材料和试剂

培养皿直径 100 mm（SYM Laboratorios，目录号：7730SYM）
移液器吸头（Thermo Scientific ，目录号：94300210 [1,000 μ]; 94300110 [100 μl] 和101-96R-Q [10 μl] )
5 mm 直径无菌不锈钢冲头（Avantor，目录号：10194-928）
0.22 μm 无菌过滤器（Millipore，目录号：SLGVV255F）
用于过滤器灭菌的 5 毫升注射器（JTC，目录号：05LSA-NPRO）
15毫升管（Axygen，目录号：SCT-15ML-500）
卡尺（MIYUTOYO ，目录号：531）
锥形瓶（Pyrex，目录号：CLS44501L-1EA ）
真菌分离物进行测试
培养基马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（Bioxon，目录号：210700 ）
蒸馏水（Meyer，目录号：HDS 0345）
选定的重金属，用作盐：
铬 Cr（III）（CrCl 3 ）（Sigma-Aldrich ，目录号：450790）
汞 Hg（II）（HgCl 2 ）（Sigma-Aldrich ，目录号：215465）
铅 Pb(II)（Pb（C 2 H 3 O 2 ）2 ）（Meyer，目录号：HDS 1955）

设备

分析天平（Ohaus Adventurer ，目录号：H-5276 ）
移液器（Thermo Scientific ，目录号：4651270N [1,000 μl]；4651230N [100 μl] 和 4651280N [10 μl]）
高压釜（Evar ，目录号：EV-24）
微生物培养箱（Thermo Fisher Scientific ，目录号：50129111 ）
微生物安全柜（Thermo Fisher Scientific ，目录号：1310TS1）

软件

T-检验包ggpubr（ř包版本0.1.7。https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr）
R 核心团队 ( https://www.Rproject.org/ )

程序

重金属股与文化传媒
在六种不同浓度的无菌条件下制备库存：2.5 mM、5 mM、7.5 mM、10 mM、15 mM 和 20 mM 的 Cr(III)、Hg(II) 和 Pb(II)。
将每个浓度的膳食盐溶解在蒸馏水中，使用 0.22 µm 过滤器过滤灭菌，并在室温下储存直至使用（最多 3 个月）。
使用蒸馏水在锥形瓶中制备 PDA 固体培养基，并通过高压灭菌（121°C 和 15 psi 压力 20 分钟）进行消毒。需要每种重金属浓度的琼脂烧瓶和不含重金属溶液的琼脂烧瓶，用作每种真菌分离物的对照。
灭菌后，让琼脂冷却至 50°C，并在无菌条件下加入重金属溶液。每个培养皿倒入 20 毫升补充琼脂。在 4°C 下储存直至使用（最多 3 个月）。

栽培方法
在无菌条件下，在 PDA 上接种真菌分离物（1 × 10 6分生孢子/ml），不添加重金属，并在 28°C 下孵育 14 天以诱导分生孢子（预生长状态）。
在第一次孵化时间（预生长状态）后，使用直径为 5 毫米的无菌不锈钢冲头从菌落边缘冲出新鲜菌丝体的琼脂块。此步骤应在微生物安全柜中进行。根据不同重金属浓度的平板数量，每个菌株需要几个插头。
用不同浓度的重金属接种板和中心的控制板，每板一个塞子，并在 28 °C下孵育14 天。
每种真菌和重金属浓度以及对照培养物应进行六次重复。两种分离株的代表性真菌生长如图 1 所示。

图 1. 在 PDA 上培养 14 天后四种不同浓度的真菌重金属抗性。该图显示了Periconia citlaltepetlensis （顶部）和Alternaria sp。生长（底部），不含重金属（A、F）和存在 2.5 mM（B、G）、5 mM（C、H）、7.5 mM（D、I）或 10 mM（ E、J)。

最低抑菌浓度和耐受指数
接种后，每天用卡尺测量菌落大小。
通过减去插头的初始直径 (5 毫米) (图 2 和表 1) 在 14 天的生长过程中计算基于五次测量 (以毫米为单位) 的径向生长。

数据分析

MIC 定义为 14 天后抑制分离株可见生长的最低浓度（Joo 和 Hussein，2012）。
使用 R (R Core Team, 2018) 中的 T 检验包 ggpubr (Kassambara, 2018) 使用未配对的两个样本学生t检验对结果进行绘图和统计评估。统计数据和图表将有助于了解所测试的每种真菌对金属的耐受能力（图 2）。

图 2. 不同浓度铅对链格孢菌的影响。生长。真菌在 PDA 琼脂上以六种不同浓度的 Pb(II)（2.5 mM、5 mM、7.5 mM、10 mM、15 mM 和 20 mM）在 28°C 下培养 14 天。误差棒代表每个培养期的至少两个独立测量中三个技术重复的平均值的标准误差。n = 5。***，与对照相比，铅上真菌生长的P值 < 0.001。

该TI计算，这是指示如何生物体耐受应力（Mohammadian-Fazli等人，2015），是对于每个金属和真菌菌株确定的与所述集落的每日测量（图3）。TI 应根据不同浓度下重金属真菌生长 (HMFG) 的测量值除以对照培养真菌生长 (CFG) 来计算。

接近 1 的 TI 表明真菌对测试的重金属浓度具有抗性（图 3）。

图 3. Curvularia sp 的测量。两种不同浓度的铬。该图显示了控制真菌生长 (CFG) (A) 和 2.5 mM (B) 或 5 mM (C) 的 CrCl3 (HMFG)。红色箭头代表监测真菌生长的每日测量值。

为了选择最耐受的真菌，必须评估 TI 和 MIC 测定的值。表 1 显示了三种分离株的 MIC 和 TI 值的代表性数据。

表 1. 三种极端微生物在不同浓度的 Cr(III)、Hg(II) 和Pb(VI) 在培养基上生长 14 天的MIC 和 TI
MIC：以毫摩尔为单位的最小抑制浓度。
TI：7.5 mM 和 10 mM 重金属的耐受指数计算。

笔记

这是生成有关金属耐受性和可能的生物修复过程的相关数据的简单、更容易且更便宜的方法。
这里提出的培养基 (PDA) 可用于广泛的真菌物种，甚至那些难以培养的真菌物种。
使用该方案成功地测试了挑剔的分离物（例如，极端嗜热和耐冷真菌）。

致谢

作者感谢 CONACYT 博士后奖学金 (005352)，并感谢图 1 中 Fernández-Tellez IE 的合作。这项工作致力于为在墨西哥攀登冰川、对抗厌女症和争取平等的女性赋权。该协议基于原始研究论文（Calvillo-Medina等人，2020 年）。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考

Akhtar, S.、Mahmood-ul-Hassan, M.、Ahmad, R.、Suthor, V. 和 Yasin, M.（2013 年）。从未经处理的市政污水灌溉的土壤中分离出的丝状真菌的金属耐受潜力。土壤环境32（1）：55-62。
Al-janabi, AAHS (2010)。重金属对皮肤癣菌的毒性作用。真菌病54：345-349。
Calvillo-Medina, RP, Gunde-Cimerman, N., Escudero-Leyva, E., Barba-Escoto, L., Fernández-Tellez, EI, Medina-Tellez, MM, Bautista-de, Lucio, V., Ramos- López, MA 和 Campos-Guillén, J. (2020)。从 Citlaltépetl 和 Iztaccíhuatl 火山（墨西哥）的三个高海拔冰川中回收的可培养真菌的丰富度和金属耐受性。极端微生物 24(4): 625-636。
Fernández-Marcelo, P., Martorell, MM, Blaser, MG, Mauro-Ruberto, LF, Castellanos-de, Figueroa, LI 和 Mac Cormack, WP (2017)。南极酵母的苯酚降解和重金属耐受性。极端微生物 21：445-457。
Iram, S.、Parveen, K.、Usman, J.、Nasir, K.、Akhtar, N.、Arouj, S. 和 Ahmad, I. (2012)。从工业废水灌溉的土壤中分离出的丝状真菌菌株的重金属耐受性。生物学58（3）：107-116。
Joo, JH 和 Hussein, KA (2012)。从污染土壤中分离出的真菌对重金属的耐受性。韩国土壤科学杂志45（4）：565-571。
Kassambara, A. (2018)。ggpubr：基于“ggplot2”的出版就绪图。R 包版本 0.1.7。
Kumar, R.、Singh, P.、Dhir, B.、Sharma, KA 和 Mehta, D.（2014 年）。一些真菌和细菌物种在重金属生物修复中的潜力。J 核物理学，Mater Sci，辐射应用1(2)：213-223。
Mohammadian-Fazli, MM、Soleimani, N.、Mehrasbi, M.、Darabian, S.、Mohammadi, J. 和 Ramazani, A. (2015)。高度耐镉真菌：它们的耐受性和去除潜力。J 环境健康科学工程 13：19 。
R 核心团队。(2018)。R：统计计算的语言和环境。R 统计计算基础。
Rehman, A. 和 Anjum, MS (2011)。镉的多金属耐受性和生物吸附从工业废水中分离的热带念珠菌：谷胱甘肽作为解毒剂。环境监测评估174(1-4)：585-595。
版权所有 © 2021 作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。 1