材料和试剂

中性红0.33％溶液（Sigma-Aldrich，目录号：N2889）
DMEM /高葡萄糖（Hyclone，目录号：SH30243.02）
2x MEM（Life Technologies，Gibco ，目录号：11935）
100x青霉素和链霉素（Hyclone，目录号：SV30010）
100x非必需氨基酸（Hyclone，目录号：SH30238.01）
1 H HEPES（Hyclone，目录号：SH30237.01）
200mM（100x）L-谷氨酰胺（Hyclone，目录号：SH30034.01）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10437或Hyclone，目录号：SH30070.02）
RAW 264.7细胞系（ATCC，目录号：TIB-71）
鼠诺如病毒（MNV-1; GV/MNV1/2002/USA）
海斑琼脂糖（Lonza，目录号：50100）
铝箔
1.0mm氧化锆/二氧化硅珠（BioSpec Products，目录号：11079110z）
小鼠（6-8周龄Balb/cJ）
DMEM-10（参见配方）
DMEM-5（见配方）
2x MEM培养基（500ml）（参见配方）
SeaPlaque琼脂糖（参见食谱）
1：1的熔融介质比率（见配方）

设备

175cm 2烧瓶（Corning，目录号：3292）
Model 35 Speed Rocker（Labnet，目录号：S2035）
组织培养箱（Sanyo，目录号：MCO-36M）
Magna Lyser Bead Beater（F.Hoffmann-La Roche，目录号：03358968001）
摄影安全红光

程序

中性红色病毒制备
1. 种子RAW 264.7细胞在175cm 2烧瓶中的总共30ml的DMEM-10培养基中以4×10 7个细胞的密度接种，并在组织培养物培养箱中37℃和5％CO 2过夜
2. 为了获得病毒母液，通过以0.05的感染复数（MOI）加入MNV并在37℃和5％CO 2下在组织培养箱中温育1小时，用MNV感染细胞， sub>。
3. 一小时后，将0.001％v/v的中性红从0.33％储备溶液中加入到细胞中
4. 用包括烧瓶过滤盖的铝箔包裹整个烧瓶
5. 在组织培养孵育器中在37℃和5％CO 2孵育48小时。
6. 48小时后，产生冷冻/融化裂解物。通过将用铝箔覆盖的整个烧瓶（包括细胞和培养基）移动至-80℃至少60分钟来冷冻细胞。然后在室温下或在37℃的组织培养箱中解冻烧瓶内容物，直到所有的冰融化。重复冻结/解冻第二次。这将是您的病毒储备。
  注意：在第二次冷冻/解冻循环后，应将病毒原液（在黑暗的房间中）分成单次使用的等分试样（例如，1ml），并储存在-80℃，因为病毒储液的光敏性降低重复冻融循环后。
7. 阻挡组织培养室中的所有光线，使其成为暗室，并配备用于摄影黑暗房间的安全红光。
8. 如先前详细描述的（2）和如下简述，进行空斑测定以确定病毒储液的病毒滴度。斑块测定前一天在DMEM-10 /孔中在6孔板中接种2×10 6个Raw 264.7细胞。
9. 在噬斑测定的当天，在DMEM-5中进行10倍连续稀释的病毒原种。请务必调整重复空斑测定的体积，即，，每次稀释的总体积为2.5ml。
10. 接下来，取出具有在前一天接种的细胞的六孔板，抽吸培养基并在黑暗中以0.5ml /孔每孔稀释一式两份感染细胞，在室温下用铝箔和岩石包裹1小时，高速摇臂每分钟〜18次振动。
  注：通过实验确定1小时孵育以确保MNV的有效进入和去除。但是，其他病毒所需的时间长度可能会有所不同。
11. 打开灯，将剩余的10倍病毒稀释液放在灯中至少10分钟。
12. 重复步骤1-j。但保持板暴露于光（，即，不要在铝箔包装板）。
13. 1小时后，通过加入2ml /孔的1：1比率的熔融培养基（1:1比例的SeaPlaque琼脂糖和2×MEM），在光照下通过或不使用铝箔，完成两组板的空斑测定。为了允许琼脂糖凝固，将板在室温下孵育10分钟。然后，将板移动到组织培养孵育器并在37℃，5％CO 2孵育48小时。
14. 在48小时后，在吸出溶液并计数噬菌斑之前用中性红色溶液覆盖（在1×PBS中的0.01％中性红）染色细胞1-3小时，如Gonzalez-Hernandez等人，/em>，2012）。
  注意：为了计算病毒效价并获得每毫升噬菌斑形成单位（PFU/ml），以单一稀释度在两个孔中加上噬菌斑数，并乘以稀释因子（即，如果2个孔被感染，则为1ml）与0.5ml）。图1显示了具有斑块的6孔板的实例。为了计算实施例中的病毒滴度：11 + 9 = 20个噬菌斑; 20 x 10 ² ml PFU/ml。通常在比较总病毒滴度（即在黑暗中获得）和光不敏感（即在光照下获得）感染中在病毒效价中观察到2至3个对数级的减少。根据病毒株，对数减少可能不同。
组织培养物感染与中性红色病毒
1. 种子2×10 6个原始264.7细胞在前一天的六孔板中
2. 第二天，阻止你的组织培养室里的所有光，使一个黑暗的房间，并配备用于摄影黑暗房间的安全红灯。
3. 用含有NR的MNV以0.001的MOI感染1小时注意：在与病毒孵育之前可以进行使用病毒进入或脱壳抑制剂的预处理。在与病毒孵育1小时后，用相同的抑制剂进行后处理（Perry，2010 ）。
4. 闪光灯在感染时间结束时在0至60分钟之间的不同长度的光注意：对于MNV，通常使用0至60分钟的时间，并且至少10分钟足以灭活任何剩余输入病毒（Perry，2010）。
5. 用2ml 1：1比率的熔融培养基（1:1比率的SeaPlaque琼脂糖和2×MEM）覆盖，如同对于噬菌斑测定和如Gonzalez-Hernandez等人 >，2012; Perry et al。，2012）。
6. 在组织培养箱中在37℃和5％CO 2下孵育48-72小时。
7. 如上所述和先前所述，通过将单孔稀释中的噬斑数目乘以稀释倍数来计数噬菌斑（Gonzalez-Hernandez等人，2012; Perry等人。， 2012）。
鼠标感染与中性红色病毒
1. 通过将病毒直接吸入口中或通过用安全红灯在黑暗的房间中用NR-MNV口服管饲来口服小鼠。
  注意：我们用NR-MNV在10天
  pfu下口感六到八周龄的Balb/c小鼠。根据实验，感染的长度将不同。我们通常感染小鼠12-72小时。在实验终点（即感染后12小时），在暗室中用安全的红光处死小鼠，并收获胃肠道的不同区域，每个长度为1cm。将每个组织片放在含有0.4-0.5g二氧化硅珠和1ml DMEM-10的单独的2ml离心螺旋盖管中。
2. 按照Gongzalez-Hernandez等人，2012年所述，使用珠磨机在6,000rpm下匀浆组织在黑暗中60分钟。
3. 在黑暗中和在如上所述的光照下进行平行空斑测定之前，冷冻（在-80℃）和融化组织（在37℃）一次。
4. 48小时后计数斑块。
  注意：已知MNV-1在〜12小时内经历第一轮复制。因此，感染后3小时收集的样品应仅显示输入病毒（即含有NR和对光敏感的病毒）。

图1.在MNV-1感染48小时后噬菌斑测定板的代表性图像。在用中性红色溶液覆盖染色1-3小时后观察噬斑。该图显示了三个10倍病毒稀释液的两个孔：10个-1，10个，10个，10个和10个稀释。箭头表示噬菌斑的形成，样品的病毒滴度如下所示。答案：11 + 9 = 20 x 10 ² = 2 x 10 ³ PFU/ml。

食谱

DMEM-10
DMEM /高葡萄糖（1L）
10％低内毒素FBS
1％HEPES
1％青霉素和链霉素 1％非必需氨基酸
1％L-谷氨酰胺
DMEM-5
DMEM /高葡萄糖（1L）
5％低内毒素FBS 1％HEPES
1％青霉素和链霉素 1％非必需氨基酸
1％L-谷氨酰胺
2×MEM培养基（500ml） 10％低内毒素FBS
1％HEPES
1％青霉素和链霉素 2％L-谷氨酰胺平衡至37°C
SeaPlaque琼脂糖
1.5克SeaPlaque琼脂糖 50ml水
高压灭菌溶液
平衡至42°C
1：1的熔融介质比率在加入细胞
之前，将1：1的50ml 2×MEM和50ml的SeaPlaque琼脂糖混合

致谢

这种用于鼠诺如病毒的中性红测定方案由于先前由Brandenburg等人（2007）和Kuss等人（2008）描述的脊髓灰质炎病毒的原始工作而改编，）。此外，该方案改编自Perry等人（2010）所做的工作; Perry等人（2012）和Gonzalez-Hernandez等人（2012）。我们的工作由密歇根大学和NIH授权AI080611至C.E.W.的启动资金资助。 M.B.G.-H.由密歇根大学实验免疫学培训授权（NIH T32 A1007413-16），微生物病原学培养授权分子机制（NIH T32 A1007528）和Herman和Dorothy Miller基金创新免疫学研究资助。 J.W.P.由密歇根大学人类遗传学培训授予（授予NIH T32 GM 07544）和微生物发病机理分子机制训练授权（NIH T32 AI 007528）资助。

参考文献

Brandenburg，B.，L.Y.Lee，M.Lakadamyali，M.J.Rust，X.Bhuang和J.M.Hogle。 2007. 成像
P 条目。 PLoS Biol 5（7）：e183
Gonzalez-Hernandez，M.B.，J.Bragagi Cunha和C.E.Wobus。 2012. 鼠诺如病毒的噬斑测定法。 J Vis Exp （66）：e4297。
Kuss，S.K.，C.A.Etheredge，和J.K.Pfeiffer。 2008. 多台主机障碍限制了脊髓灰质炎病毒 tTraffic in mice 。 PLoS Pathog 4（6）：e1000082。
Perry，J.W.，M.Ahmed，K.-O. Chang，N.J.Donato，H.D. Showalter和C.E.Wobus。 2012. 小分子去泛素酶抑制剂的抗病毒活性通过诱导解折叠蛋白反应发生。 PLoS Pathog 8（7）：e1002783。

Perry，J.W。，和C.E.Wobus。 2010. 将鼠诺罗病毒1内吞到鼠巨噬细胞中依赖于dynamin II和胆固醇。 J Virol 84（12）：6163-61 76。