材料和试剂

1.移液管头：1 ，250微升，200微升，10微升（蓝宝石，格雷纳生物一个，目录号小号：750-257，737-257，771-257 ，分别）
2. 1.5 ml l Eppendorf 管（Greiner B io-One，目录号：616261）
3. 50米升˚F爱尔康管（细胞星，格雷纳乙IO-一，目录号：227261）
4. 15米升˚F爱尔康管（细胞星，格雷纳乙IO-一，目录号：188271）
5.膜˚F ILTER，0.22微米孔径（Millipore公司，MF-Millipore公司TM ，目录号：GSWP04700）
6.微孔板用胶膜，聚酯薄膜非无菌（VWR，目录号：60941-062）
7. 96 孔 U 型底透明微孔板（Greiner B io-One，目录号：650101）
8. 96 孔 F 底透明微孔板（Greiner B io-One，目录号：655101）
9.试剂库（Pierce，ThermoFisher Scientific，目录号：15075）
10.正常人血清库 (NHS)，在 -80°C 下分装储存（内部由健康志愿者新鲜采集的血液制备，n = 3）
11.保存在 -80°C 的正常雄性小鼠血清 (NMS)（内部由新鲜采集的血液制备，n = 22）。在C57BL / 6雌性小鼠补体裂解活性被显著相比减小雄性（在我们手中〜40 - 50 ％），由于较高的生产雄激素和雌激素荷尔蒙，终端途径蛋白C5和C6（较低水平丘吉尔等人。 , 1967; Kotimaa等人, 2016 ) 。
12.正常人 C5 耗尽血清（C5D；此处使用 C5 作为示例；此方法可用于从血清中耗尽任何其他补体成分），通过 NHS 生成（内部由健康志愿者新鲜采集的血液制备）中，n = 3）通过一个免疫耗竭柱包括一个内部的抗C5mAb IM米obilised上琼脂糖（GE医疗集团，1 ml的的HiTrap NHS活化的HP，目录号：17-0716-01），在存储在等分试样- 80°C 。
13. HEPES（Fisher Chemicals，Fisher Scientific，目录号：BP310-500）
14.氯化镁（Acros Organics，Fisher Scienti fic，目录号：2232/0010）
15.氯化钙（Fisher Chemicals，Fisher Scientific ，目录号：C/1400/53）
16.氯化钠（Alfa Asear，Fisher Scientific ，目录号：12314）
17.氢氧化钠（Macron Fine Chemicals，Fisher Science，目录号：7066-33）
18. Alsever 溶液中的羊血（TCS Biosciences，目录号：SB069）作为羊红细胞（ShE）的来源；随着时间的推移，Shee 将在 Nalgene 瓶底部沉淀，并收集沉淀的SheE 进行分析
19.兔抗-她抗血清（西门子Amboceptor，Cruinn诊断，目录号：ORLC25）
20.小鼠抗兔IgG（H + L）交叉吸附第二抗体（赛默飞小号系统求解，Invitrogen公司，目录号：31213 ）
21. Alsever 溶液（Merk，Sigma - Aldrich，目录号：A3551-1L）
22.纯化的人 C5，储存在 -80°C，C5D 血清制剂的副产品（也可从 Hycult Biotech 获得，目录号：HC2141）
23. HBS 缓冲液（见配方）

设备

移液器仪（Eppendorf，型号：的Eppendorf研究®加，目录号小号：3123000918，3125000060）
孵化器（Memmert 0135）
摇动水浴（VWR，型号：462-0494）
离心机（ThermoFisher Scientific、Heraeus megafuge 40R、TX-1000 转子）
酶标仪（Tecan，Infinite F50）
分析天平（A&D Company Limited，型号：FZ-300i-EC）
搅拌器（Stuart，Bio-Cote）
pH计（Jenway Scientific Laboratories Supplies SLS，型号：RS232）

软件

GraphPad P rism ( Graphpad Holdings, LLC )

程序

注意：所有程序均在标准实验室设置中进行。使用的所有化学品均为分析级。

血清制备
人类和动物血清由新鲜采集的血液在内部制备。对于人，血液收集到玻璃瓶中，在室温（RT）凝结为1个小时，然后在冰上放置2小时凝块回缩之前离心（2 ，000 ×克为15分钟，在4 °C ) 和血清的收获。对于小鼠，通过尾部放血将血液收集到 Eppendorf 管中，收获后立即置于冰上并在血清收获前在冰上凝固 2 小时。将血清过滤（通过0.22 µm过滤器）并在- 80 °C 下以等分试样（100 或500 µl ）储存。

HBS 缓冲液的制备
HEPES缓冲盐水（HBS; 0.01M的HEPES，0.15 M氯化钠，135 μ中号的CaCl 2 ，1毫摩尔MgCl 2 ，最终pH 7.4）中制备如先前所描述（Zelek等人，201。8 ）。

用于经典通路分析 (SheA) 的抗体敏化绵羊红细胞的制备
移取400 μl的沉降 She pellet （参见材料# 1 8 ），并轻轻混合加入20 ml HBS。
通过离心（1,500 × g ，10 分钟，4°C）在20 ml HBS 中洗涤 She 3 次，然后轻轻混合重悬在20 ml新鲜 HBS 中。上清液在第一次洗涤时呈红色，在最后一次洗涤时应该是透明的，确认细胞可以使用。
重悬在最终沉淀10 ml的含Amboceptor HBS（通常为1：2 ，000稀释，尽管工作稀释度应滴定每批新以最佳sensiti小号Ë而不引起凝集），在37℃; 加小号Ø lution慢慢地混合。将混合物在 37°C 下孵育 30 分钟，在水浴中摇晃。
洗致敏她（牛油果）如上述重悬的在最终沉淀20 ml的HBS。乳木果可以被存储在4 ℃下进行长达一周或在圆顶建筑在一冷室（0 ℃，换算）为长达两周用冰取代是必要的。

计算 SheA 的浓度
将 SheEA 悬浮液分装到 96 孔 U 型底板的孔中（50 μl /孔），并添加 100 μl/孔的dd H 2 O（一式三份）。
离心板（1,500 × g ，3 分钟，4°C）。
转移100微升的上清液到一个F-底板。上清液含有从 SheEA 释放的dd H 2 O和血红蛋白（红色）。甲LL细胞应被裂解; 肉眼看不到鬼细胞。
测量该上清液的吸光度小号在405处使用的读板器（裂解的细胞释放出的血红蛋白，其产生可测量的红色彩色读出）; OD1的吸光度等于 8.5 × 10 7 /ml 原始浓度。

测试 SheEA 对人血清裂解的敏感性
在 96 孔 U 型底板中，在 HBS（50 μl/孔）中制备 NHS 系列稀释液（一式三份；10 - 0 % ），并添加 50 μl 2% SheEA（按上述方法制备，参见 C 部分）和将 50 μl HBS（每孔总体积 = 150 μl）放入每孔中。
准备控制（一式三份）：
0% 裂解：50 μl SheA + 100 μl HBS
100% 裂解：50 μl SheA + 100 μl ddH 2 O
密封板并在 37°C 下孵育 30 分钟。
离心板（1,500 × g ，3 分钟，4°C）。
转移100微升上清液到一个F-底板。
测量该上清液的吸光度小号在405nm使用波长的板读数器。最佳增感的乳木果将完全裂解（100％与对照组相比）通过NHS在10％以上，在这些条件下。

SheEA 对小鼠经典al 通路测定 (ShEA-m) 的进一步致敏
在 HBS 中取 5毫升 2% SheA。
沉淀细胞（1,500 × g离心10 分钟，4°C）
加入预先温热（在37 ℃下在水浴中）的小鼠抗兔IgG在一个25终浓度微克/毫升，5毫升HBS的和悬浮细胞。
在 37°C 的振荡水浴中孵育 30 分钟。
洗涤细胞 3 次（在 20 ml HBS 中离心；1,500 × g ，4°C 10 分钟）以去除多余的抗体，重悬于 5 ml HBS 中；乳木果-M可以存储在冰上进行长达两周。
使用从 100% 到 0% 的 NMS 稀释度（100% 相当于测定中的最终稀释度为 33%），测试 ShEA-m 对小鼠血清裂解的敏感性。我N A 96孔U底板中，制备系列稀释液（一式三份）％100和0之间NMS（50微升/孔）在HBS和加入50微升2％乳木果-m和50 HBS的微升（每总体积孔 = 150 µl)放入每个孔中。
准备控制（一式三份）：
一种。0% 裂解：50 μl SheA-m + 100 μl HBS
湾 100% 裂解：50 μl SheA-m + 100 μl ddH 2 O
密封板并在 37°C 下孵育 30 分钟。
离心板（1,500 × g ，3 分钟，4°C）。
转移100微升上清液到一个F-底板。
测量该上清液的吸光度小号在405nm使用波长的板读数器。在这些条件下，最佳敏化的 SheA-m 将被 NMS 以 100% 完全裂解（与对照相比为 100%）。

检测方法——改良的小鼠 CP CH50 检测
在一个U型底板，准备一个NMS的连续稀释系列（一式三份）（100 - 0％; 50微升/孔）。加入50 μl 2% SheEA-m，然后加入 50 μl HBS（每孔总体积，150 μl ；最终血清浓度，33-0%）。
准备控制（一式三份）：
0% 裂解：50 μl SheA-m + 100 μl HBS
100% 裂解：50 μl SheA-m + 100 μl ddH 2 O
密封板并在 37°C 下孵育 30 分钟。
将板在4°C 下以1,500 × g离心3 分钟。
使用12通道multipipette，转移100微升上清液从每个孔中以一个F-底板，注意不要扰乱沉淀未裂解牛油果米。
在 10 分钟内使用酶标仪测量405 nm 处的吸光度。
计算溶血；有关计算示例，请参见图 2 。
请参阅步骤-通过-步骤测定的工作流程在图小号1和2 ˚F igures 3和4的下方。

图2.小鼠CP CH50测定utili实施例数据小号荷兰国际集团双致敏乳木果米。A.测定板设置和计算；红色表示信号强度。B.针对 NMS 稀释系列 (100 - 0%)绘制的 CH50 。虚线显示了产生 50% SheEA 裂解的血清剂量。NMS：正常小鼠雄性血清。

图3 。改良小鼠 CP CH50 检测的工作流程

图4 。改进的小鼠 CP CH50 检测的逐步工作流程图示

测定方法 - 小鼠成分特异性CH50 溶血测定的滴定
制备系列稀释小号eries（50 ％; 50微升/孔）NHS，NMS，C5D，和C5D的补充有25个％NMS一个U型底的板（一式三份）。
在 HBS 中加入 2% SheEA 悬浮液（50 μl/孔）。
加入50微升/孔HBS到NHS，C5D ，以及NMS（每孔总体积：150微升;血清浓度：1.7 - 0％）。
准备控制（一式三份）：
0% 裂解：50 μl SheA + 100 μl HBS
100% 裂解：50 μl SheA + 100 μl dd H 2 O
密封板并在 37°C 下孵育 30 分钟。
停止所述通过在停转的板反应1500 ×g下进行3分钟，在4℃。
转移100每行的微升上清液的F-底板，而不会干扰沉淀乳木果。
测量的在吸光度405nm下在10分钟内使用板读数器; 小号EE图5 ˚F或示例计算。

图5 。CP CH50测定utili的示例数据小号荷兰国际集团人类耗竭血清和小鼠血清（C5作为例子）。A.测定板设置和计算；红色表示信号强度。B.针对 NMS ( ▼ ; 5 - 0%)、人类 C5D ( ♦ )、补充有 NMS (25%; ▲ ) 和 NHS (●) 的C5D绘制的 CH50 。测定对照包括在同一测定中。虚线显示了产生 50% SheEA 裂解的血清剂量。NMS ，正常雄性小鼠血清；NHS ，正常人血清；C5D ，人C5耗尽血清。

检测方法 – 添加小鼠特定成分的 CP CH50 溶血检测
制备系列稀释系列（10 - 0 ％;50μL/孔）NHS的，C5D + NMS（25％v醇：v醇），和C5D +人（75微克/毫升）在一个U形底平板（一式三份） .
在 HBS 中加入 2% SheEA 悬浮液（50 μl/孔）。
添加 50 μl/孔 HBS（每孔总体积，150 μl ；血清浓度，3.33-0%）
准备控制（一式三份）：
0% 裂解：50 μl SheA + 100 μl HBS
100% 裂解：50 μl SheA + 100 μl ddH 2 O
密封板并在 37°C 下孵育 30 分钟。
要停止的反应，自旋向下板在1500 ×g下进行3分钟，在4℃。
转移100的每一行的微升上清液一个Ñ F-底板，而不会干扰沉淀乳木果。
使用酶标仪在10 分钟内测量405 nm 处的吸光度；有关示例计算，请参见图5 。

数据分析

1.确认对照分别显示 0（背景）和 100%（最大）裂解。
2.计算％裂解试验样品如下在小号：

% 裂解 = (样品 A 405 – 背景 A 405 )/(最大 A 405 –背景 A 405 ) × 100%

请参阅图6为在实施例的计算。

图6 。使用人去除血清和小鼠血清的 CP CH50 测定的示例数据。A.检测板设置和计算；红色表示信号强度。B.具有最高血清浓度 (10%) 的样品的溶血，包括检测对照。C.计算 CH50。该图显示了测试样品的 Y 轴裂解百分比与 X 轴稀释血清百分比的对数对数图。Y 轴的虚线截取溶血曲线上的这一点，从该点到 X 轴的截距允许读取 50% 溶血时的血清体积。虚线显示了产生 50% SheEA 裂解的血清剂量。D.从 GraphPad (EC50) 导出的数据以及获得 CH50 值的计算；标准 NHS 样本测量被指定为 100 HU 的 CH50。通过应用公式 NHS EC50/样品 EC50 × 100计算样品的 CH50 。

3.使用 GraphPad Prism计算一式三份测试的SEM ± SD % 裂解。
4.绘制稀释曲线并计算每个测试样品的C H 50 （产生 50% 溶血的血清量）（见图6 D ）。
与使用 GraphPad Prism的适当对照相比，确定样本之间差异的统计显着性（例如，使用学生t检验（参数）或单向方差分析/Tukey 检验）。

笔记

TCS 产品是在 Alsever 溶液中稀释的羊血。为了延长红细胞的生存能力，在接收后，将细胞通过离心沉淀并重新悬浮在新鲜的 Alsever 溶液中，以去除其他可能导致储存时丧失生存能力的血液制品。洗涤后的红细胞可以在 4°C 的 Alsever 溶液（5% vol:vol）中保存长达 3 个月。
Shea 和 Shea-m 可以在冰上的 Alsever 溶液中储存长达 2 周，在 4 °C 的冰箱中至少可储存一周，而不会失去活性。

食谱

HBS 缓冲液
一种。将盐溶解在约980毫升的 ddH 2 O 中。
湾用5 M NaOH（通过将20 g NaOH溶解在 100 ml ddH 2 O 中制备）将溶液的 pH 值调节至7.4 。
C。测量溶液的体积，加入更多的DDH 2 O，至多1大号。
d. 重新测量 pH (7.4)。
e. 通过 0.2 µm 过滤器过滤。

致谢

我要感谢 Paul Morgan 教授在准备这份手稿时提出的建设性批评和他一直以来的支持。感谢卡迪夫大学补体生物学小组的成员为研究献血。WMZ 得到威尔士政府健康与护理研究威尔士奖学金的支持。该协议是由我们最近的研究启发发表在前沿免疫学（Zelek和摩根，2020年）。

利益争夺

我没有利益冲突或竞争利益。

伦理

根据英国内政部规定收集小鼠血清。根据医学/牙科学院研究伦理委员会的规定收集人血清；获得知情同意。

参考

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