材料和试剂

1. 1.5 ml 微量离心管（Axygen ® ，目录号：MCT-150-C）
2. 15 ml 离心管（Corning，Costar，目录号：CLS430052）
3. 50 ml 离心管（Corning，Costar，目录号：CLS430291）
4. 24 孔平底板（Corning，Costar，目录号：CLS3738）
5. 96 孔圆底板（Corning，Costar，目录号：CLS3367）
6. 96 孔平底板（Corning，Costar，目录号：CLS3370）
7.非排气 T75 烧瓶（Corning，Costar，目录号：CLS3814）
8. 3 ml 圆底聚苯乙烯管（Becton Dickinson ，目录号：156758）
9.无菌 V 通道储液器（VWR，目录号：VWRI613-1174）
10.无菌14毫米培养皿（VWR，目录号：VWRI390-1373）
11.无纺布过滤器（Antoshin）
12.铝箔
13.锂肝素真空吸尘器（Becton Dickinson，目录号：367880）
14. Clot activator vacuteiners（Becton Dickinson，目录号：367820）
15. P. cynomolgi Berok 红细胞培养（Bruce Russell，奥塔哥大学）（Chua等人，2019）
16. Macaca fascicularis erythrocytes (Monash Animal Research Platform, Monash University)
17.米。束状血清（Monash Animal Research Platform, Monash University）
18. Pre-immune 和P. vivax抗体 (Yang Cheng, 江南大学) (Shen et al. , 2021)
19.补充有 GlutaMAX（Gibco，目录号：61870-036）的 RPMI 1640 培养基
20. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
21. D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
22.次黄嘌呤（Calbiochem，目录号：4010BC）
23. PBS 片剂（Gibco，目录号：18912014 ）
24. Giemsa（VWR，目录号：352603R）
25.甲醇（Fisher Scientific，目录号：A412-4）
26. Hoechst（Sigma-Aldrich，目录号：63493）
27. Mitotracker Deep Red（Thermo Fisher Scientific，FM Molecular Probes，目录号：22426）
28.完整培养基（见食谱）

设备

II类微生物安全柜
微孔板轨道振荡器
多通道移液器（12 通道移液器，10-100 μl）（Thermo Scientific TM ，目录号：4661070N）
台式平板离心机（Eppendorf，型号：5804R ）
带 100 ×油浸镜头的光学显微镜（NIKON，型号：YS100）
Canto II 流式细胞仪（Becton Dickinson，Canto II）
将气体与 5% O 2 、5% CO 2和其余与 N 2 混合
缺氧培养箱（Stemcell，目录号：27310）
37 ℃培养箱
4 °C冰箱
-20 °C冰箱

软件

FACSDiva 6.1.3 软件（Becton Dickinson）
Flowjo, LLC (Becton Dickinson, Tree Star Inc, https://www.flowjo.com/contact )
Microsoft Excel（微软，https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel）
Prism 8（GraphPad，https ://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）

程序

P arasite文化
解冻一含有冷冻小瓶1 ml的的P.食蟹猴Berok寄生使用一系列以逐滴方式氯化钠溶液红细胞，根据莫尔等人。( 2008) 。
在 24 孔板中的完整培养基中重新悬浮颗粒状寄生红细胞，并在 37 °C培养箱中充满三混合气体的缺氧培养箱中以 5% 血细胞比容培养寄生虫培养物。
过夜孵育后，在有25厘米扩大在非排气式烧瓶中的寄生的红细胞之前检查成功的寄生虫成熟2使用在5％血细胞比容的细胞培养烧瓶中号。食蟹猴红细胞，根据蔡氏等人。( 2019) 。
如果寄生虫培养显示š早期滋养体和裂殖体阶段的混合物（1：1）寄生的红细胞中的实验天前2天，执行一个“快速和肮脏的”培养的同步。

“又快又脏”的文化同步
实验前约 30 小时，在室温下以 1,114 × g沉淀寄生虫培养物（至少 2 ml 培养物，5% 血细胞比容）2 分钟。
将上清液（完全培养基）置于单独的 50 ml Falcon 管中。
小心吸并除去沉淀的红细胞（裂殖的棕黑色着色顶层即用移液管手动没有egressed）。
使用新的移液器吸头，用先前留出的上清液轻轻地重悬沉淀的红细胞，然后将混合物转移到无排气孔的 T75 烧瓶中。气体与三混合气体 5 秒，并在 37 °C下孵育烧瓶过夜。
检查隔夜寄生的红细胞是否在第二天下午成熟到裂殖体阶段（至少 70%）。

GIA 抗体制备
在冰上解冻冷冻的抗体小瓶，并在寄生红细胞培养物中确认裂殖体成熟后准备新鲜的。
在抗体稀释板中，用 200 μl 无菌水填充 96 孔圆底板的所有外孔。
注意：如果使用平孔底板，请将板放置在一定角度，以确保在每个孔的底部进行一致的移液。
标记板indicat的盖Ë与抗体名称的行和列从“1”到“10”。
用 20 μl 完整培养基标记“2”到“10”的种子孔（参见图 1A 的板布局）。
用培养基将相应的抗体稀释到各自标有“1”的孔中，最终体积为 30 μl，浓度为1 mg/ml。
通过将 10 μl 从“1”孔转移到“2”孔进行三倍连续稀释。通过移液混合。
重复抗体的连续稀释，直至孔“10” 。

图 1. 抗体和实验板布局。蓝色结肠ü红井显示装有200微升无菌水打井。空白表示为“X”。A.带有标签的抗体板布局图，从 A 行到 H 行表示抗体。第 1 到 12 列表示抗体浓度下降。橙色的colo ü红井表示20个微升完全培养基（CM）作为抗稀释剂。B.实验板布局的插图，带有标签指示来自 A 行到 H 行的抗体和浓度从 1 到 10。B 行包含阳性对照，G 行包含阴性对照。深红色孔表示含有感染的孔红细胞 (iRBC) ，浅红色孔表示未感染的红细胞 (uRBC)。

P.食蟹Berok GIA -设置了
在设置之前，确保大多数寄生红细胞处于中晚期裂殖体阶段（培养中至少 70% 的寄生红细胞，每个裂殖体至少含有8 个裂殖子）。
为了尽量减少培养基蒸发，用 200 μl 无菌水填充 96 孔圆底或平底板的所有外孔，并在缺氧培养箱中放置一个装有无菌水的14 mm培养皿。
用“1”至“10”孔标记板盖，以一式两份标明抗体名称及其相应的测试稀释度。包括一排阳性和阴性对照孔（参见图 1B 的板布局）。
种子阴性对照孔与 70 μl未感染的红细胞在 1% 血细胞比容。
在 1% 血细胞比容和 0.5%寄生虫血症下接种70 μl寄生红细胞的种子阳性对照孔。
每个测试孔的最终体积为 70 μl。Ç alculate沉淀的红细胞的体积为70的最终体积微升/孔在1％血细胞比容和0.5％的寄生虫血症。然而，由于抗体将被稀释 10倍以达到 100 μg/ml 的最终浓度，因此用 63 μl/孔的完整培养基体积重新悬浮沉淀的红细胞。
将混合物转移到无菌V 型槽中。
在将63 μl 寄生虫培养物移入每个测试孔之前，通过轻轻上下移液来混合储液器中的溶液，以确保溶液均匀。
使用多通道移液器将 7 μl 抗体（来自步骤 C6）添加到每个孔中，一式两份。
在37 °C 下用三混合气体冲洗缺氧孵化器室中的板。
为了在此 2 周期测定中的裂殖子入侵的第二周期保持健康的寄生红细胞培养物，在孵育后 48 小时向每个孔中添加7 μl 完整培养基（含新鲜补充的血清）。

P. cynomolgi Berok GIA–染色
孵育后96 小时，轻轻重悬寄生虫培养物，然后将 20 μl 提取到新的 96 孔圆底板中进行染色。
通过在室温下以400 × g的速度在离心机中旋转平板5 分钟，以低减速使红细胞沉淀。
用 8 μM Hoechst 34580 和 150 nM Mitotracker Deep Red FM 在 1 × PBS 中制备最终体积为 5 0 μl/孔的染色 MasterMix 。
旋转完成后，从每个孔中取出尽可能多的上清液。
用 50 μl 染色 MasterMix 重悬沉淀的红细胞。
在室温下以 120 rpm 的速度在微孔板轨道振荡器上孵育板20 分钟。为防止染料淬灭，请用一大片铝箔（可重复使用）盖住摇床。
通过在室温下以400 × g的速度在离心机中旋转平板5 分钟，以低减速使红细胞沉淀。
去除尽可能多的上清液，并用 200 μl PBS洗涤细胞。
重复离心和洗涤步骤Ş两次。
在 200 μl PBS 中重悬细胞，并将混合物转移到 3 ml 圆底聚苯乙烯管中，以便在流式细胞仪上进行分析。

通过流式细胞术分析 Hoechst 34580 + /Mitotracker Deep Red FM +寄生红细胞
使用 FACS 测量寄生虫血症。
每个样本记录 50,000 到 100,000 个细胞。
将数据导出为 fsc 文件格式。

数据分析

使用Flowjo 软件，对单个细胞进行门控（x 轴：SSC-H，y 轴：FSC-H），然后根据单细胞群体选择相应的检测器通道并门控双阳性 Hoechst 34580 + /Mitotracker Deep Red +人口。
将门控人口值导出到 Excel 软件。
从测试样品中减去基线值（阴性对照）。
将值从 Excel 软件复制到 GraphPad Prism 8 软件。
为了比较不同药物浓度下 Hoechst 34580 + /Mitotracker Deep Red +活寄生虫的百分比，首先对药物浓度进行 log 2转换，然后将数据值标准化。
使用四参数逻辑模型或 log（抑制剂）与响应 - 可变斜率函数进行剂量响应曲线拟合。
使用单向方差分析和 Tukey 事后检验函数比较各种抗体的平均 IC 50值。

食谱

完整的文化媒体
RPMI-1640 培养基、GlutaMAX TM补充剂、HEPES 以及以下添加剂：
2.5 毫升 HEPES (1 M)
1.0 g/L D-(+)-葡萄糖
0.05 克/升次黄嘌呤
20% (vol/vol) M . 束状血清
无菌过滤器并储存在 4 °C

致谢

这窝K值是由医学科学的江原大学2020年研究所（JH H）的研究基金的支持，并通过从BR实验室（BR）的马斯登基金17 U00-241。该协议改编自沉等人。(2021)。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的经济利益。

参考

Amaratunga, C., Neal, AT 和 Fairhurst, RM (2014)。在环期存活试验中对青蒿素抗性恶性疟原虫进行基于流式细胞术的分析。Antimicrob Agents Chemother 58(8): 4938-4940。
Chua, ACY, Ong, JJY, Malleret, B., Suwanarusk, R., Kosaisavee, V., Zeeman, AM, Cooper, CA, Tan, KSW, Zhang, R., Tan, BH, Abas, SN, Yip, A., Elliot, A., Joyner, CJ, Cho, JS, Breyer, K., Baran, S., Lange, A., Maher, SP, Nosten, F., Bodenreider, C., Yeung, BKS, Mazier , D., Galinski, MR, Deeuddre-Bosquet, N., Le Grand, R., Kocken, CHM, Renia, L., Kyle, DE, Diagana, TT, Snounou, G., Russell, B. 和 Bifani, P. (2019)。食蟹疟原虫红细胞阶段的稳健连续体外培养。国家通讯社10(1): 3635。
Collins, WE, Warren, M.和Galland, GG (1999)。猴子和蚊子中食蟹疟原虫Berok 菌株感染的研究。J Parasitol 85（2）：268-272。
Gunalan, K.、Rowley, EH 和 Miller, LH (2020)。培养间日疟原虫的方法。趋势寄生虫36(6): 512-519。
Habicht, J. 和 Brune, K. (1980)。碳菁染料染色跳动心脏细胞的肌浆网。Exp Cell Res 125(2): 514-518。
Han, JH, Cheng, Y., Muh, F., Ahmed, MA, Cho, JS, Nyunt, MH, Jeon, HY, Ha, KS, Na, S., Park, WS, Hong, SH, Shin, HJ , Russell, B. 和 Han, ET (2019)。通过针对间日疟原虫裂殖子表面蛋白 1 旁系同源物表皮生长因子样结构域的单克隆抗体抑制寄生虫入侵。科学报告9(1): 3906。
Jogdand, PS, Singh, SK, Christiansen, M., Dziegiel, MH, Singh, S. 和 Theisen, M. (2012)。基于 Mitotracker Red CMXRos 染色的活体无性血阶段疟疾寄生虫的流式细胞仪读数可靠地评估抗体依赖性细胞抑制。马拉尔 J 11：235。
Moll, K.、LMI、Perlmann, H.、Scherf, A. 和 Wahlgren, M.（2008 年）。疟疾研究方法。疟疾研究和参考试剂资源中心 (MR4) 美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，第 5 版。
Mitran, CJ, Mena, A., Gnidehou, S., Banman, S., Arango, E., Lima, BAS, Lugo, H., Ganesan, A., Salanti, A., Mbonye, AK, Ntumngia, F ., Barakat, K., Adams, JH, Kano, FS, Carvalho, LH, Maestre, AE, Good, MF 和 Yanow, SK (2019)。远距离同源物中隐性表位的抗体支持间日疟原虫PvDBP 和恶性疟原虫 VAR2CSA之间的异源免疫机制。mBio 10(5) : ):e02343-19。
Mohring, F., Rawlinson, TA, Draper, SJ 和 Moon, RW (2020)。人畜共患病疟疾寄生虫诺氏疟原虫的增殖和生长抑制活性测定。生物- p rotoc醇10（17）：e3743。
Muh, F., Kim, N., Nyunt, MH, Firdaus, ER, Han, JH, Hoque, MR, Lee, SK, Park, JH, Moon, RW, Lau, YL, Kaneko, O. 和 Han, ET (2020)。跨物种对疟原虫的血液阶段抗原抗体的反应诺氏疟原虫。PLoS Negl Trop Dis 14(6): e0008323。
Rawlinson, TA, Barber, NM, Mohring, F., Cho, JS, Kosaisavee, V., Gerard, SF, Alanine, DGW, Labbe, GM, Elias, SC, Silk, SE, Quinkert, D., Jin, J ., Marshall, JM, Payne, RO, Minassian, AM, Russell, B., Renia, L., Nosten, FH, Moon, RW, Higgins, MK 和 Draper, SJ (2019)。通过广泛中和疫苗诱导的人类抗体抑制间日疟原虫入侵的结构基础。Nat Microbiol 4(9)：1497-1507。
Russell, B., Suwanarusk, R., Borlon, C., Costa, FT, Chu, CS, Rijken, MJ, Sriprawat, K., Warter, L., Koh, EG, Malleret, B., Colin, Y. , Bertrand, O., Adams, JH, D'Alessandro, U., Snounou, G., Nosten, F. 和 Renia, L. (2011)。间日疟原虫对人网织红细胞的可靠离体侵袭试验。血118(13)：e74-81。
Shen, FH, Ong, JJY, Sun, YF, Lei, Y., Chu, RL, Kassegne, K., Fu, HT, Jin, C., Han, ET, Russell, B., Han, JH and Cheng, Y. (2021)。甲Ç himeric p lasmodium间日疟原虫米erozoite小号urface p rotein一个ntibody ř ecognizes和b锁ë rythrocytic P.食蟹猴b的erok米erozoites我Ñ体外。感染免疫89(2)：e00645-20 。
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