材料和试剂

细胞过滤器（100 µm，Greiner Bio-One）
50毫升离心管（猎鹰）
强化离心机15毫升玻璃管（Kimble Chase，目录号：45500）
玻璃巴斯德吸管（Dutscher，目录号：065421）
1.5 ml 和 2 ml 微管（Eppendorf）
移液器吸头（Star Lab）
96 孔板（黑色，μclear 平底；Greiner，目录号：655096）
吖啶橙10-壬基溴（Sigma，目录号：A7847）
腺苷5'-二磷酸单钾盐二水合物（Sigma，目录号：A5285）
二辛可宁酸测定（Pierce，Invitrogen，目录号：23225）
牛血清白蛋白（不含脂肪酸；Sigma，目录号：A7030）
来自牛心脏的心磷脂钠盐（氯仿溶液；Avanti Polar Lipids，目录号：840012C）
氯仿（Sigma，目录号：288306）
洋地黄皂苷（Sigma，目录号：D5628）
二甲基亚砜（Sigma，目录号：D8418）
乙烯-双（氧亚乙基腈）四乙酸（EGTA）（Sigma，目录号：03777）
乙二胺四乙酸四钠盐二水合物（EDTA）（Sigma，目录号：E6511）
甲醛溶液36％（Sigma，目录号：47608）
谷氨酸（Sigma，目录号：G1501）
HEPES（Sigma，目录号：H3375）
氯化镁（MgCl 2 1 M 溶液；Sigma，目录号：63069）
苹果酸盐（Sigma，目录号：M6413）
甘露醇（Sigma，目录号：M8429）
甲醇（Sigma，目录号：34860）
MitoTracker TM Red CMXRos（Invitrogen，目录号：M7512）
PBS（Sigma，目录号：P4417）
L-α-磷脂酰胆碱（95％）（鸡蛋，鸡肉，氯仿溶液）（Sigma，目录号：131601C）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ；Sigma，目录号：P5655）
丙酮酸盐（Sigma，目录号：P2256）
蔗糖（Sigma，目录号：S0389）
Texas Red TM 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine，三乙基铵盐（Thermofischer，目录号：T1395MP）
TopFluor ®心磷脂（Avanti Polar Lipids，目录号：810286）
Tris-HCl（Sigma，目录号：T5941）
DPBS中的胰蛋白酶EDTA（10×）0.5％/ 0.2％（PAA Laboratories，目录号：L11-003）
小鼠抗 COXIV 抗体（Abcam，目录号：ab14744）
兔抗β-微管蛋白抗体（Cell Signaling，目录号：2128）
兔抗钙联蛋白抗体（Sigma，目录号：C4731）
小鼠抗 eIF2α 抗体（Cell Signaling，目录号：2103）
兔抗胰岛素受体 β 抗体（细胞信号转导，目录号：3025）
兔抗 MFF 抗体（Abcam，目录号：ab129075）
兔抗 TBP 抗体（Cell Signaling，目录号：8515）
兔抗 VDAC 抗体（定制，C. Lemaire 博士赠送的礼物，Inserm U1180）
线粒体匀浆缓冲液（MHB）（见食谱）
线粒体分离缓冲液（MIB）（见食谱）
ADP 解决方案（见食谱）
融合缓冲液（见配方）
10× BSA 溶液（见配方）
洋地黄皂苷溶液（见食谱）
线粒体制备缓冲液（MPB）（见配方）
低渗线粒体制备缓冲液（HMPB）（见食谱）
Mitotracker Red 1 mM 原液（见配方）
甲醛 2%（见配方）
壬基吖啶橙 35 mM 原液（见配方）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5810R 带转子 FA-45-6-30）
Dounce，2 ml（Kimble，A型，目录号：885300-0002）
Hamilton 注射器 500 µl（ThermoFischer，目录号：10570042）
氮气或氩气瓶，或带压力调节器的医用气体装置
非 CO 2培养箱（Memmert，目录号：D06057，100 型）
MACSMIX 管旋转器（Miltenyi，目录号：130-090-753）
荧光分光计（TECAN，型号：Infinite M200）
超声波浴（Branson，目录号：3510）
Zeiss LSM800 共聚焦（Zeiss，型号：LSM800）
水浴

软件

Prism 8（GraphPad 软件，www.graphpad.com）
软件麦哲伦 (TECAN)
禅（蔡司）

程序

线粒体的分离
目的是从选择的细胞或组织中分离线粒体。此处介绍的协议针对从小鼠骨骼肌中分离线粒体进行了优化（Prola等人，2021 年），其协议改编自 Frezza等人。(2007)。它可能需要适应所选细胞或组织的特异性。
笔记：
在磷脂富集实验之前获得纯的和功能性的线粒体是至关重要的。为了在整个过程中保持线粒体特性，重要的是 i) 使用新鲜分离的线粒体，ii) 至少减少程序不同步骤之间的时间，以及 iii) 将线粒体始终保持在冰上或 4°C步骤。
开始程序前 5 分钟在冰浴中预冷 Dounce，并在 4°C 下平衡离心机。

通过颈椎脱位杀死鼠标。使用手术刀，快速取出感兴趣的骨骼肌，并将它们浸入含有 5 ml 冰冷 PBS 并辅以 10 mM EDTA 的小烧杯中。
注意：关于动物护理和处理的地方和国家法规各不相同。确保您拥有进行动物实验的适当授权。
在同一个烧杯中，用剪刀将肌肉切成小块，去除可见的脂肪、韧带和结缔组织。
用 1 ml 冰冷的 PBS 和 10 mM EDTA 清洗切碎的肌肉两次或三次。
使用大开口移液器吸头在冰冷的 PBS 中转移切碎的肌肉，并辅以 10 mM EDTA 和 0.05% 胰蛋白酶-0.02% EDTA（每 100 毫克肌肉在 2 毫升管中约 1 毫升溶液）。用剪刀切成小块（每管需要 2/3 分钟），并在 4°C 下孵育 30 分钟。
在 4°C 下以 200 × g离心5 分钟并丢弃上清液。
在冰冷的线粒体匀浆缓冲液（MHB；参见食谱）中重悬沉淀。组织和隔离缓冲液之间的最佳比例范围在 1:10 和 1:30 (w:v) 之间（以下协议对应于 100 毫克肌肉的 2.5 毫升）。
使用 Dounce（用杵 A 上下敲击 100 次）匀化肌肉。均质化以及以下步骤必须在 4°C 下进行。
将匀浆通过 100 µm 细胞过滤器放入 50 ml 聚丙烯 Falcon 管中。
在 4°C 下以 700 × g离心10 分钟。
小心地将上清液（通过反转管）转移到玻璃离心管中，并在 4°C 下以 8,000 × g离心10 分钟。
注意：最多 200 µl 在步骤 A9 中获得的匀浆可用于二辛可宁酸定量和蛋白质印迹分析。为确保线粒体制备的纯度，请避免从颗粒中转移任何可见材料。玻璃管是首选，因为 (i) 它们是更好的热绝缘体，可以保护线粒体；(ii) 与塑料相比，它们会减少线粒体的结合，从而避免材料损失，与塑料管相比，可以制备更小、更浓缩的颗粒。
丢弃上清液，将沉淀重悬在 5 ml 冰冷的线粒体分离缓冲液 (MIB) 中。
在 4°C 下以 8,000 × g离心10 分钟。
丢弃上清液，将含有线粒体的沉淀重悬在弃上清液后剩余的少量缓冲液中（约 100 µl，避免添加更多 MIB）。线粒体现在可以使用了。
使用 1 µl 线粒体悬浮液，使用二辛可宁酸 (BCA) 测定法（He，2011）量化线粒体蛋白含量。
笔记：
此后，线粒体数量将指此处量化的线粒体蛋白质含量。
如前所述（Mourier et al., 2014），可以通过测量线粒体耦合来检查线粒体的功能。线粒体的纯度可以通过蛋白质印迹检查，如图 1 所示。100 毫克肌肉通常会产生 500-1,000 µg 的线粒体。必须在新鲜分离的线粒体上（同一天）进行以下与磷脂囊泡融合的步骤。对于其他应用，例如蛋白质印迹，可以将线粒体等分并在液氮中快速冷冻。

图 1.具有粗肌肉裂解物或纯化线粒体的代表性蛋白质印迹。INSRβ：胰岛素受体 β（质膜）、CALNEXIN（内质网）、eIF2α（细胞质）、β-TUBULIN（细胞骨架）、TBP（细胞核）、VDAC（线粒体外膜）和 COX IV（线粒体内膜）。这些印迹证实了线粒体的富集以及分离过程后其他亚细胞区室的残余物的缺失。

生产纯磷脂囊泡 (PV)
注意：使用不锈钢、玻璃或特氟龙处理脂质。不要使用塑料管或移液器吸头。有关在协议的不同步骤中拍摄的照片，请参见图 2。

图 2.生产磷脂囊泡的工作流程。A.使用 Hamilton 注射器将磷脂放入玻璃管中。B.使用氩气或氮气蒸发氯仿。C.蒸发的磷脂在试管上形成薄膜。D.向管中加入 1 ml MIB 并孵育 1 小时。E.涡旋 30 秒，溶液应出现混浊。F.在水浴超声仪中超声 25 分钟。G.超声处理后，溶液应澄清。如果不是这种情况，请重复超声处理。

使用 Hamilton 注射器，将 2 mg 磷脂（10mg/ml 氯仿原液中的 200 µl）放入玻璃管中，并使用以 0.2 bar 压力推动的氮气或氩气蒸发氯仿。在蒸发过程中旋转管子，在管子上形成一层薄薄的脂质膜（见视频 1）。
注：荧光PV的生产需加入0.2mg荧光磷脂和1.8mg非荧光磷脂。在整个过程中避光。试管可在真空泵中放置一小时以蒸发氯仿。

视频 1. 使用氩气蒸发氯仿

在管中加入 1 ml MIB（室温预平衡），室温孵育 1 小时，然后涡旋 30 秒。溶液应该是混浊的。CL 的最终 PV 浓度约为 1.38 mM（MW = 1449.9 g/mol），PC 的最终 PV 浓度约为 2.60 mM（MW = 770.1 g/mol）。
在充满冰的水浴超声仪 (40 kHz) 中对磷脂溶液进行 25 分钟的超声处理。重复此步骤直到获得清晰的溶液。
注意：管子固定在放置在水浴超声仪中的塑料架上。也可以使用探头超声仪。
立即使用或将溶液在 4°C 下保存一周。在相同条件下，每次实验前重新超声。
注意：一旦生产，PV 可以使用经典的塑料尖端进行操作。

PV与孤立线粒体的融合
将 500 µg 新鲜分离的线粒体（根据 BCA 测定）放入 2 ml 微管中，加入 2.5 mM ADP（5 µl 来自 500 mM ADP 溶液；参见配方）、15 nmol PV（10.9 µl 的 1.38 mM CL 库存溶液或 5.8 µl 2.60 mM PC 储备溶液），并使用在 30°C 下预热的 Fusion 缓冲液补足至 1 ml。
注意：按以下顺序添加试剂：线粒体、ADP 溶液、融合缓冲液和 PV。
在 30°C 下持续搅拌（每分钟 12 转）孵育 20 分钟。
注意：此处优化了 CL 和 PC 并入肌肉线粒体的孵育时间和温度。它们可能需要针对其他磷脂种类或线粒体来源进行优化。增加温度和孵育时间会增加磷脂的富集。应避免过度富集，因为它会妨碍线粒体功能。
添加 1 ml 冰冷的 MIB 以停止融合。
注意：冷却缓冲液会增加膜刚度，这与 ADP、PV 和线粒体的稀释相结合会导致融合抑制。
在 4°C 下以10,000 × g离心10 分钟以沉淀线粒体。
注意：过度富集的线粒体可能不会沉淀并可能保留在上清液中。
丢弃所有上清液，将沉淀重悬在 100 µl 冰冷 MIB 中，并在冰冷蔗糖梯度（2 ml 微管中的 1 ml 0.6 M 蔗糖）中分层，以去除未融合的 PV 和过度融合的线粒体。
在 4°C 下以10,000 × g离心10 分钟以沉淀线粒体。
丢弃所有上清液并用 1 ml 冰冷的 MIB 清洗沉淀。
在 4°C 下以10,000 × g离心10 分钟以沉淀线粒体。
丢弃所有上清液并用您选择的缓冲液重悬富集的线粒体。丰富的线粒体现在可以使用了。
笔记：
富集的线粒体对机械应力高度敏感，因此请小心吸取和操作它们（无涡流，无上下，用 200 µl 移液器轻轻吸出和弹出）。富集后快速进行实验。
这些实验的适当控制可以是 (i) 线粒体提交给相同的协议，但只存在载体 (MIB) 而不是 PV 或 (ii) 线粒体与由另一种控制脂质制成的 PV 融合。

线粒体制备
为了验证与磷脂IMM的富集，线粒体外膜（OMM）可以通过透用渗透休克，以产生纯化的对象称为丝状体（IMM加矩阵），使用以下过程组合被剥夺（改编自Chazotte和Hackenbrock，1988 )：
注意：开始程序前 5 分钟在冰浴中预冷 Dounce。
准备 OMM 透化溶液：100 µl 10×BSA 溶液（见配方）、线粒体悬浮液（来自 A13）、毛地黄皂苷（每 µg 线粒体蛋白 0.12 µg 毛地黄皂苷，例如，对于 100 µg 线粒体，添加 12 µl 毛地黄皂苷） 1 mg/ml 溶液；参见配方）并用 Mitoplast 制备缓冲液（MPB；参见配方）补足至 1 ml。
注意：按以下顺序添加试剂：MPB、线粒体、10×BSA，然后是毛地黄皂苷。一毫升足以容纳多达 500 微克的线粒体；对于更高的数量，应该增加音量。
在 4°C 下持续搅拌（每分钟 12 转）孵育 15 分钟。
在 4°C 下以 8,000 × g离心10 分钟。
弃去上清液，将沉淀重悬在 1 ml 冰冷的低渗线粒体制备缓冲液（HMPB；参见食谱）中，并在 4°C 振荡孵育 15 分钟。
使用 Dounce（用杵 A 上下敲击 100 次）使线粒体均质化。
在 4°C 下以 8,000 × g离心10 分钟。
弃去上清，将沉淀重悬在 1 ml 冰冷的 HMPB 中，并在 4°C 下以 8,000 × g离心10 分钟。
丢弃上清液并用您选择的缓冲液重悬沉淀。Mitoplasts 现在可以使用了。
注意：当放置在低渗缓冲液中时，线粒体没有嵴并形成直径约 1 µm 的大囊泡。纯化的效率可以通过显微观察来验证（图 3A）。通过用含有 Mitotracker 的缓冲液（在您选择的缓冲液中将 1 mM 储备溶液稀释至 100 nM）重悬沉淀，可以对线粒体进行染色。在室温下孵育 10 分钟后，以 8,000 × g 离心 10 分钟，丢弃上清液，并将沉淀重悬在您选择的缓冲液（例如 HMPB）中，以将它们与纯脂质囊泡区分开来（图 3B）。可以通过蛋白质印迹检查来自 OMM 的蛋白质没有污染（图 3C）。

图 3.线粒体制备的验证。A. HMPB 缓冲液中的代表性线粒体形状和大小。比例尺，2 µm。B.用 MitoTracker Red 染色的线粒体。比例尺，1 µm。C. MFF（外线粒体膜）和 COX IV（内线粒体膜）蛋白质在总肌肉裂解液、纯化线粒体和线粒体中的含量。这些印迹证实了纯化线粒体中线粒体蛋白的富集比例以及线粒体外膜中没有残留物。

磷脂富集的验证
荧光脂质的使用允许验证线粒体与磷脂的富集。对于 CL，也可以使用与 CL 结合的吖啶橙 10-壬基溴 (NAO) 探针验证富集（Garcia Fernandez等，2004）。

荧光脂
使用程序 C 中描述的协议将线粒体与含有荧光脂质的 PV 融合（见 B1 中的注释）。
然后可以通过使用荧光分光计测量荧光或根据所用脂质的荧光特性通过显微镜观察荧光来检查含有磷脂的线粒体富集（图 4）。

图 4.心磷脂富集和 MitoTracker Red 染色。与 TopFluor-心磷脂 (CL) 囊泡融合并用 Mitotracker Red 染色后由线粒体制成的线粒体的代表性图像。比例尺：1 µm。

如果预计在 IMM 中加入, 可以从富集的线粒体中制备有丝分裂 (参见程序 D), 并如图 3 所示进行检查。

NAO量化
注意：必须包括未用 NAO 染色的线粒体的实验对照进行量化（参见数据分析）。
按照程序 C 中的描述用 CL 富集后，在 4°C 下用 2% 的甲醛（参见食谱）固定分离的线粒体或线粒体（100 µg 蛋白质）15 分钟。
注意：建议在 NAO 染色前进行固定，以消散干扰 NAO 荧光的线粒体膜电位。
在 4°C 下以 10,000 × g离心10 分钟。
弃去上清液，用 1 ml 冰冷的 PBS 重悬沉淀。
在 4°C 下以 10,000 × g离心10 分钟。
丢弃上清液，将沉淀重悬在 100 µl PBS 中，并辅以 35 µM NAO（来自 DMSO 中的 35 mM 储备溶液；参见食谱）。
在室温下孵育 10 分钟。
在 4°C 下以 10,000 × g离心10 分钟。
弃去上清液，用 1 ml 冰冷的 PBS 重悬沉淀。
在 4°C 下以 10,000 × g离心10 分钟。
弃去上清液，将沉淀重悬在 100 µl PBS 中，然后转移到 96 孔板（黑色、µclear 平底）中。
用荧光分光计测量荧光（λ 激发：495 nm，λ 发射：620 nm）（图 5）。

图 5.心磷脂富集和 NAO 量化。A.在由 CL 制成的不同数量的 PV 存在下的 NAO 荧光。线性回归以虚线显示，并带有相应的 R² 拟合。B.在 30°C 下 0（对照）、10、20 和 30 分钟，将 500 µg 线粒体与 20（红色）或 40（蓝色）nmol CL 囊泡融合后的 NAO 荧光。结果显示为相对于设置为 1.0 的控制。线性回归以虚线显示，具有相应的 R 2拟合。

数据分析

对于分光光度计上的荧光分析（程序 E 中描述的荧光脂质或 NAO 实验），获得的值从空白（不含荧光脂质或未用 NAO 染色的线粒体）中校正，并根据线粒体蛋白质含量进行归一化。然后将值表示为相对于设置为 1.0 的控制。

笔记

该协议已针对用 CL 和 PC 富集线粒体膜进行了优化。可能需要对其他磷脂的富集进行一些调整，并使用荧光脂质进行验证。
虽然 ATP/O 比率不受 CL 富集的影响，但呼吸的绝对速率和 ATP 产生均降低，如先前报道（Prola等，2021）。这可能是由于膜内呼吸链复合物的稀释（Schneider等，1980）或磷脂富集后脂质排列受损。PC 富集会损害绝对呼吸速率和 ATP/O 比率。
这种多步骤程序会导致材料损失，因此，在开始时必须使用大量线粒体（根据应用，至少使用 300 µg 线粒体）。

食谱

线粒体匀浆缓冲液 (MHB)
67 mM 蔗糖
50 毫米氯化钾
10 mM EDTA
0.2% BSA
50 mM Tris-HCl
pH 7.40（用 1 M KOH 溶液缓冲）
在 -20°C 下储存数月，不含 BSA。
即用型 BSA 溶液可在 4°C 下保存一周。
线粒体分离缓冲液 (MIB)
250 mM 蔗糖
3毫米EGTA
10 mM Tris-HCl
pH 7.40（用 1 M KOH 溶液缓冲）
在 -20°C 下可在 4°C 下储存数月或一周。
注意：对于食谱 1 和 2，请参阅 Frezza 等人。(2007) 获取更详细的说明。
ADP解决方案
500 毫米 ADP
150 mM 氯化镁2
等分试样可在 -20°C 下储存。
融合缓冲液
220 mM 甘露醇
70 mM 蔗糖
2 毫米 HEPES
10 mM KH 2 PO 4
5 毫米氯化镁2
1 mM EGTA
10 mM 谷氨酸盐
2 mM 苹果酸盐
10 mM 丙酮酸
pH 6.50（用 1 M KOH 溶液缓冲）
在 -20°C 下可在 4°C 下储存数月或一周。
10×BSA溶液
在 1 ml MPB 中稀释 5 mg 不含脂肪酸的 BSA。当天使用。
洋地黄皂苷溶液
在 1ml MPB 中稀释 1 mg 毛地黄皂苷，在 95°C 下加热 5 分钟，并在使用前在冰上冷却。
当天使用。
线粒体制备缓冲液 (MPB)
70 mM 蔗糖
220 mM 甘露醇
2 毫米 HEPES
pH 7.40（用 1 M KOH 溶液缓冲）
在 -20°C 下可在 4°C 下储存数月或一周。
低渗线粒体制备缓冲液 (HMPB)
在去离子 H 2 O中将 MPB 稀释 7.5 倍（例如，6 ml MPB 和 39 ml 去离子 H 2 O 用于 45 ml HMPB）。当天使用。
Mitotracker Red 1 mM 原液
将 94 µl DMSO 添加到 50 µg 小瓶中。分装并储存在 -20°C。
甲醛 2%
在 PBS 中稀释甲醛原液。
壬基吖啶橙 35 mM 原液
在 605 µl DMSO 中稀释 10 mg NAO。等分试样可以储存在 -20°C。

致谢

这项工作主要得到“Association Française contre les Myopathies”（AFM 16143，Translamuscle I #19507 和 Translamuscle II #22946）的支持。
这种方法最初是在 Prola等人中使用的。(2021)科学进展，DOI：10.1126/sciadv.abd6322。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突或竞争利益。

参考

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