材料和试剂

鲁尔锁注射器盖密封件（粘合剂分配，目录号：7015LLPK ）
10cc透明注射器筒（粘合剂分配，目录号：7100LL1NPK ）
10cc注射器活塞（粘合剂分配，目录号：7100009WPK ）
27 G 针，0.25 英寸长（粘合剂分配，目录号：TE727025PK）
5毫升注射器（VWR，目录号：613-2043）
RGD γ 辐照藻酸盐（由 Alsberg 实验室的合作者内部制造）
也可以使用市售的 NOVATACH TM肽偶联海藻酸盐，但需要根据所用海藻酸盐的 MW 修改交联率。
三磷酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：72061）
Darvan 821AVR（范德比尔特矿业公司，DARVAN ® 821-A）
氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
血管内皮生长因子（Peprotech，目录号：100-20）
Bone Morphogenic Protein-2（Peprotech，目录号：120-02）
甲基纤维素（Sigma-Aldrich，目录号：M7027）
Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（GlutaMAX TM ；ThermoFisher，目录号：61965026）
胎牛血清（FBS；Thermo Scientific，目录号：10270-106）
青霉素链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：15070063）
Laponite (Laponite XLG, BYK Additives & Instruments)
聚己内酯（PCL；CAPA 6500D，Perstorp，Mn = 50 kDa）
氯化钙（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
硫酸钙（Sigma-Aldrich，目录号：255696）
3.5% RGD γ-辐照海藻酸盐溶液（见配方）
100 mM氯化钙溶液（见配方）
60 mM硫酸钙溶液（见配方）
三磷酸钠溶液（见配方）

设备

无菌搅拌棒和搅拌板
3D 生物绘图仪（RegenHU、3D Discovery、第 1 代）

软件

BioCAD (RegenHU, 3D Discovery, Generation 1 )
GraphPad (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA; www.graphpad.com )

程序

PCL骨干的3D打印工艺
使用 RegenHU 的 3D bioplotter 打印所有支架。
打印直径为 4 毫米、高度为 5 毫米的结构，具有横向和横向孔隙率以及 1.2 毫米的纤维间距，使用 30G 针使用聚己内酯，图 1。

图 1. PCL 框架的几何特征

PCL的打印参数列于表1中。
在水凝胶打印之前使用环氧乙烷 (ETO) 消毒对支架进行消毒。

表1. 使用 RegenHU 生物打印机用 PCL 打印支架的参数

生成血管和骨诱导生物墨水
注意：每种溶液都应在打印前新鲜配制。
制备3.5% RGD γ-辐照海藻酸盐溶液（见食谱）。
添加甲基纤维素 (2:1) (w/w) 颗粒并使用无菌搅拌棒和搅拌板混合到溶液中。对于 5 克藻酸盐，添加 2.5 克无菌甲基纤维素。
按照先前描述的方案在无菌条件下制备 nHA（Cunniffe等人，2010 年。简而言之：
准备 100 mM 氯化钙溶液（见配方）。
准备三磷酸钠溶液（见配方）。
一旦完全溶解，使用孔径为 0.45 µm 的过滤器对两种溶液进行无菌过滤。
将三磷酸钠溶液缓慢加入 100 mM 氯化钙溶液中，搅拌 2 分钟。
以最大速度离心溶液 60 分钟。
倒掉上清液并称重沉淀。将适量的 nHA 湿重添加到 bioink 中。
将 nHA (2:1:2)（用于血管生物墨水）或 Laponite（6:3:1）（用于骨诱导生物墨水）（w/w）添加到海藻酸甲基纤维素混合物中，并使用无菌搅拌棒和搅拌器混合到溶液中板 2-3 小时。例如，对于每 5 克藻酸盐，添加 5 克 nHA 或 0.83 克合成锂皂石。
使用通过鲁尔锁连接的双注射器方法，用 VEGF (100 ng/ml) 或 BMP-2 (10 µg/ml) 加载 bioinks，并用 60 mM 硫酸钙溶液以 7 的 av/v 比进行预交联:3（见图 2）。在打印前让 bioink 交联 30 分钟。

图 2. 双注射器交联方法示意图

植入物的3D打印过程
将活塞放入 5cc 桶中，并使用鲁尔锁将每个生物墨水（血管或骨诱导）加载到活塞中。
将每个桶放在 3D 打印机的两个水凝胶头中。
PCL的打印参数列于表2中。

表 2. 使用 RegenHU 生物打印机在 PCL 框架内打印 bioinks 的打印参数

通过操作打印机的 G 代码（见补充文件），在室温下将每个水凝胶 z-stack 到 PCL 框架中以生成以下实验组：（1）VEGF Gradient ，血管生物墨水装载 500 ng/ml植入物中心的 VEGF 和外围的基础生物墨水；(2) BMP-2 梯度，骨诱导生物墨水在植入物外围（2 微克/构建体）加载 10 µg/ml BMP-2，中心生物墨水基础；(3)复合物 (VEGF+BMP-2) ，外围的骨诱导生物墨水，中心的血管生物墨水（参见 Freeman等人，2020 年的图 3A ），参见图 3。

图 3. 每组的 bioink 图案示意图和最终植入物的 Marco 图像

使用无菌镊子在装有 100 mM 氯化钙溶液的浴培养皿中再次交联印后构造，并允许进一步交联 1 分钟。
必须立即使用结构；如果被植入，则应在手术当天早上打印结构。

数据分析

所有体内分析的描述都可以在原始出版物中找到（Freeman等，2020）。使用以下变量进行统计： (i) 当有两组和一个时间点时，进行标准的双尾t检验；(ii) 当有两个以上的组和一个时间点时，进行单向方差分析（ANOVA）；(iii) 当有两个以上的组和多个时间点时，进行双向方差分析。所有分析均使用 GraphPad 进行。对于所有比较，显着性水平为P ≤ 0.05。

食谱

3.5% RGD γ-辐照海藻酸盐溶液
将 RGD γ 辐照的藻酸盐溶解在由高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)、10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素和 100 g/ml 链霉素组成的生长培养基中，使最终浓度为 3.5% (w/v) 藻酸盐。
100 mM 氯化钙溶液
将 0.735 克 CaCl 2混合到 50 毫升无菌水中。
涡旋并放置在旋转器上溶解。
60 mM 硫酸钙溶液
将0.408g CaSO 4混入50ml无菌水中（注意此溶液不能完全溶解，每次使用前需直接混合）。
三磷酸钠溶液
混合 1.135 毫克 Na 3 PO 4·将 12H 2 O、10 毫克 NaOH 颗粒和 100 微升 Darvan 加入 50 毫升无菌超纯水中。

致谢

本出版物源自欧洲研究委员会 (ERC) 的研究资助，资助号为 647004 和爱尔兰研究委员会 (GOIPD/2016/324)。该协议改编自之前的出版物“3D 生物打印时空定义的生长因子模式，以严格控制组织再生。” 发表于《科学进展 2020》（Freeman等人，2020 年）。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

Cunniffe, GM, O'Brien, FJ, Partap, S., Levingstone, TJ, Stanton, KT 和 Dickson, GR (2010)。使用新型分散剂辅助沉淀法合成和表征纳米相羟基磷灰石。J Biomed Mater Res A 95(4): 1142-1149。
Freeman, FE, Pitacco, P., van Dommelen, LHA, Nulty, J., Browe, DC, Shin, JY, Alsberg, E. 和 Kelly, DJ (2020)。3D 生物打印时空定义的生长因子模式，以严格控制组织再生。Sci Adv 6(33)：eabb5093。
版权所有 © 2021 作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。 1