材料和试剂

Centricon ®离心过滤器（Millipore，目录号： UFC801024）
1.7 ml Eppendorf 管（VWR，目录号：87003-294）
Pyrex 试管（VWR，目录号：60815-104）
1 cm 比色皿，带有用于 UV 和 CD 的密封盖（Hellma，目录号：117200F-10-40）
1 mm 带气密盖的比色皿用于 CD（Hellma，目录号：110-1-40）
4 mm 石英 EPR 管（Wilmad，目录号：707-SQ-250M）
EPR 管的橡胶帽（McMaster，部件号：92805K7）
PD 10 脱盐柱（GE，目录号：GE17-0851-01）
Tris-base（JT Baker，目录号：410901）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G6279）
用于 EPR 实验的液氦
硝酸（HNO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：225711）
ICP的铁标准（Millipore，目录号：43149）
ICP的硫标准（Millipore，目录号：18021）
五水硫酸铜（II）（CuSO 4 ·5H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：203165）
1 M连二亚硫酸钠（Na 2 S 2 O 4 ）（Merck，目录号：1065070500）（参见配方）
缓冲液 A（见配方）
缓冲液 B（见配方）
缓冲液 C（见配方）

设备

Sorvall 离心机（Thermo Scientific，型号：Sorvall LYNX 6000，目录号：75006590）
迷你离心机（Eppendorf，Minispin，目录号：22620100）
pH计（Hanna，Edge pH计，目录号：HI2002-01）
NanoDrop（Denovix，型号：DS-11 FX+）
紫外可见分光光度计（Jasco，型号：V-7200分光光度计，目录号： V-7200）
CD光谱仪（Applied Photophysics，Chirascan-plus，目录号：V100）
EPR机（布鲁克，型号：ELEXSYS-E580e，目录号： E580）
水浴（Fisher Scientific，Isotemp，目录号：205 FS-205）
ICP-AES（安捷伦，型号：ICP-OES 5110，目录号：5110）
充满 N 2 /H 2 (95%/5%) 的厌氧室（Coy 实验室，乙烯基厌氧室，目录号：A 型）
矩形 EPR 谐振器 (Bruker 4102ST)
Oxford 氦流低温恒温器 (ESR900)

软件

光谱管理器套件（由 Jasco 为V-7200 分光光度计提供）
Chirascan Q100 软件（由 Applied Photophysics 提供，用于 Chirascan-plus V100 CD 光谱仪）
Xepr 软件（布鲁克为 ELEXSYS-E580e EPR 机器提供）
用于数据分析的 Igor Pro（需要来自www.wavemetrics.com 的许可）

程序

以下方法描述了执行紫外-可见光吸收、CD、热变性（二级结构和 [4Fe-4S] 簇）、EPR 和 ICP-AES 所需的样品制备和实验设置。这些方案已在 CCIS 蛋白和 CCIS 的helix-1上成功证明（Jagilinki等，2020）。这些方法通常可用于任何天然和人工 [4Fe-4S] 结合蛋白。

紫外可见分光光度计
打开紫外可见分光光度计。
打开光谱管理器套件并在设置选项卡下更新以下信息：开始，800 nm；停止，260 纳米；平均时间，0.1 秒；数据间隔，1 nm；和扫描速率，600 nm/min。
将 1-2 ml 缓冲液 A 添加到 1 cm 路径石英比色皿中，并记录 800 和 260 nm 之间的背景空白光谱。
在缓冲液 A 中加入 1-2 ml 100-200 µM Holo-CCIS 到 1 cm 路径石英比色皿中（图 1A ），并在厌氧室内用气密帽密封；将比色皿转移到紫外可见光谱仪中。

图 1. 用于紫外-可见光谱的密封比色皿。A. 1 厘米光程石英比色皿，带密封盖，用于在可见光区域执行 UV 和 CD。B. CCIS 蛋白的紫外-可见光谱。

记录 800 到 260 nm 之间的光谱，从样品光谱中减去缓冲液 A 光谱。
典型的 [4Fe-4S] 光谱包含一个显着的峰值，最大吸光度在 395 到 400 nm 之间，特征肩在 320 到 360 nm 之间（见注 1）。请参阅 Jagilinki等人的图 3(A) 插图。(2020) 或图 1B 。
关闭紫外可见分光光度计。

远紫外 CD 光谱
在打开 CD 光谱仪之前，将氮气流转入 CD 光谱仪并让它吹扫至少 30 分钟。
在此期间，使用 PD-10 柱将蛋白质缓冲液更换为缓冲液 B（见注 2）。
切开 PD-10 柱的底部尖端，并通过厌氧室内的重力流从柱中排出液体。
通过 50 ml 缓冲液 B 平衡柱，然后加载 2.5 ml 蛋白质并使其进入 PD-10 柱。
然后，间歇性地加入 1 ml 缓冲液 B 并开始收集 3 ml 至 6 ml 的蛋白质。
如果蛋白质浓度高于要求，用缓冲液 B 稀释，直到浓度达到 10-20 µM。
打开 CD 光谱仪并在 Chirascan Q100 软件中设置以下参数：带宽，1 nm，数字积分时间，2 秒。确保在整个实验期间有不间断的氮气流进入 CD 光谱仪。
将 200-300 µl 缓冲液 B 添加到 1 mm 路径石英比色皿中，并记录 250 到 195 nm 之间的背景空白光谱。
将 200-300 µl 10-20 µM 蛋白质加入 1 mm 路径石英比色皿中，并在厌氧室内用气密帽密封；将比色皿转移到 CD 光谱仪中。
记录 250 到 195 nm 之间的光谱，减去空白光谱。
记录蛋白质的全息和载脂蛋白形式的光谱（见注 3）。
富含 α 螺旋蛋白的典型远紫外光谱在 222 和 208 nm 处包含两个突出的负带（参见图 2A 中的迹线），而富含 β 蛋白的典型远紫外光谱在 215 和 218 之间有一个主要的宽下降纳米。
完成 CD 实验后，关闭 CD 程序并关闭 CD 光谱仪。在关闭氮气流之前，让氮气再流入 CD 光谱仪 15 分钟。
要将 CD 值转换为平均残留椭圆度，请使用以下等式：

等式 1

在哪里，
MRE代表平均残差椭圆度，
( θ ) 是以度为单位的椭圆度，
C是摩尔蛋白质浓度，
N是蛋白质中氨基酸的数量，
l是光程长度，单位为 cm。

可见光区的 CD 光谱
在打开 CD 光谱仪之前，打开氮气流并将其吹扫至少 30 分钟。
将 1-2 ml 缓冲液 B 添加到 1 cm 路径石英比色皿中，并记录 800 和 300 nm 之间的背景空白光谱。
将 1-2 ml 200 µM 蛋白质加入 1 cm 路径石英试管（图 1A ）中，并在厌氧室内用气密帽密封；将比色皿转移到 CD 光谱仪中。
记录 800 到 300 nm 之间的光谱减去空白光谱（见注 4）。
可见区域中典型的 [4Fe-4S] CD 光谱在大约 360 nm 和 550 nm 处包含两个明显的波谷，以及在 430 到 440 nm 之间的特征波峰（参见图 2B 中的迹线）。对于其他类型簇的可见光区 CD 光谱，请参阅 Freibert等人。(2018)。

图 2. 热变性曲线。A. CCIS helix-1 在远紫外区的热变性曲线，以确定蛋白质二级结构的热稳定性。B. CCIS 的 helix-1 在可见光区的热变性曲线，以确定 [4Fe-4S] 簇的热稳定性。

在远紫外光下使用 CD 光谱进行热变性
如 B 部分所述，在远紫外区域记录 CD 光谱后，在 CD 操作软件中启动热动力学程序。
将温度范围设置在 20 到 90°C 之间，扫描之间的间歇步长为 2°C。允许样品在每个温度下孵育至少 5 分钟。
启动热变性程序。分别记录全息和载脂蛋白形式的蛋白质（见注 5）。
从上述实验中选择一个特定波长（α-螺旋蛋白为 222 nm，β-折叠蛋白为 218 nm）并在 X 轴上绘制一条与温度相关的曲线以确定蛋白质的熔解温度 (Tm)（参见注 6）。

在可见光区使用 CD 光谱进行热变性
在可见区域记录 CD 光谱后，如 C 部分所述，在 CD 操作软件中启动热动力学程序。
将温度范围设置在 20 到 90°C 之间，扫描之间以 2°C 为增量。让样品在每个温度下孵育至少 12 分钟（见注 7）。
启动热变性程序。仅对全蛋白进行实验。
从上述实验中选择一个特定波长（通常在 400 和 450 nm 之间）并在 X 轴上绘制一条与温度的曲线图以确定蛋白质中铁硫簇的熔化温度 (Tm)（参见注释 6） .

通过 EPR 在 CCIS 中识别铁硫簇
处于静止氧化还原状态的铁硫簇 [4Fe-4S] 2+是抗磁性和 EPR 沉默的。对于 EPR 表征，使用连二亚硫酸钠 (Na 2 S 2 O 4 )将铁硫簇还原为顺磁性状态 [4Fe-4S] 1+ （参见注释 8）。
在厌氧室中准备两个 EPR 样品：一个处于静止状态 [4Fe-4S] 2+ ，第二个处于连二亚硫酸盐还原状态 [4Fe-4S] 1+ 。对于每个样品，在缓冲液 C 中使用 200 µl 200 µM 全息 CCIS（见注 9）。对于减少连二亚硫酸盐的样品，添加 8-10 µl 1 M 连二亚硫酸钠 (Na 2 S 2 O 4 )。
将溶液在 eppendorf 管中适当混合，将静止和还原态样品转移到干净的 EPR 石英管中；用密封橡胶帽密封管子的开口端。
从厌氧室中取出 EPR 管, 并立即在液氮中冷冻。始终保持样品冷冻。
使用矩形 EPR 谐振器 (Bruker 4102ST) 和牛津氦流低温恒温器 (ESR900) 在 10-30 K 记录还原和静止状态样品的连续波 (cw) EPR 光谱。
应用以下实验条件：微波功率，0.2-2 mW，调制幅度，1-2 mT。
确认处于静止氧化还原状态 [4Fe-4S] 2+ 的全蛋白样品不存在任何 EPR 信号。
连二亚硫酸钠还原的 [4Fe-4S] 1+蛋白质的典型 EPR 谱显示轴向 EPR 线形状，由两个主要峰组成，并显示在对应于 g|| 的磁场中。(g1) 的平均值在 2.08 和 2.04 之间，g ⊥ (g2,g3) 的平均值在 1.94 和 1.90 之间。请参阅 Jagilinki等人的图 3(B) 。(2020) 或图 3 。对于其他类型的铁硫簇的 EPR 光谱特性，请参阅 Bertini等人。(1995)。

图 3. CCIS 的 EPR 光谱。CCIS 蛋白质的 EPR 光谱，g 值表明蛋白质中存在 [4Fe-4S] 簇。

要准确确定 [4Fe-4S] 1+信号的特征 g 因子值，请使用为 Matlab 开发的 EasySpin 工具箱（Stoll 和 Schweiger，2006 年）执行 EPR 信号模拟。
全肽样品中还原的 [4Fe-4S] 1+簇的定量产率可以通过自旋计数分析确定，其中记录的 [4Fe-4S] 1+的积分强度与信号的积分强度进行比较具有已知自旋数的 EPR 标准样品（参见注释 10）。这些分析可以直接在 Xepr (Bruker) 软件中进行。

ICP-AES 测定 CCIS 蛋白质中铁和硫的含量
将缓冲液 A 中的 100 μl 1 mg/ml CCIS 蛋白质置于90°C 水浴内的干净玻璃试管中，使用 50% HNO 3进行酸水解。
隔夜酸水解后，用双蒸水稀释样品。
样品的最终体积为3.7 ml，HNO 3的最终浓度约为2.5%。
将样品在 1.7 ml Eppendorf 管中以 4,427 × g在 4°C 下离心5 分钟。
缓冲液 A 的处理方式与步骤 G1-G4 相同。
使用 2.5% HNO 3对标准样品在 0.1-5.0 ppm 范围内的铁和 0.5-100 ppm 范围内的硫进行系列稀释（图 4 ）。

图 4. ICP-AES 的标准曲线。A. 铁的标准曲线。B. 硫的标准曲线。

通过选择波长 238.204 nm 来量化铁含量来收集数据。分别记录标准品、蛋白质和缓冲液。
同样，通过选择 181.972 nm 收集用于量化硫的数据。
减去相应的空白值，分别确定铁和硫的确切含量。
分别绘制铁和硫的标准图并确定蛋白质样品的值。

数据分析

CCIS在远紫外区热变性的数据分析
获取对应于 222 nm 的椭圆率值的变化，并根据温度绘制曲线。要计算准确的熔化温度 (Tm)，请使用 Yadav 和 Ahmad (2000) 描述的方程或参考以下方程：

在哪里，
a和b是两个不同的温度无关常数，
N和D对应于蛋白质的天然和变性状态，
ΔH Van是焓的变化，
R = 1.9872 × 10 -3 kcal K -1 mol -1 ，
T是以开尔文为单位的温度。

在 Igor Pro 软件中打开数据文件（Excel 文件）。
选择合适的列和绘图图；仅以点表示数据（不要绘制线）。
在“分析”选项卡下，选择“曲线拟合”，然后选择“新拟合函数”。
在“拟合函数名称”下为程序命名。
在“拟合系数”选项卡下，键入“aD、bD、aN、bN、Tm、Hm”。
在“独立变量”下，键入“t” 。
在“拟合表达式”下编译以下代码。
变量 yN, yD, KD, R = 1.987e-3, Tk = t + 273。
yN = aN + bN × Tk
yD = (aD + bD × Tk)
KD = exp[-(Hm/R) × (1/Tk-1/Tm)]
f(t) = (yN + yD × KD)/(1+KD)
编译上述代码后，按“测试编译”（见注释 11）。
按“立即保存拟合函数”保存 fut 函数文件。
通过选择上述拟合函数执行非线性回归并确定开尔文中的 Tm（见注释 12）。

[4Fe-4S]簇在全息CCIS可见光区热变性的数据分析
取对应于 400 nm 的椭圆率值的变化，并根据温度绘制曲线。要计算准确的熔化温度 (Tm)，请使用 Jagilinki等人在补充数据中描述的等式 1 。(2020)或参考以下等式：

在哪里，
a 、b和c是三个不同的与温度无关的常数。对于其余的常数和变量，请参阅上面公式 2 中提到的详细信息。

在 Igor Pro 中打开数据文件（Excel 文件）。
选择合适的列和绘图图；仅以点表示数据（不要绘制线）。
在“分析”选项卡下，选择“曲线拟合”，然后选择“新拟合函数”。
在“拟合函数名称”下为程序命名。
在“拟合系数”选项卡下，键入“aD、bD、cD、aN、bN、cN、Tm、Hm”。
在“独立变量”下，键入“t”。
在“拟合表达式”下编译以下代码。
变量 yN, yD, KD, R = 1.987e-3, Tk = t + 273。
yN = aN + bN × Tk + cN × Tk 2
yD = aD + bD × Tk + cD × Tk 2
KD = exp[-(Hm/R) × (1/Tk-1/Tm)]
f(t) = (yN + yD × KD)/(1 + KD)
编译上述代码后，按“测试编译”（见注释 11）。
按“立即保存拟合函数”保存 fut 函数文件。
通过选择上述拟合函数执行非线性回归并确定开尔文中的 Tm（参见注释 12）.

笔记

基于 410/280 的比率，可以估计蛋白质中存在的铁硫簇的数量。CCIS 单体在其序列中具有三个色氨酸，它是一个全三聚体。因此，全蛋白具有九个色氨酸和一个 [4Fe-4S] 簇，预计 410/280 比率较低，在这种情况下约为 0.2（图 1B）。但是，如果全息 CCIS 是二聚体 (6 W) 或单体 (3 W)，则 410/280 比率会更高。不含色氨酸的 [4Fe-4S] 蛋白质的 410/280 比值要高得多。
CD 对盐和缓冲液浓度高度敏感。盐浓度通常应为 50 mM 或更低。
在某些情况下，金属结合可以稳定目标蛋白的二级结构；例如，CCIS 对全息和载脂蛋白形式具有不同的 CD 光谱。
对于更高分辨率的光谱，以高达 5 到 10 nm/s 的较低速度扫描。
在大多数情况下，与脱辅基蛋白相比，全蛋白的二级结构会增加热稳定性。
整个实验必须用比色皿上的密封盖进行，以保持全蛋白的厌氧性质。
由于 1 cm 路径比色皿需要更长的孵育时间，这通常需要更多时间来实现比色皿中样品的均匀温度。
Na 2 S 2 O 4溶液应新鲜制备。
如果蛋白质浓度低于 200 µM，则在厌氧条件下，在 4,000 rpm 和 4°C 下使用截留值为10 kDa 的 Centricon ®浓缩蛋白质。
一个小的 CuSO 4·已知重量的5H 2 O 晶体可用作 EPR 自旋计数标准。
代码不应提示任何错误；否则，从一开始就验证代码。
要计算以°C 为单位的 Tm，请用 273 减去 Tm（以开尔文为单位）。

食谱

1 M 连二亚硫酸钠 (Na 2 S 2 O 4 )
将 0.174 mg Na 2 S 2 O 4溶解在 1 ml 双蒸水中（见注 8）。
缓冲液A
50 mM Tris-HCl pH 8.0
200 毫米氯化钠
缓冲液B
10 mM Tris-HCl pH 8.0
40 毫米氯化钠
缓冲液 C
50 mM Tris-HCl pH 8.0
200 毫米氯化钠
15% 甘油

致谢

DN 承认以色列科学基金会石油替代运输补助金 (GA 2185/17) 的财政支持。DN 和 VN 承认欧洲研究委员会 (ERC) 整合者赠款 (GA615217)。DN、VN、AMT 和 BPJ 得到了 NASA 天体生物学研究所拨款 80NSSC18M0093 的进一步支持。本文中描述的协议改编自各种研究文章，这些文章表征了五十年来发表的铁硫蛋白。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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Freibert, SA, Weiler, BD, Bill, E., Pierik, AJ, Muhlenhoff, U. 和 Lill, R. (2018)。铁硫蛋白的生化重构和光谱分析。方法 Enzymol 599：197-226。
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