6795620D)
磁力搅拌棒(例如,VWR,目录号:58948-025)
水平凝胶装置(例如,Horizon 11-14 Midi Gel System,Gel Company,HZ1114)
注意:梳子应至少容纳 50 μl。
Mini-PROTEAN Tetra Cell,2 凝胶,用于 1.0 mm 手工凝胶(Bio-Rad,目录号:1658003FC)
测序凝胶装置(例如,BRL Model S2 ;Gel Company,目录号:S2-3040)
注意:垫片和梳子的厚度应为 0.4 毫米。
基本电源(例如,Bio-Rad,目录号:1645050)
高压电源(例如,Bio-Rad,目录号:1645056)
UV Transilluminator(例如,UVP目录号:UV95045901)
注意:切勿将眼睛或皮肤暴露在紫外线辐射下。
Dark Reader Blue light Transilluminator(Clare Chemical,目录号:DR89X)
纸板曝光盒(例如,Sigma-Aldrich,目录号:E-9135,已停产)
存储荧光屏,35 × 43 cm(Cytiva Life Sciences,目录号:28956476)
存储荧光屏图像橡皮擦(Cytiva Life Sciences,目录号:29187190)
Typhoon Biomolecular RGB Biomolecular Imager(Cytiva Life Sciences,目录号:29187194)
用于高能 β 辐射的丙烯酸屏蔽
注意:在使用32 P进行实验时,我发现以下项目很有用。
立式台式 Beta 屏蔽,3/8” 厚(例如,RPI,目录号:BR-201)
24 位 Beta Block(例如,实验室产品销售,目录号:172644)
带冰室的样品 Beta 盒(例如,Fisher Scientific,目录号:S29137)
亚克力垃圾箱(例如,ThermoScientic TM ,目录号:67459024)
大型垂直丙烯酸屏蔽(Denville Scientific,目录号 S0260-S)
中型垂直丙烯酸屏蔽(Denville Scientific,目录号 S0180-S)
大型丙烯酸存储容器(例如,Mitchell Plastics,目录号:RP-400)
小型亚克力储存容器(例如,IBI Scientific,目录号:RB-100)
移液器吸头处理盒(Thomas Scientific,目录号:1216J05)
 
程序
 
程序概述
我制备内部修饰线性 dsDNA 的程序包括三个主要步骤(图 1):首先,通过 PCR 扩增将内部修饰引入 DNA 模板(程序 C)。PCR 扩增产生截短的 DNA 产物,因为停止转录延伸的 DNA 修饰也可能停止通常用于 PCR 的 DNA 聚合酶的延伸。接下来,使用易位聚合酶Sulfolobus DNA Polymerase IV(程序 D)合成截短的 DNA 链的其余部分。最后,纯化完成的 dsDNA 产物以去除多余的寡核苷酸和用于 PCR 扩增的模板 DNA(程序 E 或程序 F)。然后对纯化的 DNA 进行三个质量控制步骤,以验证跨损伤合成的效率(程序 G)、dsDNA 的纯度(程序 H)以及作为转录障碍的内部修饰的活性(程序 I)。得到的内部修饰的线性 dsDNA 然后准备用于共转录显示来自被捕的 TECs 的新生 RNA。
 
 
图1 。酶促制备内部修饰 dsDNA 的过程概述。使用内部修饰的引物进行 PCR 可产生具有一条截短链的 DNA 产物。然后使用跨损伤 DNA 合成与Sulfolobus DNA 聚合酶 IV合成截短的链,该酶绕过内部修饰位点和 Vent  (exo -)。然后在用作体外转录实验的 DNA 模板之前,对得到的内部修饰的 dsDNA 进行纯化和质量评估。
 
引发位点和寡核苷酸序列
成功的 DNA 模板制备取决于 PCR 引发位点的精心设计。我的标准协议使用两个恒定的 DNA 区域,这些区域已经过验证可进行有效扩增,而没有可检测的副产物(表 1)。
 
表 1. 用于制备线性 DNA 模板的引发位点和引物。每个寡核苷酸与其相应接头退火的区域都标有下划线。'/iMod/' 表示内部 DNA 修饰的位置。经验证的修饰包括脱硫生物素-TEG 、生物素-TEG、etheno-dA 和 UniLink TM氨基修饰剂(图 2)。
 
1 P RA1启动子(Strobel , 2021)是λ P R和 T7A1 启动子的衍生物,可以使用 PRA1.F 引物代替 LPR.F 代替λ P R。
关键:订购 100 nmol 或更大规模的 LPR.F、PRA1.F、dRP1iMod.R 和 dRP1.R 引物,使用 HPLC 纯化。寡核苷酸可以来自任何来源。我使用集成 DNA 技术。
 
设计 PCR 引物序列。
我建议使用所述序列在表1中,已在下面的程序被广泛验证使用。如果您的应用需要不同的序列,请使用寡核苷酸设计工具,例如Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer TM来验证您的序列不包含重要的二级结构,并且由于稳定的同二聚体或异二聚体而不太可能产生引物二聚体。理想情况下,引物的长度应小于 60 nt,内部修饰的寡核苷酸在修饰和 5' 端之间应有 ~30 nt,以确保最终 dsDNA 产品中修饰位点下游的双链稳定性。每个引物与 PCR 接头退火的区域应具有 ~50% 的 GC 含量。Tm 会随所用的聚合酶而变化;当使用Q5  DNA 聚合酶时,我的目标是在 65 °C 下退火引物。在新英格兰生物实验室的Tm计算器是使用NEB聚合酶时评估的退火温度是有用的。
  根据预期的应用,可以通过多种方式将引发位点添加到 PCR 模板 DNA 中。首先,如果 PCR 模板是质粒 DNA,则在克隆过程中 DNA 序列中可以包含引物位点。类似地,如果 PCR 模板是合成的寡核苷酸,则可以在寡核苷酸合成过程中引入引发位点(总共 52 个核苷酸)。还可以通过修改用于制备基因组或转录组序列库的现有协议,将引发位点附加到细胞来源的 DNA 或 RNA。但是,这些应用程序超出了本协议的范围,它们的实现将需要特定于应用程序的专业知识。
 
选择内部修改。我已经验证了与此协议一起使用的四个内部 DNA修改(图 2),并在下面描述了它们的特性。
 
 
图2 。经验证的内部 DNA 修饰。经验证的 DNA 修饰包括 (A) 脱硫生物素-TEG、(B) etheno-dA 和 (C) UniLink TM氨基修饰剂。生物素-TEG 也已被验证可用于以下方案(Strobel , 2021) 。
 
脱硫生物素-TEG/生物素-TEG :脱硫生物素(图 2A)是生物素类似物,可通过添加游离生物素从链霉亲和素中洗脱。Sulfolobus DNA 聚合酶 IV 主要绕过脱硫生物素-TEG,而不掺入与修饰位点相对的核苷酸。脱硫生物素-TEG 是一个有效的转录障碍:约 100% 的 TECs 停留在修饰位点上游 1 nt,在 500 μM NTPs存在下,约 87% 的 TECs 在 32 分钟后保留在停滞位点(Strobel等人,2020)。当在脱硫生物素-TEG 障碍处停滞时,RNAP 会阻止脱硫生物素与链霉亲和素结合,从而能够根据 TEC 沿 DNA 模板的位置对其进行富集。我还使用内部生物素-TEG 修饰(Strobel ,2021)执行了以下协议。
Etheno-dA:Etheno-dA(图 2B)是一种腺苷类似物,其中腺嘌呤的 N1 和 N6 之间的乙烯桥阻止氢键。当绕过 etheno-dA 修饰时,硫叶菌DNA 聚合酶 IV 倾向于在修饰位点对面掺入一个 dA 核苷酸。普波夫等人。(2019)表明,etheno-dA 是一种使用 TEC 支架系统的有效转录阻断剂。我对 etheno-dA 修饰的 DNA 模板的分析与 Pupov等人的发现一致。(2019 年):~100% 的 TECs 在修饰位点上游 1 nt 处停滞,并且在 500 μM NTPs存在下 32 分钟后~84% 的 TECs 保留在停滞位点(Strobel等,2020)。Etheno-dA 可用作功能惰性的化学转录障碍。
Uni-Link TM氨基改性剂:Uni-Link TM氨基改性剂(图 2C)包含一个与六碳间隔基相连的伯胺,旨在保留磷酸二酯骨架中的天然核苷酸间距。当绕过Uni-Link TM氨基修饰剂时,硫叶菌DNA 聚合酶 IV 在约 50% 的时间内在修饰位点对面掺入了一个 dA 核苷酸。相比于脱硫生物素-TEG和亚乙烯基-DA,所述的Uni-链路TM氨基-修饰是弱转录路障:尽管的TECs的〜100%最初失速在修饰位点,RNA聚合酶可以绕过失速部位有效地使得仅〜40在存在 500 μM NTP 的情况下,32 分钟后 TEC 的百分比保留在停滞位点(Strobel等,2020)。尽管如此,游离氨基在某些实验中可用于功能化 DNA 模板。
收到上述寡核苷酸后,溶解冻干的寡核苷酸并准备工作库存:
在小型离心机中将寡核苷酸管离心几秒钟,以确保冻干的寡核苷酸位于管底部。
加入1 × TE,pH 7.5中,在寡核苷酸溶解到100浓度μ中号。
注意:本协议中使用的寡核苷酸是关键且昂贵的试剂。出于这个原因,我建议使用商业无核酸酶 TE 来重悬初级寡核苷酸库存,以便标准化存储和处理。
在小型离心机中彻底摇动并旋转溶解的寡核苷酸。
制备10 μ通过组合为180 M的工作引物库存微升10毫摩尔的Ť RIS-HCl中,用20微升的100μpH 8.0的中号寡核苷酸库存在2 ml螺旋帽管与O形环。在小型离心机中涡旋并旋转工作底漆。
关键:将工作底漆储存在带有 O 形圈的螺帽管中,以减少交叉污染的可能性。
将 100 μ M 和 10 μ M 引物库存储存在 -20 °C。
关键:在解冻引物库存时,混合寡核苷酸溶液,然后在小型离心机中旋转管,以便没有液体留在盖子上。
 
PCR扩增
使用修饰的引物 dRP1iMod.R(表 1)通过 PCR 掺入内部 DNA 修饰,以产生在 DNA 修饰位点下游具有 5' 悬垂的 dsDNA(图 1)。
注意:通过用未修饰的 dRP1.R 引物替换dRP1iMod.R,可以在单独的 500 μl PCR 中制备未修饰的模板版本。未修饰的模板可以与内部修饰的模板平行制备,使用相同的程序,只是省略了程序 D:Translesion DNA Synthesis。未修饰的 DNA 模板是程序 G、H 和 I 中描述的 QC 分析的有用对照。
注意:我的实验室通常使用 Q5 或Q5U  DNA 聚合酶进行 PCR。如果需要,可以替换其他聚合酶。有关其他信息,请参阅注释 2。
 
1.准备620微升的Q5 在冰上1.7 ml离心管PCR主混合物(表2)。按表 2 中列出的顺序添加每种试剂并按如下方式混合:      
注意:当使用程序 F 纯化 DNA 模板时,如果需要,可以缩小 PCR 规模,因为样品回收效率很高。我的实验室通常进行的最小规模制备使用 200 μl 的初始Q5 PCR 。
加入 Q5 反应缓冲液后,在小型离心机中涡旋并离心预混液。
添加除Q5  DNAP之外的所有试剂后,再次涡旋和离心预混液。
添加Q5  DNA p olymerase并轻轻混合完成的米,通过移液混合翠菊。
 
表 2. Q5  PCR 的反应预混液。Q5  PCR预混液基于新英格兰生物实验室使用 Q5 高保真 DNA 聚合酶进行PCR 的协议。
 
1标准 dNTP 溶液,分别含有 10 mM dATP、dGTP、dTTP 和 dCTP。
2用于 PCR的DNA 模板可能因应用而异。相应地调整添加的音量。
 
2.将 100 μl反应体积分装到 6 个 200 μl薄壁PCR 管中。      
关键:如果热循环仪不能容纳 100 μl反应,请使用较小的等分试样。
3.开始表 3 中所示的热循环方案。一旦热循环仪盖子完全加热,将反应放在热循环仪模块上。      
表 3. PCR 扩增的热循环方案。表 2 中描述的 PCR 的热循环协议。始终使用设置为105 °C的加热盖执行 PCR 。如果使用上述引物以外的引物或Q5  High-Fidelity DNA 聚合酶以外的 DNA 聚合酶,请调整退火温度。调整延伸时间以考虑 DNA 模板的长度。最后保持在 10 °C,以减少能耗并延长热循环仪的寿命。
 
1根据需要调整退火温度。我建议使用NEB Tm 计算器来确定退火温度。
 
4.热循环完成后,将反应置于冰上。      
5.使用 Qubit TM dsDNA HS 检测(表 4)量化 PCR 产量,以确保 PCR 为下游处理步骤产生足够的 DNA。将样品浓度乘以 500(五个反应体积,代表用于跨病变合成的五个反应)以估计 PCR 总产量。产量可能因 DNA 模板长度和组成而异;对于参考,验证该协议时使用的 121 bp DNA 模板通常由 Qubit测量~10 ng/ μl,估计总共~5 μg 输入 DNA 用于后续步骤。这可能是对 DNA 数量的低估,因为最初的 PCR 产物包含在Qubit TM dsDNA HS 检测中无法有效检测到的 5' ssDNA 悬垂。      
表 4. Qubit TM dsDNA 检测方案。为方便起见,此处提供了 Qubit TM dsDNA HS 和 BR 检测方案。该协议是用一般术语编写的,包括这两种检测。有关更多信息,请参阅Qubit TM 4 荧光计、Qubit TM dsDNA HS 检测试剂盒和Qubit TM dsDNA BR 检测试剂盒用户指南。
 
1 Qubit TM标准品必须为每次测定新鲜制备。
 
PCR纯化和吨ranslesion DNA合成
程序 C 产生具有 5 '突出端的截短 dsDNA 。使用硫叶菌DNA 聚合酶 IV进行的跨损伤 DNA 合成填补了这一突出端,使 DNA 模板完全双链(图 1)。程序 C 的 PCR 产物首先使用离心柱试剂盒进行纯化,以交换反应缓冲液并去除 dNTP。无论使用哪种 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增,该净化步骤都可确保使用Sulfolobus DNA Polymerase IV进行跨损伤合成的最佳反应条件。
 
净化六个100微升使用的PCR QIAquick PCR纯化试剂盒,其中将交换反应缓冲液和贫化的dNTP(小号EE注2):
将每 100 μl PCR转移到相应的 1.7 ml 微量离心管中。
向每个 PCR 中添加 500 μl Buffer PB。彻底涡旋并在小型离心机中离心。
将每个样品应用于单独的 QIAquick 离心柱。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心1 分钟。丢弃流过。
向每列应用 750 μl Buffer PE 。
C将样品以 18,000 × g和 4° C离心1 分钟。丢弃流过。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心3 分钟以去除残留液体。
将柱转移到清洁的 1.7 ml 微量离心管中。
对于六列中的五列,应用 50 μl Buffer EB。这些样品将汇集用于跨损伤合成。对于第六列,应用 30 μl Buffer EB。这将是变性 PAGE QC(程序 G)的阴性对照。
关键:始终使用缓冲液 EB 进行洗脱。不要用水洗脱。DNA 必须保持缓冲状态。见注 1b。缓冲液 EB 是 10 mM T r is-HCl,pH 8.5。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心1 分钟以洗脱 DNA。
将洗脱的样品以 30 μl 体积储存在 -20°C,以用于程序 G。
将在 50 μl 体积中洗脱的五个样品汇集到 1.7 ml 微量离心管中。
通过将 200 μl 转移到新的 1.7 ml 微量离心管中,调整移液器使其几乎不吸出剩余样品,然后转移剩余体积,估计洗脱样品的体积。样品体积将用于步骤 D5。
在冰上的 1.7 ml 微量离心管中制备 500 μl 转移合成反应(表 5)。按表 5 中列出的顺序添加每种试剂并按如下方式混合:
加入 ThermoPol  Buffer 后,在小型离心机中涡旋并离心预混液。
加入纯化的 PCR 后,再次涡旋和旋转主混合物。
添加Vent  (exo-) DNA 聚合酶和硫化叶DNA 聚合酶 IV,并通过移液轻轻混合完成的主混合物。
注意:虽然硫化叶DNA聚合酶IV独自是足以完成跨损伤合成反应,包括通风口(外切)DNA聚合酶可以提高DNA合成的超过内病变(保真度小号EE注3)。
 
表 5. 用于转移损伤 DNA 合成的反应预混液。Translesion DNA 合成主混合物用于制备规模的 translesion 引物延伸。
 
1加入无核酸酶的水,使包括所有试剂在内的总反应体积为 500 μl。
2 Translesion 合成可以使用标准 dNTP 或提高热稳定性的 dNTP 进行。标准 dNTP 适用于大多数应用。当下游方案需要长时间加热至高温 (>65°C) 时,热稳定性增强 dNTP 可用作防止 DNA 末端磨损的保护措施。
3见为的组合物配方3吨hermostability增强dNTP溶液。
4见注 3。
 
将 100 μl反应体积分装到五个薄壁 200 μl PCR 管中。
启动表 6 中所示的热循环仪协议。一旦模块温度为 55 °C,将反应放在热循环仪上,然后将热循环仪推进到下一步。
表 6. 跨损伤 DNA 合成的热循环方案。Translesion 合成反应在热循环仪中在 55°C 下进行一小时,加热盖设置为 105°C。的最终保持为12 ℃,以减少能量消耗,延长热循环仪的寿命。
 
转移合成后,必须使用程序 E(琼脂糖凝胶纯化)或程序 F(外切核酸酶 I 清除)纯化完整的 dsDNA。如果不能立即进行纯化,反应可以在-20°C 下保存。
 
纯化选项 1:已完成的 dsDNA 模板的琼脂糖凝胶纯化
当质粒 DNA 用作 PCR 扩增的模板(程序 C)时,需要进行凝胶纯化以去除质粒 DNA 和任何多余的引物。如果使用 ssDNA 寡核苷酸作为 PCR 扩增的模板,则可以使用程序 F(纯化选项 2:耐热外切酶 I 清理)来纯化 dsDNA 转录模板,而不是使用琼脂糖凝胶提取。
1.将 5 个100 μl转移合成反应等分试样合并到 1.7 ml 微量离心管中。       
2.将50 μl 3M 醋酸钠(pH 5.5 )和 1 ml 冷的 100% 乙醇添加到合并的样品中。通过涡旋和倒置管彻底混合样品。       
3.通过将样品在 -20°C 下过夜或在 -80°C 下冷却 30 分钟来沉淀 DNA。       
4.当样品充分冷却后,倒入含有 0.5 μg/ml 溴化乙锭的 1 × TBE、1% 琼脂糖凝胶。使用每孔至少可容纳 50 μl 的凝胶梳。       
关键:使用制备级琼脂糖(如 SeaKem GTG 琼脂糖)进行凝胶纯化。
关键:凝胶必须含有溴化乙锭,以便在凝胶运行时对 DNA 进行染色。
注意:溴化乙锭应根据机构指南进行处理和处置。
5.将样品以 18,000 × g和4°C离心30 分钟以沉淀沉淀的 DNA。       
6.通过移液吸出并弃去上清液。小心避免颗粒。       
提示:要精确吸取大量上清液,可将 10 μl移液器吸头装入 1,000 μl移液器吸头的末端。这可以通过精确控制实现 ~1 ml 的抽吸。
7.向样品中加入 1 ml 冷的 70% 乙醇,轻轻颠倒试管数次。不要移动颗粒。       
8.将样品以 18,000 × g和4°C离心2 分钟。       
9.通过移液吸出并弃去上清液。       
10.将样品离心几秒钟以减慢残留的上清液。   
11.通过移液吸出并丢弃残留的上清液。   
12.用纸巾盖住开口管并将其放在长凳上晾干几分钟。   
13.组装并用足够的 1 × TBE填充水平凝胶罐以覆盖琼脂糖凝胶。   
14.用 30 μl的 10 mM重悬沉淀    Ť RIS-HCL,pH 8.0中。
关键:始终将沉淀重悬在 10 mM T ris-HCl,pH 8.0 中。不要在水中重新悬浮颗粒。样品必须保持缓冲d.见注 1b。
15.向样品中加入 6 μl 6 × DNA Loading Dye(+SDS,仅 XC)并移液混合。   
16.将样品装入琼脂糖凝胶并在 100 V 下运行凝胶1 - 2 小时。   
注意:因为样品含有几微克 DNA,当溴化乙锭与 DNA 共同迁移时,红色条带应该变得可见(图 3A)。这使得凝胶提取能够在不将 DNA 暴露于任何紫外线下的情况下进行。
 
 
图3 。无紫外光的 DNA 条带切除。A. 由于溴化乙锭与凝胶中的大量 DNA 共同迁移,因此 PCR 产物在可见光下可以看到红色条带。B. 在 PCR 产物被切除后,在紫外透射仪上观察 (A) 中的凝胶以评估 PCR 和条带切除的质量。未检测到副产物。
 
17.不要将凝胶暴露在紫外线下,用干净的刀片切下 PCR 产物(图 3)。   
18.修剪凝胶切片以去除尽可能多的琼脂糖。   
关键:去除多余的琼脂糖可提高 DNA 产量和质量。
19.用 2.0 ml 试管称量天平的皮重。将凝胶切片加入 2.0 ml 管中,称重凝胶切片,并记录质量。凝胶切片的质量将在下面的步骤 E21a 和 E21b 中使用。   
20.在紫外透照仪上观察凝胶以确认条带被精确切除并评估是否存在任何副产物(图 3B)。   
21.使用 QIAquick Gel Extraction Kit 从切下的凝胶切片中回收 DNA。使用以下协议,其中包括制造商推荐的每个可选步骤,并降低凝胶熔解温度以最大限度地减少 DNA末端磨损的可能性:   
注意:有关更多信息,请参阅Qiagen QIAquick 凝胶提取试剂盒快速启动方案。
如果凝胶切片的重量超过 400 毫克,请将其分成几个 2.0 毫升的管,使每管含有 <400 毫克的凝胶。
将 3 倍体积的缓冲液 QG 添加到 1 倍体积的凝胶(1 毫克凝胶 ~1微升)中。
在 30 °C 下孵育样品,偶尔涡旋直到凝胶片溶解。
关键:凝胶切片在30 °C 下融化,以最大限度地减少 DNA 模板末端磨损。
向样品中加入 1 凝胶体积的异丙醇。颠倒管子并在小型离心机中旋转以进行混合。
将 700 μl样品加入 QIAquick 离心柱并以 18,000 × g和4°C离心1 分钟。丢弃流过并重复,直到应用了整个样品。
向柱中加入 500 μl Buffer QG,并以18,000 × g和4°C离心1 分钟。丢弃流过。
向柱中加入 750 μl Buffer PE,并以18,000 × g和4°C离心1 分钟。丢弃流过。
将样品以18,000 × g和4°C离心3 分钟,以减少残留液体。
将色谱柱放入干净的 1.7 ml 微量离心管中。
将 30 μl 10 mM T ris-HCl,pH 8.0 应用到 QIAquick 柱的中心。
关键:始终使用 10 mM T ris-HCl,pH 8.0 进行洗脱。不要用水洗脱。见注 1b。
将色谱柱以18,000 × g和4°C离心1 分钟。
将洗脱的样品转移到干净的 1.7 ml 微量离心管中。
22.使用 Qubit TM dsDNA BR Assay Kit量化 DNA 模板浓度(表 4)。   
23.将 DNA 浓度从 ng/ μl转换为 μM。典型的制备会产生 30 μl 浓度介于0.75 μM 和 1.25 μM之间的 DNA 。   
提示:Promega 有一个基于网络的工具,用于将微克 DNA 转换为 pmol DNA。输入以碱基对为单位的 DNA 长度和1 μl样品中 DNA 的 μg 数,以 pmol/μl 计算样品浓度;pmol/μl 等于 μM。
24.准备200微升的50nM的工作原液为每个模板通过稀释初级股票于10mM Ť RIS-HCL,pH 8.0中。初级股票和工作股票都应储存在 -20°C。   
关键:始终使用 10 mM T ris-HCl,pH 8.0制备工作库存。不要用水。DNA 必须保持缓冲状态,以防止修饰位点下游的双链体磨损。见注 1b。
 
纯化选项 2:不耐热外切核酸酶 I 清理
当使用 ssDNA 寡核苷酸作为模板进行 PCR 扩增(程序 C)时,可以使用不耐热外切核酸酶 I (exoI) 降解多余的引物并使用 PCR 纯化试剂盒更换反应缓冲液来纯化最终的 dsDNA 产物。这种替代纯化方案产生的 DNA 模板大约是琼脂糖凝胶纯化的两倍,因此不需要那么多的 DNA 输入(注 1c)。然而,不耐热 exoI 清除程序的成功取决于 PCR 的特异性,因为它不选择 DNA 大小。
使用QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化5 个 100 μl跨病变合成反应,该试剂盒会消耗 dNTP 和酶:
关键:硫叶菌 DNA 聚合酶 IV 在37°C 时具有活性。如果在 37°C 下孵育不耐热的 exoI 反应时仍有大量引物残留,则会形成在较高温度下不会出现的exoI抗性引物二聚体。不耐热外泌体处理前的 PCR 纯化可去除 dNTP 和硫叶菌 DNA 聚合酶 IV,这会阻止引物二聚体的形成。
将每 100 μl PCR转移到相应的 1.7 ml 微量离心管中。
向每个 PCR 中添加 500 μl Buffer PB。彻底涡旋并在小型离心机中离心。
通过向柱中加入 600 μl 样品,以 18,000 × g和 4°C离心1 分钟,并丢弃流出液,从而将样品应用于 QIAquick 离心柱。只要不超过色谱柱容量(10 μg DNA),就可以通过重复此过程将多个样品加载到一根色谱柱上。
向每列应用 750 μl Buffer PE。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心1 分钟。丢弃流过。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心3 分钟以去除残留液体。
将柱转移到清洁的 1.7 ml 微量离心管中。
向每列应用 50 μl Buffer EB。
关键:始终使用缓冲液 EB 进行洗脱。不要用水洗脱。DNA 必须保持缓冲状态。见注 1b。缓冲液EB为10mM Ť RIS-HCL,pH 8.5中。
将样品以 18,000 × g和 4°C离心1 分钟以洗脱 DNA。
将洗脱的样品汇集到一个 1.7 ml 微量离心管中。
通过调整移液器使其几乎不吸出样品并将其转移到新的 1.7 ml 微量离心管中来估计样品体积。该样品体积用于步骤 F4。
在冰上的 1.7 ml 微量离心管中制备 500 μl 不耐热的 exoI 反应(表 7)。
 
表 7. 不耐热外切核酸酶 I 消化的反应预混液
 
1加入无核酸酶的水,使包括所有试剂在内的总反应体积为 500 μl。
2 ThermoPol 缓冲液在此使用,因为不耐热的 exoI 在80°C 下热灭活。
 
将 100 μl反应体积分装到五个薄壁 200 μl PCR 管中。
将热循环仪设置为37°C,加热盖设置为 45°C 。一旦模块温度达到37°C,将反应放入热循环仪中并孵育4分钟。
将反应移到冰上。
启动表 8 中所示的热循环仪协议。一旦模块温度达到 80 °C,将反应放在热循环仪上,然后将热循环仪推进到下一步。
 
表 8. 不耐热外切核酸酶 I 热灭活的热循环方案。在加热盖设置为 105°C 的热循环仪中,在 80°C 下热灭活1分钟。
 
重复步骤 F1 中描述的 PCR 纯化,并进行以下修改以纯化 dsDNA 模板:
执行步骤F1 d / e 中描述的 750 μl Buffer PE 洗涤两次。
在步骤F1i,ê琵琶在30样品微升10毫摩尔的Ť RIS盐酸pH为8.0,而不是缓冲液EB。
如步骤E 22- E 24 中所述,量化 DNA 模板浓度并准备工作库存。
 
通过变性 PAGE 进行内部修饰的 DNA 模板质量控制
内部修饰的 DNA 模板制备的质量应通过使用变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳 (尿素 PAGE) 进行评估, 以确认 translesion 合成反应进行到完成。成功的 DNA 模板 QC 要求 DNA 模板完全变性,以便评估每条链的大小。因此,凝胶在高温 (~50 °C)下运行至关重要。下面的协议旨在使用 Bio-Rad Mini-PROTEAN 垂直电泳槽来实现这一点。
注意:有经验的读者将能够并行执行变性 PAGE QC 和原生 PAGE QC(程序 H)。
 
1.用去离子水彻底清洁 1.0 mm 隔板、短板和 1.0 mm 10 孔梳。用 70% 乙醇冲洗盘子,让它们风干。      
2.将玻璃板组装到Mini-PROTEAN 浇铸框架中。将板固定在浇铸框架中时,确保板的底部边缘齐平。      
3.将组装好的铸造框架固定在 Mini-PROTEAN 铸造支架的垫圈上。      
4.在 15 ml 锥形管中混合 1 ml UreaGel Buffer、5 ml UreaGel Diluent 和 4 ml UreaGel Concentrate。倒转管混合。该混合物将制备 10% 丙烯酰胺凝胶。      
注意:丙烯酰胺是一种神经毒素,应谨慎处理。
注意:根据 DNA 模板长度根据需要调整凝胶百分比。我的实验室使用了 10% 的凝胶来评估长度从 121 到2 73 nt 的DNA 模板。
5.向 UreaGel 混合物中加入 80 μl 10% APS 并倒置管混合。       
6.向 UreaGel 混合物中加入 4 μl TEMED,倒置试管混合并开始聚合。       
7.小心但快速地吸取 UreaGel 混合物以填充玻璃板之间的空间。       
8.插入 1.0 mm 10 孔梳子,让凝胶聚合至少 30 分钟。       
9.凝胶聚合后,组装 Mini-PROTEAN 电极组件。固定电极组件一侧的凝胶板和另一侧的缓冲坝。      
10.将电极组件放入 Mini-PROTEAN 凝胶槽中。   
11.用 1 × TBE填充凝胶板和缓冲液坝之间的腔室。1个加入× TBE到外室凝胶使得它覆盖所述下部凝胶垫圈。   
关键:仅覆盖凝胶垫圈的底部很重要。使用更多的缓冲液会在凝胶运行时分散热量并导致 DNA 变性不佳。
12.通过移液用 1 × TBE冲洗孔,直到每个孔中的缓冲液看起来均匀。   
13.在 480 V 下预运行凝胶约 30 分钟以加热凝胶。   
14.凝胶预运行后,将加热块设置为 95 °C。   
15.对于要评估的每个样品,在 1.7 ml 微量离心管中混合 15 μl 1 ×甲酰胺上样染料和 1 μl 50 nM DNA 模板。阴性对照和阳性对照(如果进行)也应以这种方式准备。   
关键:使用 16 μl 样品体积进一步稀释样品,以便减少变性后 DNA 双链体的重新退火。
16.结合19微升1 ×甲酰胺上载染料与1μl低范围的ssRNA梯子。将 5 μl 分装到单独的管中,并将剩余的 15 μl储存在 -20° C 以备将来使用。   
注意:由于缺乏所需尺寸范围内的市售 ssDNA 梯子,因此使用 ssRNA 梯子。因此,该阶梯旨在粗略估计 DNA 大小。
17.凝胶预运行约 25 分钟后,将所有样品放在95 °C 加热块上 5 分钟。在样品顶部放置一个铝块,以防止管子打开。   
18.从加热块中取出样品并立即将它们放在冰上使其快速冷却。将样品放在冰上 2 分钟。   
关键:快速冷却最大限度地减少 DNA 双链体的重新退火。
19.关闭电源并通过移液用 1 × TBE快速冲洗孔。   
20.使用加胶移液器吸头将样品加到凝胶上。小心填充尽可能少的孔,以便尽管样本量很大,但产生的条带仍然清晰。   
关键:快速加载样品,使凝胶保持温暖。
21.在 480 V 下运行凝胶,直到溴酚蓝染料带到达下凝胶垫圈。   
注意:密切监测凝胶。在 480 V 下,电泳将在约 10 分钟内完成。
22.关闭电源,拆开凝胶槽,将凝胶板放在工作台上冷却。   
23.将 3 μl SYBR Gold Nucleic Acid Stain 添加到150 mm 培养皿中的30 ml 1 × TBE 中。轻轻旋转盘子以分散污渍。   
24.使用 Mini-PROTEAN 凝胶释放器撬开凝胶板。   
25.小心地将凝胶从板上取下,只接触边缘。将凝胶浸入 SYBR Gold 染色剂中。用铝箔盖住盘子,轻轻摇晃 10 分钟。   
26.可视化并记录凝胶。凝胶可视化可以通过多种方式进行:我更喜欢使用台风生物分子成像仪或等效的激光扫描仪,因为它具有高灵敏度。Typhoon 应使用为 SYBR Gold 推荐的设置(在 Typhoon 9400 上使用 520 BP 40 发射滤光片的 488 nm 激光)在荧光模式下运行。将第一次扫描的 PMT 电压设置为 475 V,并根据需要进行调整。如果您无法使用能够对 SYBR Gold Nucleic Acid Stain 进行成像的激光扫描仪,也可以在 Dark Reader 蓝光透射仪上查看和记录凝胶。   
27.针对以下预期结果评估 DNA 模板制备的质量:   
阴性对照应有两个 DNA 模板带(图 4)。的上部(经修饰)链应当对应于完整DNA模板长度。的下部(未修饰的)频带应该对应于DNA模板的长度减去下游的核苷酸数目间Ñ人修饰位点。可能存在一些多余的引物。
DNA 模板制剂应包含一条与 DNA 模板全长相对应的条带(图 4)。不应存在引物。
关键:只应存在预期长度的单个条带。Translesion 合成反应可以而且应该完成(见注 1a)。
阳性对照(如果执行)应包含对应于 DNA 模板全长的单个条带(图 4)。如果阳性对照样品不是凝胶提取的,则可能存在一些过量的寡核苷酸。
注意:阳性对照是 DNA 双链变性有效性的有用指标。如果凝胶提取的阳性对照包含多个条带,则表明 DNA 变性不完整,应进行优化。
 
 
图4 。变性 PAGE QC 凝胶示例。变性凝胶QC分析。dsDNA 双链体的变性可以评估每条 DNA 链的长度。阴性对照含有脱硫生物素修饰且未进行转移合成,含有截短的 DNA 链。相比之下,通过转移合成处理的内部脱硫生物素化样品仅包含全长 DNA,与未修饰的阳性对照无法区分。凝胶图像改编自 Strobel等人。(2020) 图 1E,是使用 Typhoon 9400 生物分子成像仪获得的。
 
通过原生 PAGE 进行内部修饰的 DNA 模板质量控制。
在使用变性 PAGE(程序 G)确认跨损伤合成完成后,内部修饰的 DNA 模板制备应通过本机 PAGE 进行评估,以确认完整 dsDNA 双链体的纯度。
1.用去离子水彻底清洁 1.0 mm 隔板、短板和 1.0 mm 10 孔梳。用 70% 乙醇冲洗盘子,让它们风干。      
2.将玻璃板组装到 Mini-PROTEAN 浇铸框架中。将板固定在浇铸框架中时,确保板的底部边缘齐平。      
3.将组装好的铸造框架固定在 Mini-PROTEAN 铸造支架的垫圈上。      
4.在 15 ml 锥形管中混合3.6 ml Milli - Q 水、3 ml 3 × TBE 和 2.4 ml ProtoGel (30%)。倒转管混合。这种混合物将制备 8% 的丙烯酰胺凝胶。      
注意:丙烯酰胺是一种神经毒素,应谨慎处理。
注意:根据 DNA 模板长度根据需要调整凝胶百分比。8% 的凝胶适用于长达约 500 bp 的 DNA。对于长度超过 ~500 bp 的 DNA,使用 6% 的凝胶。
5.向丙烯酰胺混合物中加入 100 μl 10% APS并倒置管混合。      
6.向丙烯酰胺混合物中加入 10 μl TEMED,并颠倒试管混合。      
7.小心但快速地吸取丙烯酰胺混合物以填充玻璃板之间的空间。      
8.插入 1.0 mm 10 孔梳子,让凝胶聚合至少 30 分钟。      
9.凝胶聚合后,组装 Mini-POTEAN 电极组件。固定电极组件一侧的凝胶板和另一侧的缓冲坝。      
10.将电极组件放入 Mini-PROTEAN 凝胶槽中。   
11.用 1 × TBE填充凝胶板和缓冲液坝之间的腔室。将 1 × TBE添加到外凝胶室,直至 2 凝胶填充线。   
12.通过移液用 1 × TBE冲洗孔。   
13.对于将被评估每个样品,结合4微升10毫摩尔的Ť RIS盐酸pH为8.0,1μl的6 × DNA上样染料(非变性),和1.7 ml离心管1μl的50nM的DNA模板。阳性对照(如果执行)也应以这种方式准备。通过涡旋混合并在小型离心机中旋转。   
关键:必须使用 10 mM T ris-HCl,pH 8.0制备样品。见注 1b。
14.使用加胶移液器吸头将样品加到凝胶上。   
15. 上样3 μl Quick-Load  Purple 100 bp DNA 阶梯(或类似的 100 bp DNA 阶梯)。   
16.在 100 V 下运行凝胶,直到溴酚蓝加载染料到达下凝胶垫圈。   
17.关闭电源,拆卸凝胶装置。   
18.将 3 μl SYBR Gold Nucleic Acid 染料加入150 mm 培养皿中的30 ml 1 × TBE。轻轻旋转盘子以分散污渍。   
19.使用 Mini-PROTEAN 凝胶释放器撬开凝胶板。   
20.小心地将凝胶从板上取下,只接触边缘。将凝胶浸入 SYBR Gold 染色剂中。用铝箔盖住盘子,轻轻摇晃 10 分钟。   
21.使用 Typhoon Biomol ecular Imager(首选方法)或 Dark Reader Blue Light Transilluminator可视化并记录凝胶。   
22.评估 DNA 模板制备的质量。DNA 模板制备应包含与预期的全长 dsDNA 产品相对应的单条带。不应检测到副产品或过量底漆(图 5)。如果在模板制备通过变性 PAGE QC 后通过天然 PAGE 观察到缓慢迁移的条带,则表明 DNA 在制备过程中处理不当(例如,稀释到无缓冲溶液中;参见注释 1b)。   
 
 
图5 。天然 PAGE QC 凝胶示例。dsDNA 模板制剂不含可检测的副产物或寡核苷酸,是预期的长度 (121 bp)。请注意,内部修改的 DNA 模板比未修改的控制迁移稍慢。凝胶图像改编自 Strobel等人。(2020) 补充图 S2B,是使用 Typhoon 9400 生物分子成像仪获得的。
 
使用单轮体外转录评估转录障碍的效率(可选)
内部修饰的 DNA 模板的转录障碍活性可以使用单轮体外转录时间过程进行评估。当使用先前经过验证的 DNA 修饰时,此质量控制步骤是可选的。但是,执行此分析以确信内部修饰的 DNA 模板具有预期的转录障碍活性可能很有用,特别是如果您不熟悉上述协议。
注意:(1)在评估新的 DNA 模板序列时,使用未修改版本的 DNA 模板准备额外的转录反应,以区分停止的 TECs 和流失的转录本。(2)实验描述如下用途[ α- 32 P] -UTP作为放射性示踪剂。使用适当的辐射屏蔽并按照机构协议执行此实验。(3)该程序包括苯酚:氯仿提取和随后的乙醇沉淀去除蛋白质并在测序凝胶电泳之前浓缩样品。这些步骤不是严格要求的,但可以确保 RNA 流动性不受残留蛋白质的影响。
 
1.在开始实验前至少 30 分钟将加热块设置为 37 °C。      
2.在冰上的 1.7 ml 微量离心管中制备体外转录 Master Mix(表 9)。按表 9 中列出的顺序添加每种试剂并按如下方式混合:      
加入 10 × Transcription Buffer 后,涡旋并离心主混合物。
添加除大肠杆菌RNAP以外的所有试剂后,再次涡旋并降速主混合物。
添加大肠杆菌RNAP 全酶,并通过移液轻轻混合完成的 Master Mix。
 
表 9. 用于单轮体外转录的反应预混液。单个体外转录反应的总体积为 25 μl。预混液中省略了MgCl 2,因此转录仅在添加 10 ×起始溶液时启动。
 
1 NTP 浓度为 200 μM ATP、200 μM GTP、200 μM CTP和50 μM UTP,以促进[ α- 32 P]-UTP 掺入。如果使用不同的放射性示踪剂,则相应地调整 NTP 混合。
2关键:BSA 必须是分子生物学级。
3关键:假设库存来自新鲜批次,请在收到后两周内使用 [ α- 32 P]-NTP。
 
3.准备 10 ×起始溶液。      
关键:必须为每个实验新鲜制备10 ×起始溶液。
将 200 μl 100 mM MgCl 2移入 1.7 ml 微量离心管中。
移取 10 μl 2 mg/ml 利福平到 100 mM MgCl 2 中。
注意:利福平通过阻止转录物延伸超过 2-3 nt 来抑制细菌 RNAP。通过添加 MgCl 2和利福平同时启动转录,允许预先形成的开放复合物启动但阻止进一步启动,因此转录是单轮的。
彻底涡旋并在小型离心机中离心10 × Start Solution。
用箔纸覆盖 10 ×起始溶液以避光并保持在室温下。
4.为每个时间点准备一个含有 125 μl 终止液的 1.7 ml 微量离心管,并相应地标记管子。在整个实验过程中将这些管子放在冰上。      
5.执行单轮体外转录时间过程。表 10 显示了具有八个时间点的示例时间课程。      
注意:体外转录时间课程需要快速的样本操作。没有经验的用户应该在进行实验之前用模拟样本练习这些操作。
 
表 10. 单轮体外转录时间过程。通过在37 °C下孵育转录主混合物10 分钟,形成开放启动子复合物。单轮转录通过加入 10 × Start Solution 开始,在每个时间点,将 25 μl 的 Master Mix 转移到含有 125 μl 终止液的试管中,短暂涡旋并保持在冰上。
 
6.向每个样品中加入 150 μl 苯酚:氯仿:异戊醇,pH 8.0。      
7.彻底涡旋样品。      
8.将样品以 18,000 × g和4 °C离心5 分钟。      
9.对于每个样品,准备一个 1.7 ml 微量离心管,其中含有 450 μl 100% 乙醇、15 μl 3 M 醋酸钠,pH 5.5 和 1 μl GlycoBlue 共沉淀剂。      
10.小心地将每个样品的水相(上层)转移到步骤 H9 中制备的相应 1.7 ml 微量离心管中。倒转管数次以混合。   
11.将样品在-20 °C 下过夜以沉淀 RNA。   
12.第二天早上,按如下方法制备 0.4 mm、12% 丙烯酰胺、7.5 M 尿素测序凝胶:注意:丙烯酰胺是一种神经毒素,应谨慎处理。   
注意小号:
在倾倒测序凝胶以防止丙烯酰胺飞溅时,必须穿着实验室外套和安全眼镜 –偶尔,将凝胶梳插入玻璃板之间会导致丙烯酰胺飞溅。
凝胶百分比和运行条件由 RNA 的长度决定。根据 National Diagnostics UreaGel System Protocol,12% 丙烯酰胺单体适用于 10 至 50 nt RNA,8% 用于 40 至 100 nt,6% 用于 60 至 150 nt。
 
用温和的清洁剂和塑料刷彻底清洁长短测序凝胶板,并用去离子水冲洗。用 70% 乙醇冲洗凝胶板,并用轻型纸巾擦干。
注意:定期用 Rain-X 处理短板以帮助释放凝胶板。
用肥皂和去离子水清洁 0.4 毫米梳子和 0.4 毫米垫片,并使用轻型纸巾擦干。
组装测序凝胶进行浇注。有关推荐组件的演示,请参见视频 1 。
在 250 ml 塑料烧杯中,混合 7 ml UreaGel Buffer、29.4 ml UreaGel Diluent、33.6 ml UreaGel Concentrate 和 400 μl 10% APS。小心地摇晃烧杯以混合。
注意:这将制备 12% 丙烯酰胺凝胶。根据需要进行调整。
将 25 μl TEMED 添加到 UreaGel 混合物中并旋转以开始聚合。将混合物吸入 60 毫升注射器,小心地将混合物排出一次以确保完全混合。再次将 UreaGel 混合物吸入注射器。
注意:该协议使用的APS 和 TEMED 比 National Diagnostics UreaGel System 协议中推荐的要少10%,以减缓聚合,以便于凝胶倾倒。
倒入测序凝胶。有关推荐程序的演示,请参见视频1 。
让凝胶聚合 60 到 90 分钟。
 
 
视频 1. 倾倒测序凝胶的推荐程序。演示了倾倒 0.4 mm 大尺寸测序凝胶的简单而可靠的程序。
 
13.当凝胶聚合时,将样品以 20,000 × g和 4°C离心30 分钟。   
14.从每个样品中吸出上清液,同时注意不要干扰蓝色小颗粒。   
15.将样品离心几秒钟以降低残留液体的转速。   
16.用 10 μl移液器吸头吸出残留液体。   
17.向每个样品中加入 6.5 μl 1 ×甲酰胺负载染料。   
18.短暂涡旋样品并使液体向下旋转。   
19.凝胶聚合后,组装测序凝胶装置。ř樱雪孔通过绘制1 ×从上缓冲液槽TBE入60ml注射器中具有弯曲20G 1.5”针和排出TBE入井。有关如何组装 BRL Model S2 测序凝胶装置的演示,请参见视频 2 。   
 
 
视频 2. BRL Model S2 测序凝胶系统的组装。的程序组装凝胶到模型S2测序凝胶系统被证明。
 
20.关闭安全盖,连接引线,并在 1,500 V 下预运行凝胶约 20 分钟。   
21.将样品放入 95 °C 加热块中 5 分钟。将第二个铝块放在样品的顶部,以防止管子打开。   
22.立即将样品置于冰上快速冷却。   
23.使用 Sharpie,标记测序凝胶板以指示每个孔将包含什么样品。标记将在样本之间留空的任何孔。   
24.测序凝胶预运行约 20 分钟后,关闭电源并通过将 1 × TBE 从上缓冲液室吸入带有弯曲 20G 1½” 针头的 60 ml 注射器并再次冲洗孔将 TBE 排入井中。   
25.使用 0.4 mm 凝胶加载尖端小心地将每个样品加载到相应的孔中。   
提示:将移液器体积设置为比样品体积高几微升。这会在样品和尖端之间产生空气缓冲。装载样品时,首先分配空气缓冲液,并在样品排出时将吸头移向孔底。气泡将漂浮在孔中或被轻轻吸出。
注意:在丙烯酸屏蔽后面加载测序凝胶是不可行的。穿上实验室外套和安全眼镜,并通过屏蔽除您加载的样本之外的每个样本来最大程度地减少辐射暴露。可以使用剂量测定徽章监测辐射暴露。
26. 将6.5 μl 1 × Formamide Loading Dye 上样到靠近样品孔的任何空白孔中。这有助于样品通道笔直运行。   
27.关闭上缓冲液室盖并重新连接导线。   
28.在 1,400 V 下运行凝胶2.5 - 3 小时。   
29.使用储能磷屏图像橡皮擦将储能磷屏涂成空白。   
30.关闭电源并拆卸 Model S2 设备。有关如何拆卸 BRL S2 型测序凝胶装置的演示,请参见视频 3 。   
注意:转录反应含有游离的 [ α- 32 P]-UTP ,它们通常会迁移到较低的缓冲室中。因此,下腔室中的缓冲液具有放射性。
 
 
视频 3. BRL Model S2 测序凝胶系统的拆卸。演示了从 Model S2 测序凝胶系统中去除凝胶的过程。
 
31.通过打开板并用塑料包装覆盖暴露的凝胶,准备暴露于储能磷屏的凝胶。有关此过程的演示,请参见视频 4 。   
关键:塑料包装的外表面将与储能磷屏接触,保持完全清洁是绝对关键的。这很容易通过在应用塑料包装时经常更换手套来实现。
注意:如果暴露时间很短(即<16 小时),通常不需要干燥凝胶。
 
 
视频 4 。制备用于存储荧光屏曝光的测序凝胶。演示了用保鲜膜打开和覆盖测序凝胶的过程。
 
32.将包裹好的凝胶放入纸板曝光盒中。   
33.戴上一副干净的手套。打开存储荧光粉盒,仅处理边缘,将屏幕设置在包裹的凝胶上。关闭纸板曝光盒并将存储荧光粉盒放在顶部,以防止屏幕在曝光过程中移动。   
关键:凝胶图像的质量取决于储能磷屏的状况。小心处理储能磷屏。
34.暴露储能磷屏。暴露时间取决于样品活性。我发现 4 - 6 小时通常足以获得清晰的图像。不要过度曝光屏幕至关重要,特别是如果您希望量化您的结果。我通常在短时间曝光(例如4 - 6 小时)后执行扫描,将储能磷屏消隐,然后进行第二次过夜曝光。   
35.使用磷光成像模式在台风生物分子成像仪上扫描磷屏。   
36.评估 DNA 模板的转录障碍活性(图 6)。由于预计 100% 的 TEC 会在内部修饰部位停滞,因此该分析通常可以是定性的。例如,在下面的实验中,径流转录本仅在 4 分钟的时间点开始变得可见,表明内部 DNA 修饰有效地停止了 RNAP。   
 
 
图6 。单轮体外转录时间过程示例。除动力学分析的 24 个时间点外,按本协议所述进行的单轮体外转录时间过程;本协议中建议的 8 个时间点足以评估转录障碍活动。在这个实验中没有进行未经修改的阳性对照,因为停滞和流失转录物的精确位置已经确定。数据改编自 Strobel等人。(2020) 图 4。
 
笔记
 
关于再现性和可变性的说明。在撰写本文时,我已在两个实验室环境中多次执行此协议,并且上述程序已成为我实验室的常规程序。大多数制剂使用脱硫生物素-TEG或生物素-TEG 作为内部修饰,模板编码六种不同的 RNA,以及 Q5 高保真 DNA 聚合酶、Q5U 热启动高保真 DNA 聚合酶和 Vent  (exo-) DNA聚合酶已用于 PCR。以下部分描述了我的一般观察。
Translesion 合成效率。Sulfolobus DNA Polymerase IV 的转移合成非常有效,并且在我使用程序 B 中描述的经过验证的修改进行的每个内部修改的 DNA 模板制备中都已经完成(在变性 PAGE QC 的检测范围内)。这与我的一致通过引物延伸对硫叶菌DNA 聚合酶 IV绕过 DNA 修饰的评估:图 2 中所示的 DNA 修饰的引物延伸效率与未修饰的对照(Strobel等,2020)之间没有明显差异。我观察到可检测到不完全转移合成的唯一情况是在尝试构建具有复杂停滞位点的 DNA 模板时,该模板包含连续的内部生物素-TEG、5-丙炔基-dC 和生物素-11-dT 修饰;即使在这种情况下,translesion 合成也完成了 ~99%。在这种情况下,有可能通过用 Vent  DNA 聚合酶代替 Vent (exo-)来完成跨损伤合成反应,这样可以通过 3'  5' 外切核酸酶介导的降解来挽救停滞的病变旁路尝试。但是,我的实验室尚未广泛测试此程序。
DNA双链稳定性。在大多数实验中,修饰位点下游的 DNA 双链体将很短(在我目前使用的配置中为 29 和 31 bp),因为它附加了引物。因此,如果处理不当(例如,稀释到无缓冲溶液中),DNA 模板的这个区域可能会磨损。尽管通过变性 PAGE QC 仅观察到全长产品,但本机 PAGE QC 可检测到末端磨损是一种缓慢迁移的产品(图 7)。只需始终保持 DNA 模板缓冲即可避免末端磨损。作为额外的保护措施,可以使用提高热稳定性的 dNTP 2-氨基-dATP 和 5-丙炔基-dCTP 以及 dGTP 和 dTTP 来进行跨损伤合成,我最初将其描述为替代方案,因为预期末端磨损是一个潜在问题(Strobel等人,2020 年)。当 DNA 在水中稀释时,增强热稳定性的 dNTP 减少了末端磨损的发生(图 7 B ),但不能替代适当的样品缓冲。
 
 
图7 。出现缓慢迁移的 DNA 产物。A.跨损伤合成后,当使用标准 (S) 和热稳定性增强 (TS) dNTP 进行跨损伤合成时,变性 PAGE QC 只能检测到全长产物。B.的稀释初级DNA模板库存到无核酸酶水或10mM之后在(A)中所示的模板变性PAGE QC Ť RIS-HCL,pH 8.0中。当 DNA 稀释到水中时,提高热稳定性的 dNTP 减少了缓慢迁移产物的形成,并且在稀释到 10 mM T ris-HCl,pH 8.0 后,在两种制剂中均未观察到缓慢迁移产物。
 
屈服。产量取决于 PCR 的规模和使用的纯化程序。根据我的经验,如果通过琼脂糖凝胶提取(程序 E)纯化,500 μl Q5  PCR 将产生~20 到 ~40 pmols 的 DNA 模板,如果通过 exoI 处理和硅胶柱清理纯化,将产生 ~70 到 ~100 pmols(程序 F)。
PCR聚合酶的选择。上述方案已经过验证,可用于 Q5 高保真 DNA 聚合酶、Q5U 热启动高保真 DNA 聚合酶和 Vent  (exo-) DNA 聚合酶。我的实验室目前使用 Q5 系列酶进行大多数应用,因为它们的保真度很高。对于不需要高保真聚合酶的常规应用,Vent  (exo-) 是理想的选择,因为它使用与Sulfolobus DNA 聚合酶 IV相同的反应缓冲液。因此,对于使用 Vent  (exo-) 进行 PCR 和标准 dNTP 进行跨损伤合成的DNA 制备,只需在每 100 μl PCR 中加入 1 μl Sulfolobus DNA 聚合酶 IV ,孵育反应即可进行跨损伤合成反应在 55°C 下保持 1小时,然后进行上述纯化和 QC。原则上,用于 PCR 的 DNA 聚合酶不应影响上述程序的结果,因为正如所写的,该协议包括硅胶柱纯化步骤,用于在 PCR 后更换反应缓冲液,以便始终在最佳条件下进行转移合成。
在跨损伤合成过程中包含 Vent (exo-)。尽管单独使用硫叶菌DNA 聚合酶 IV 就足以完成跨损伤合成(Strobel等人,2020 年),但我目前的方案在跨损伤合成期间包括 Vent (exo-),以减少修饰位点下游 dsDNA 中出现错误的可能性:因为 DNA p olymerase IV只包含每结合事件1-2 NTS,可能的是通风口(外切)到截短的DNA的完整合成链一旦内部修改已经由旁路硫化叶DNA聚合酶IV。据报道,Vent (exo-) 的错误掺入频率为 1.9 × 10 -4 (Mattila et al. , 1991) ,而硫化叶菌DNA 聚合酶 IV的错误掺入频率介于 8 × 10 -3和 3 × 10 -4 之间, 取决于序列上下文(Boudsocq et al. , 2001) 。
成功执行协议的提示。以下提示描述了几种方式,其中我在样品处理使精确度和减少可变性。这些建议是一般性的,有经验的读者会很熟悉,但可能有助于经验不足的研究人员成功执行上述程序。
在每一步都戴上丁腈手套,既是为了个人保护,也是为了最大限度地减少样品污染的可能性。定期更换手套以防止交叉污染。
在无 RNase 的环境中执行所有生化操作。
尽可能使用商用无 RNase 水和溶液为小规模生化反应制备溶液。
使用定量移液操作。阅读吉尔森移液指南了解更多信息。
根据移液量选择合适的移液器。
确保您的移液器已校准。
使用低滞留移液器吸头。
吸取液体时保持移液器垂直。
平稳、轻柔地吸出和排出液体。
将移液器吸头浸入适当的深度,以最大程度地减少吸头外侧多余液体的积聚——这因移液器吸头而异,但通常约为 3 毫米。移液体积<1时的例外是微升用于其尖端应只浸入〜1毫米到液体中。
如果移液器吸头外侧确实积聚了多余的液体,请擦拭要移液的管子边缘的吸头以去除任何液滴。
大多数移液器吸头都有刻度,可用于近似吸头中的液体体积-目视检查吸头以确认您移液的体积正确且一致。
将浓缩试剂分配到另一种液体中后,用移液器上下吸管数次以冲洗吸头上的残留液体。
每次采样后更换吸头。重复使用吸头会降低准确性并增加交叉污染错误的可能性。
确保充分混合样品。
除酶外,一旦反应组分解冻,请务必混合并减慢反应组分。
将浓缩缓冲液稀释到水中后,在加入其他反应组分之前涡旋并离心样品。
一旦将酶添加到反应中,所有后续混合都应通过轻柔移液完成。
在处理过程中目视检查您的样品,尤其是在处理小体积时。
确保充分加热和冷却样品。
验证使用一个高精度与探针数字温度计或在使用前的模拟数字温度计加热块温度-不Ñ ö吨假定热块上的数字读出是正确的。
使用 Lab Armor TM磁珠进行加热块孵育,以确保有效加热样品。或者,用去离子水部分填充铝制加热块的孔。我更喜欢 Lab Armor TM珠子来保持试管干燥。
在冰上准备酶促反应时,使用铝块作为管架,以尽量减少管外液体的积聚。这有助于在样品处理过程中保持手套干燥。
如果可能,将离心机设置为向上计数。这确保了紧密的颗粒,因为您的样品将继续旋转,直到您在开始处理它们之前停止离心机。
 
食谱
 
DEPC 处理的 Milli - Q 水(制作 1.5 L)
将 1.5 L Milli - Q 水添加到 2 L 可高温高压灭菌的介质瓶中。
在瓶子里加入一个大搅拌棒。
添加 1.5 ml DEPC the Milli - Q 水,使其浓度为 0.1% v/v。紧紧地关闭瓶子。
注意:DEPC 必须在化学通风橱中处理。
将瓶子放在磁力搅拌板上搅拌过夜。
第二天早上,将瓶子放在化学通风橱中,打开盖子释放积聚的二氧化碳气体。
使用液体循环将 DEPC 处理的水高压灭菌 30 分钟。
注意:高压灭菌时培养基瓶盖必须松开。
在室温下储存。
10 mM Tris-HCl,pH 8.0(1 毫升)
将 990 μl 无核酸酶水移入 1.7 ml 微量离心管中。
添加 10 μl 无 RNase 的 Tris-HCl,pH 8.0。
彻底涡旋并在小型离心机中离心。
存储在RT 。
提高热稳定性的 dNTP 解决方案
准备一个含有表 11 中试剂的 1.7 ml 微量离心管。
彻底涡旋溶液并在小型离心机中离心。
储存在-20 °C。
 
表 11. 提高热稳定性的 dNTP 溶液的配方
 
1 × TBE(三硼酸盐-EDTA)缓冲液(20 L)
(89 mM tris 碱、89 mM 硼酸、2 mM Na 2 EDTA,pH 8.3)
注意小号:
如果以≥ 5 ×浓度制备,TBE 会迅速沉淀。我建议以 3 ×的最大浓度制备 TBE 。此配方适用于 1 × TBE ,它将保留在溶液中。
通过使用 2 L 量筒用 20 L 去离子水填充 TBE 溶液,确定并标记用于盛装 TBE 溶液的 20 L 填充线是很有用的。
 
用 ~3 L Milli - Q 水填充 4 L 烧瓶。
添加一个大搅拌棒并将烧瓶放在磁力搅拌板上。
以 ~180 RPM 开始搅拌。
称量 215.6 克三碱 (MW 121.14 克/摩尔) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
称取 110 克硼酸 (MW 61.83 克/摩尔) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
称取 14.89 g Na 2 EDTA ·2H 2 O (MW 372.24 g/mol) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
让试剂溶解。此时可能需要添加额外的 Milli - Q 水。
将 4 L 烧瓶的内容物转移到 20 L 大瓶中。
用 ~3.5 L Milli - Q 水填充 4 L 烧瓶并将其倒入大瓶中。
用 Milli - Q 水将 20 L 瓶装满至先前确定的 20 L 加注线。定期摇动大瓶以混合溶液。
存储在RT 。
70% (v/v) 乙醇(50 毫升)
移取 15 ml 无核酸酶水到 50 ml 锥形管中。
将 35 毫升 100% 乙醇移入锥形管中。
剧烈摇晃混合。
储存在-20 °C。
10% (w/v) SDS(制作 50 毫升)
将 5 克 SDS 溶解在 50 毫升锥形管中的约 40 毫升经 DEPC 处理的 Milli - Q 水中。
注意:缓慢旋转将有助于 SDS 溶解,而不会导致形成过多气泡。
将溶液转移到 50 ml 量筒中,并使用 DEPC 处理的 Milli - Q 水将体积调节至 50 ml 。
将溶液转移回 50 ml 锥形管中,并通过倒置管轻轻混合。
在室温下储存。
6 × DNA Loading Dye,+SDS,仅二甲苯氰(25 ml)
[ 10 mM Tris pH 8.0,30 %甘油,0.48% SDS,0.05% (w/v) 二甲苯氰 FF ]
注意小号:
SDS 用于从 DNA 中去除蛋白质复合物。
本配方中不使用溴酚蓝,因为它通常会迁移到 DNA 模板条带附近,因此除非使用紫外线,否则会掩盖 DNA 的可见性。重要的是不要使用溴酚蓝作为加载染料,这样 DNA 模板带可以在没有紫外线照射的情况下被切除。
在 50 ml 锥形管中称量 9.38 g 甘油。
在 1.7 ml 微量离心管中称量 ~ 12.5 mg 二甲苯氰 FF。
将二甲苯氰 FF 溶解在 1 ml DEPC 处理过的 Milli - Q 水中,并加入到 50 ml 试管中。
将 15.05 毫升经 DEPC 处理的 Milli - Q 水加入 50 毫升管中,并通过涡旋和倒转管彻底混合。
加入 0.25 ml 无核酸酶的 1 M Tris pH 8.0,并通过涡旋彻底混合。
向锥形管中加入 1.2 ml 10% SDS ,轻轻颠倒管混合。
根据需要将 1 ml 等分试样转移到 1.7 ml 微量离心管中。
存储在RT 。
10% (w/v) APS(制作 10 毫升)
将 1 g APS 添加到 50 ml 锥形管中。
加入 7 ml 高压灭菌的 Milli - Q 水并涡旋以溶解。
将体积提高到 10 毫升。
转移410个μ升等分至1.7 ml离心。
储存在-20 °C。每份足以倒入一个测序凝胶。
1 ×甲酰胺加载染料(制作 10 毫升)
[ 90% (v/v) 去离子甲酰胺,1 ×转录缓冲液,0.05% (w/v) 溴酚蓝]
注意:甲酰胺原液瓶必须在化学通风橱中处理。
在 1.7 ml 微量离心管中称取约 5 mg 溴酚蓝。
用 1 ml 10 × Transcription 缓冲液溶解溴酚蓝并转移到 50 ml 锥形管中。
加入 9 ml 去离子甲酰胺并彻底涡旋。
储存在4 °C。
3 × TBE 缓冲液(使 4 L)
(267 mM tris 碱、267 mM 硼酸、6 mM Na 2 EDTA,pH 8.3)
用 ~3 L Milli - Q 水填充 4 L 烧瓶。
添加一个大搅拌棒并将烧瓶放在磁力搅拌板上。
以 ~180 RPM 开始搅拌。
称量 129.4 克三碱 (MW 121.14 克/摩尔) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
称取 66 克硼酸 (MW 61.83 克/摩尔) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
称取 8.93 g Na 2 EDTA ·2H 2 O (MW 372.24 g/mol) 并将其缓慢添加到烧瓶中。
让试剂溶解。此时可能需要添加额外的 Milli - Q 水。
使用 1 L 量筒一次将 3 L 溶液转移到 4 L carboy 1 L。
将剩余的溶液倒入量筒中。
用 Milli - Q 水将体积提高到 1 L,然后转移到瓶中。
摇匀大瓶。
存储在RT 。
6 × DNA Loading Dye(非变性)(25 ml)
[ 10 mM Tris pH 8.0,30% 甘油,0.05% (w/v) 溴酚蓝]
在 50 ml 锥形管中称量 9.38 g 甘油。
在 1.7 ml 微量离心管中称取约 12.5 mg 溴酚蓝。
将溴酚蓝溶解在 1 ml DEPC 处理过的 Milli - Q 水中,并加入到 50 ml 管中。
将 16.25 毫升经 DEPC 处理的 Milli - Q 水加入 50 毫升管中,并通过涡旋和倒转管彻底混合。
加入 0.25 ml 无核酸酶的 1 M Tris pH 8.0,并通过涡旋彻底混合。
根据需要将 1 ml 等分试样转移到 1.7 ml 微量离心管中。
存储在RT 。
1 M DTT(制作 10 毫升)
称量 1.54 克 DTT(MW 154.25 克/摩尔)。
将 DTT 溶解在 50 ml 锥形管中的 7 ml 无核酸酶水中。
将溶液转移到 10 毫升量筒中。
使用无核酸酶的水将体积调节至 10 ml。
将 0.2 μm PES 注射器过滤器连接到 10 ml 注射器。
通过将 5 ml 无核酸酶的水吸入注射器来预湿过滤器。丢弃水。
通过注射器过滤器将 1 M DTT 库存分配到干净的 50 ml 管中。
将 1 ml 等分的无菌1M DTT 溶液转移到 1.7 ml 微量离心管中。
储存在-20 °C。
100 mM DTT(制作 10 毫升)
将 9 ml 无核酸酶水和 1 ml 无菌 1 M DTT 混合在 50 ml 锥形管中。
彻底涡旋。
将 1 ml 等分的 100 mM DTT 溶液转移到 1.7 ml 微量离心管中。
储存在-20 °C。
10 ×转录缓冲液(10 ml)
准备一个含有表 12 中试剂的 50 ml 锥形管。
彻底涡旋溶液。
将 1 ml 等分的 10 ×转录缓冲液转移到 1.7 ml 试管中。
储存在-20 °C。
 
表 12. 10 ×转录缓冲液的配方
 
20 × NTP 溶液(0.5 毫升)
关键:必须使用高纯度 rNTP 溶液制备 NTP 库存。我建议使用 Cytiva Life Sciences 的高纯度 rNTP 组(目录号:27202501)。
注意:下面描述的 20 × NTP 溶液限制了 UTP 浓度,以促进使用[ α- 32 P]-UTP 进行内部 RNA 标记。如果您使用不同的核苷酸作为放射性示踪剂,您必须准备单独的 20 × NTP 溶液,其中用于放射性标记的核苷酸浓度是有限的。
准备一个含有表 13 中试剂的 1.7 ml 微量离心管。
彻底涡旋并在小型离心机中离心。
储存在-20 °C。
 
表 13. 20 × NTP 溶液的配方
 
5 mg/ml BSA(制作 200 μl)
向 1.7 ml 微量离心管中加入 180 μl 无核酸酶水。
向管中加入 20 μl UltraPure TM BSA (50 mg/ml)。
彻底涡旋并在小型离心机中离心。
储存在-20 °C。
2 毫克/毫升利福平(10 毫升)
注意:利福平对光敏感。利福平原液在处理过程中应使用铝箔避光。
在 1.7 ml 微量离心管中称取 20 mg 利福平。
将利福平溶解在 1 ml DMSO 中并转移到 50 ml 锥形管中。
注意:DMSO 库存瓶必须在化学通风橱中处理。
将 9 ml DMSO 移入锥形管中。
彻底涡旋。
将 1 ml 2 mg/ml 利福平溶液的等分试样转移到 1.7 ml 微量离心管中。
储存在-20 °C 避光。
1 M Tris-HCl,pH 8.0(制作 1 L)
称量 121.14 克三碱 (MW 121.14 克/摩尔)。
使用磁力搅拌板将 tris 碱溶解在 ~800 ml Milli - Q 水中。
在 tris 溶解时清洁和校准 pH 计。在将电极插入 tris 溶液之前,用 Milli - Q 水彻底冲洗电极。
注意小号:
使用合适的电极测量 tris 溶液的 pH 值至关重要。我使用梅特勒托利多 S220-Bio SevenCompact 台式 pH/离子计(梅特勒托利多,S220-Bio)。
在开始制备溶液之前立即使用新鲜标准校准 pH 计是一种很好的做法。
在测量 tris 溶液的 pH 值时,通过缓慢加入浓盐酸,同时监测 pH 值,小心地将 pH 值调节至 8.0。
注意:pH 值取决于温度。在对 pH 值进行最终调整时,溶液应为室温。
注意:浓 HCl 具有很强的腐蚀性,应使用适当的 PPE 并在化学通风橱中进行处理。
将 tris 溶液转移到 1 L 量筒中,并用 Milli - Q 水将体积调节至 1 L。
将 tris 溶液转移回 2 L 烧杯并打开搅拌板,使溶液完全混合。再次验证 pH 值为 8.0。
将 500 ml 的 1 M T ris-HCl 溶液分装到两个 1 L 可高压灭菌的培养基瓶中,并使用液体循环高压灭菌 30 分钟进行灭菌。
注意:中号EDIA瓶盖必须是松散当高压灭菌。
存储在RT 。
0.5 M EDTA ,pH 8.5(制作0.5 L)
清洁和校准 pH 计。用 Milli - Q 水彻底冲洗电极。
称量 93.06 克 Na 2 EDTA ·2H 2 O(MW 372.24 克/摩尔)。
使用磁力搅拌板将Na 2 EDTA ·2H 2 O与 ~400 ml Milli - Q 水混合,并将 pH 计电极插入溶液中。
在搅拌的同时缓慢加入 NaOH 颗粒。
注意:Na 2 EDTA ·2H 2 O 直到溶液的pH 值为~8.0 才会溶解。注意不要一次添加过多的 NaOH颗粒,否则会超出所需的 pH 值。
一旦 Na 2 EDTA ·2H 2 O 完全溶解且 pH 值为 8.5,将溶液转移到 500 ml 量筒中并将体积调节至 500 ml。
将溶液转移回烧杯,打开搅拌板,使溶液充分混合。再次验证 pH 值为 8.5。
将溶液转移到 1 L 可高温高压灭菌的介质瓶中,并使用液体循环高压灭菌 30 分钟。
注意:高压灭菌时培养基瓶盖必须松开。
存储在RT 。
停止溶液(使 50 毫升)
准备一个含有表 14 中试剂的 50 ml 锥形管。
彻底涡旋。
将 10 ml 等分试样转移到 15 ml 锥形管中。
储存在-20 °C。
 
表 14. 停止溶液的配方
 
致谢
 
这项工作得到了布法罗大学研究基金会(EJS)启动资金的支持。该协议源自 Strobel等人提出的原始研究。(2020) 。
 
利益争夺
 
没有宣布竞争利益。
 
参考
 
Belogurov, GA 和 Artsimovitch, I. (2019)。延长 RNA 聚合酶的底物选择、催化和易位机制。J Mol Biol 431(20):3975-4006。
Boudsocq, F.、Iwai, S.、Hanaoka, F. 和 Woodgate, R. (2001)。Sulfolobus solfataricus P2 DNA 聚合酶 IV (Dpo4):一种古菌 DinB 样 DNA 聚合酶,具有类似于真核细胞的病变旁路特性。核酸研究29(22):4607-4616。
Buenrostro, JD, Araya, CL, Chircus, LM, Layton, CJ, Chang, HY, Snyder, MP 和 Greenleaf, WJ (2014)。大规模平行阵列上 RNA-蛋白质相互作用的定量分析揭示了生物物理和进化景观。Nat Biotechnol 32(6): 562-568。
核心,LJ,瀑布,JJ 和 Lis,JT(2008 年)。新生 RNA 测序揭示了人类启动子的广泛暂停和不同起始。科学322(5909):1845-1848。
Frieda, KL 和 Block, SM (2012)。直接观察腺嘌呤核糖开关中的共转录折叠。科学338(6105):397-400。              
Korzheva, N.、Mustaev, A.、Kozlov, M.、Malhotra, A.、Nikiforov, V.、Goldfarb, A. 和 Darst, SA (2000)。转录延伸的结构模型。科学289(5479):619-625。              
Marr, MT 和 Roberts, JW (1997)。通过聚合酶与非模板链寡核苷酸的结合来测量启动子识别。科学276(5316):1258-1260。
Mattila, P.、Korpela, J.、Tenkanen, T. 和 Pitkanen, K. (1991)。Thermococcus litoralis DNA 聚合酶的 DNA 合成保真度 - 一种具有校对活性的极其热稳定的酶。核酸研究19(18):4967-4973。              
Pan, T. 和 Sosnick, T. (2006)。转录过程中的RNA折叠。Annu Rev Biophys Biomol 结构35:161-175。              
Pavco, PA 和 Steege, DA (1990)。大肠杆菌 RNA 聚合酶的延伸在体外被位点特异性 DNA 结合蛋白阻断。J Biol Chem 265(17): 9960-9969。
Pupov, D.、Ignatov, A.、Agapov, A. 和 Kulbachinskiy, A.(2019 年)。DNA 损伤对大肠杆菌RNA 聚合酶合成 RNA 的不同影响。Biochem Biophys Res Commun 510(1): 122-127。              
Selby, CP 和 Sancar, A. (1993)。转录-修复偶联的分子机制。科学260(5104):53-58。              
Selby, CP 和 Sancar, A. (1994)。转录修复耦合和突变频率下降的机制。微生物修订版58(3):317-329。              
斯特罗贝尔,EJ(2021 年)。通过从磁珠中选择性光洗脱制备大肠杆菌RNA 聚合酶转录延伸复合物。生物化学杂志297 :100812 。
Strobel、EJ、Lis、JT 和 Lucks,JB(2020 年)。用于新生 RNA 展示的 DNA 转录的化学障碍。J Biol Chem 295(19): 6401-6412。
Strobel, EJ, Watters, KE, Nedialkov, Y., Artsimovitch, I. 和 Lucks, JB (2017)。用于绘制共转录 RNA 折叠的分布式生物素-链霉亲和素转录障碍。核酸研究45(12):e109。
Svetlov, V. 和 Artsimovitch, I. (2015)。细菌 RNA 聚合酶的纯化:工具和方案。方法 Mol Biol 1276:13-29。              
Tome, JM, Ozer, A., Pagano, JM, Gheba, D., Schroth, GP 和 Lis, JT (2014)。通过高通量测序-RNA 亲和力分析对 RNA-蛋白质相互作用进行综合分析。Nat 方法11(6): 683-688。              
Vassylyev, DG, Vassylyeva, MN, Perederina, A., Tahirov, TH 和 Artsimovitch, I. (2007 a )。细菌RNA聚合酶转录延伸的结构基础。自然448(7150):157-162。              
Vassylyev, DG, Vassylyeva, MN, Zhang, J., Palangat, M., Artsimovitch, I. 和 Landick, R. (2007 b )。细菌 RNA 聚合酶中底物装载的结构基础。自然448(7150):163-168。
Watters, KE, Strobel, EJ, Yu, AM, Lis, JT 和 Lucks, JB (2016)。核糖开关在核苷酸分辨率下的共转录折叠。Nat Struct Mol Biol 23(12): 1124-1131。
Widom, JR, Nedialkov, YA, Rai, V., Hayes, RL, Brooks, CL, 3rd, Artsimovitch, I. 和 Walter, NG (2018)。配体调节核糖开关折叠和转录暂停之间的交叉耦合。摩尔细胞72(3):541-552 e546。              
Widom, JR, Rai, V., Rohlman, CE 和 Walter, NG (2019)。基于可逆 dCas9 结合的多功能转录控制。RNA 25(11):1457-1469。
 
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  1. Strobel, E. J. (2021). Preparation and Characterization of Internally Modified DNA Templates for Chemical Transcription Roadblocking. Bio-protocol 11(17): e4141. DOI: 10.21769/BioProtoc.4141.
  2. Strobel, E. J., Lis, J. T. and Lucks, J. B. (2020). Chemical roadblocking of DNA transcription for nascent RNA display.J Biol Chem 295(19): 6401-6412.
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