材料和试剂

24 孔细胞培养板（Corning，Costar ® ，目录号：3524）
细胞培养瓶，T25（Corning，Costar ® ，目录号：430639）
圆形盖玻片，9 毫米（Biosharp，目录号：BS-09-RC），将盖玻片放入含 75% 乙醇的离心立方体中
粘附显微镜载玻片（CITOTEST，目录号：80312-3161）
封口膜（Bemis，目录号：4157）
对于细胞制备：
Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），1g/L D-葡萄糖，含有 L-谷氨酰胺（Gibco，目录号：C11885500BT）。2-8号店℃ 1年
胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10099141）。分装并储存在 -20°C
青霉素-链霉素（10,000U/ml）（Gibco，目录号：15140122）。-20~-5°C 保存 1 年
磷酸盐缓冲盐水（PBS），无菌过滤（Servicebio，目录号：G4202）。在 2-30°C 下储存 18 个月
0.25% 胰蛋白酶-EDTA，（Gibco，目录号：25200-072）。-20~-5°C 保存 24 个月
磷酸盐缓冲盐水（PBS）粉末（Absin，目录号：abs9266）。在室温 (RT) 下储存 2 年
4% 多聚甲醛（PFA）（Solarbio，目录号：P1110）。分装并在-20°C下保存1年，避免反复冻融。在 4°C 下储存长达一个月
Triton X-100（Solarbio，目录号：T8022）。在 RT 存放 2 年
正常山羊血清（Solarbio，SL038）。-20°C 保存 5 年
一抗：
MRPL12抗体（Novas，目录号：3B12-1A3）。分装并储存在 -20°C。避免冻融循环
Nrf2 抗体（Abcam，目录号：ab62352）。分装并储存在 -20°C。避免冻融循环
二抗：
山羊抗小鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附的二抗，Alexa Fluor Plus 488（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A32723）。4°C避光保存
驴抗兔 IgG（H+L）高度交叉吸附的二抗，Alexa Fluor Plus 594（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A32754）。4°C避光保存
Hoechst 33342（生命技术，目录号：HH-H3570）。分装并储存在 -20°C 的黑暗中
安装介质，抗褪色（Solarbio，目录号：S2100）。4°C 保存 1 年
细胞培养基（见配方）
PBS（见食谱）
透化溶液（见配方）
阻塞解决方案（见食谱）

设备

镊子
注意：在进行细胞制备时，镊子应该是无菌的。后续步骤不需要无菌条件。
纸巾
（可选）湿室
（可选）冰箱（海尔，型号：BCD-328WDPT）
恒温培养箱（松下，型号：MIR-262-PC）
尼康倒置荧光显微镜（Nikon，型号：Ti-S）
超净工作台（Airtech，型号：SW-CJ-1FD）
直接加热的 CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：240i）

软件

图像J
棱镜图形板

程序

细胞制备
将盖玻片放入 24 孔板中
使用无菌镊子从含 75% 乙醇的离心立方体中取出盖玻片，并将它们放在无菌板上。将它们与其他所需材料一起暴露在紫外线 (UV) 下约 30 分钟，包括 PBS、胰蛋白酶、培养基（含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基，参见配方 1）和 24 孔细胞培养盘子。
确保盖玻片的两侧都是干燥的，以避免细胞被剩余的乙醇杀死。
在每个孔上滴大约 5 μl 细胞培养基。用无菌镊子将干燥的盖玻片放在液滴上。轻轻按下盖玻片并去除多余的液体，以确保它们牢固地粘在井底。
细胞接种和培养
从含有细胞的细胞培养瓶 (T25) 中取出培养基并用 2 ml PBS 洗涤。取出 PBS，加入 500 μl 0.05% 胰蛋白酶 2 分钟，使细胞从细胞培养瓶壁上分离。
根据实验要求接种许多细胞，例如，用 siRNA 或过表达质粒转染（见注 1）。横向和纵向摇动板，以防止细胞局部生长过于密集。然后让细胞在 5% CO 2的培养箱中在 37°C 下生长。请记住在执行共定位时添加控制组（见注 8）。
按照实验要求处理细胞。瞄准导致 70-80% 汇合的细胞密度，以避免细胞重叠。

免疫荧光染色
当细胞生长到 70-80% 汇合时，取出培养基并用 500 μl PBS 冲洗一次 5 分钟。以下步骤不需要在无菌条件下进行。
提前解冻 4% PFA。在室温下向每个孔中加入 300 μl 4% PFA 20 分钟。
去除固定剂并用 PBS 冲洗细胞 3 次，每次 5 分钟（见注 4）。
取出 PBS，在室温下向每个孔中加入 300 μl 透化溶液 5 分钟。
取出透化溶液，用 PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
用 300 μl 封闭液在 37°C 封闭 1 小时。
取出溶液，用 PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
一抗孵育：
用 PBS 稀释抗体 A（MRPL12，1:200）和抗体 B（Nrf2，1:300）（见注释 5、6、7）。
在粘附显微镜载玻片上加入几滴 PBS，然后在每张载玻片上放置一块封口膜。排出气泡以确保薄膜紧紧贴在载玻片上。
夹出盖玻片用镊子从盘子上取下，然后触摸纸巾的边缘以去除剩余的溶液。
将盖玻片放在封口膜上，细胞朝上，加入约 50 μl 稀释的抗体以完全覆盖。
为避免因挥发而损失抗体，请将载玻片在湿室中于 4°C 孵育过夜。
可选步骤：过夜孵育后，将载玻片在室温下放置约 30 分钟。
提起盖玻片并将它们放回井中，面向细胞的表面朝上。用 PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
二抗孵育：
用 PBS稀释二抗 Alexa Fluor ® -488 (1:1,000) 和 Alexa Fluor ® -594 (1:1,000)（见注释 5、6）。
每孔加入 300 μl 二抗溶液。
将样品在 37°C 下在黑暗中孵育 1 小时。
二次抗体孵育后，保护细胞免受光照。取出二抗，用 PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
要可视化细胞核，请将 PBS 稀释的 Hoechst 33342 (1:1,000) 添加到盖玻片中 10 分钟在 RT。
去除溶液。用 PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。

安装、存储和成像
用样品信息标记显微镜载玻片。为载玻片上的每个盖玻片滴大约 5 μl 防褪色封固剂。然后，将盖玻片放在安装介质上，含有细胞的表面朝下，确保没有气泡。如果需要，去除多余的液体。
样品可以在 4°C 下在黑暗中储存大约 1 周或在 -20°C 下储存 2 个月。不建议长期存放。
使用尼康倒置荧光显微镜从每个样品的五个不同视野中捕获图像；随机选择区域（图 1）。Hoechst 33258、Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 的激发波长分别为 345 nm、499 nm 和 591 nm。分别记录各个通道的荧光。

图 1. Nrf2 过表达或敲低的 HK-2 细胞中的免疫荧光染色。HK-2 细胞用甲醇固定。Nrf2（红色）、MRPL12（绿色）和细胞核（蓝色）按照协议中的描述进行染色。使用尼康倒置荧光显微镜捕获和合并图像。比例尺为 50 μm。图 1 经顾等人许可转载。(2021)。

数据分析

在我们发表的研究中，我们定量分析了比较组中 HK2 细胞的荧光强度。
荧光强度测定
使用 ImageJ 估计染色的 HK2 细胞中的荧光。要量化荧光，首先在 ImageJ 中打开图像，然后选择图像 > 类型 > 16 位将图像转换为灰度。然后，转到“分析”>“设置测量”并选择“面积”、“平均灰度值 (Mean)”和“积分强度 (IntDen)”作为测量参数。接下来，选择分析 > 工具 > ROI 管理器。随机选择一个染色的单元格，然后添加 [t] > 重命名。然后通过上述方法标记另外两个细胞和三个荧光背景点。选择所有项目，然后单击“测量”（图 2）。

图 2. 使用 ImageJ 确定荧光强度。选择测量对象并使用 ROI Manager 进行计算。随机圈一个单元格（椭圆突出显示），然后添加 [t]（突出显示矩形）> 重命名（突出显示矩形）。三个细胞和三个荧光背景点被完全标记。选择所有项目，然后选择“测量”（突出显示矩形）。

统计分析
使用以下公式确定每个单元格的修正积分强度值：修正的 IntDen（单元格）= IntDen（单元格）-面积（单元格）×平均值（背景）。
将 HK-2 细胞的校正综合强度值绘制成柱状图，并使用 Prism GraphPad评估学生t检验的统计显着性（图 3）。

图 3. Nrf2 和 MRPL12 在 Nrf2 过表达或敲低的 HK-2 细胞中表达的荧光强度的统计分析。数据表示为平均值 ± SD (n = 3)。* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001。图 3 经顾等人许可转载。(2021)。

笔记

在 6 孔板中转染 siRNA 或过表达质粒并将转染的细胞传到 24 孔板也是可行的。
在整个过程中保护盖玻片免于变干。例如，快速更改解决方案并确保解决方案完美覆盖细胞。
为确保在整个实验过程中细胞不会被冲洗掉，请将移液器尖端放在孔的边缘以吸取液体，然后将新溶液轻轻添加到孔的侧壁。
暂停点：冲洗固定液后可能会暂停。固定样品可在 4°C 下保存约 1 周如果需要的话。尽管如此，我们建议立即继续进行下一个程序。不建议长期存放。
两种抗体必须具有不同的物种来源，并且二抗必须具有不同的激发光波长。
抗体的浓度可以基于抗体说明或来自作为初步实验进行的浓度梯度测试的数据来确定，以寻找最佳剂量。
为了减少抗体的使用，建议将盖玻片放在封口膜上以孵育抗体。您可以直接将稀释的抗体添加到孔中，而无需将盖玻片放在石蜡膜上。
为了控制非特异性染色，应对每个新抗体进行“无一抗”和“无二抗”对照。此外，每个共定位实验至少应进行“无一抗对照”。

食谱

细胞培养基
低葡萄糖 (1g/L) DMEM 培养基含有：
10% 胎牛血清
1%青霉素-链霉素
PBS
将 PBS 粉末溶解在双蒸水中，调节 pH 值至 7.2-7.4。
透化液
PBS 含有：
0.5% 海卫 X-100
注意：它应该是新鲜制备的。
阻塞解决方案
PBS 含有：
1% 正常山羊血清
注意：它应该是新鲜制备的。

致谢

该协议改编自之前发表的论文（Gu et al. , 2021）。这项工作得到了国家自然科学基金项目的支持（资助号：81770729、91749111、82070756）；山东省泰山学者项目（资助编号tsqn20161073）。

利益争夺

作者声明在这项工作中没有财务或非财务利益冲突。

参考

Dinkova-Kostova, AT 和 Abramov, AY (2015)。Nrf2 在线粒体功能中的新兴作用。Free Radic Biol Med 88(Pt B)：179-188。
Gu, X.、Liu, Y.、Wang, N.、Zhen, J.、Zhang, B.、Hou, S.、Cui, Z.、Wan, Q. 和 Feng, H. (2021)。Nrf2 调控的 MRPL12 转录导致糖尿病肾病线粒体功能障碍。自由基生物医学164：329-340。
Hayes, JD 和 Dinkova-Kostova, AT (2014)。Nrf2 调节网络提供氧化还原和中间代谢之间的接口。Trends Biochem Sci 39(4): 199-218。
Kühl, I., Miranda, M., Posse, V., Milenkovic, D., Mourier, A., Siira, SJ, Bonekamp, NA, Neumann, U., Filipovska, A., Polosa, PL, Gustafsson, CM和拉尔森，NG（2016 年）。POLRMT 调节哺乳动物 mtDNA 的复制引物形成和基因表达之间的转换。Sci Adv 2(8)：e1600963。
Marty, L. 和 Fort, P. (1996)。编码 MRPL12 的延迟早期反应核基因，MRPL12 是细菌翻译调节因子 L7/L12 蛋白的线粒体同源物。J Biol Chem 271(19):11468-76。
Ma, Y.、Zhu, S.、Lv, T.、Gu, X.、Feng, H.、Zhen, J.、Xin, W. 和 Wan, Q. (2020)。SQSTM1/p62 控制 mtDNA 表达并通过 MRPL12 参与线粒体能量适应。iScience 23(8): 101428。
Nouws, J., Goswami, AV, Bestwick, M., McCann, BJ, Surovtseva, YV 和 Shadel, GS (2016)。线粒体核糖体蛋白 L12 是 POLRMT 稳定性所必需的，它以两种形式存在，由导入过程中的替代蛋白水解产生。J Biol Chem 291(2): 989-997。
苏罗夫采娃，。YV, Shutt, TE, Cotney, J., Cimen, H., Chen, SY, Koc, EC 和 Shadel, GS (2011)。线粒体核糖体蛋白 L12 选择性地与人线粒体 RNA 聚合酶结合以激活转录。Proc Natl Acad Sci USA 108(44): 17921-17926。

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