材料和试剂

MultiGuard Barrier 移液器吸头 1-20 和 1-200 μl（Sorenson BioScience，目录号：30550T）
Nunc TM细胞培养处理的多盘（6孔）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：140675）
Nunc TM细胞培养皿 Delta 表面处理（10 厘米无菌皿）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：150350）
反应管，1.5 ml，带帽，刻度和书写区（Greiner Bio-One，目录号：616201）
Fisherbrand TM一次性使用无菌注射器 3 ml，（Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：14955457）
0.45 μm 注射器过滤器，醋酸纤维素（STARLAB，目录号：E4780-1453）
移液盆 (50 ml)，通用
96孔白板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：136101）
微管（1.5 毫升、0.5 毫升），通用
薄壁 PCR 微管 (0.2 ml)，通用
HEK 293T/17 细胞（ATCC，目录号：CRL-11268）
亚克隆效率大肠杆菌DH5α细胞（Invitrogen，目录号：18265017）
质粒
尖峰质粒：pCAGGS-SARS-CoV 尖峰（CFAR，目录号：100976）
慢病毒载体表达萤火虫荧光素酶：pCSFLW（或pCSGW对于GFP PV）（卡内尔等人，2015。）
第二代慢病毒包装构建质粒：p8.91（表达gag、pol和rev）（Carnell等，2015）
宿主细胞进入受体 ACE2 表达质粒：pCDNA3.1+-ACE2（Simmons等，2004）
冠状病毒尖峰（S）蛋白引发 TMPRSS2 表达质粒：pCAGGS-TMPRSS2（Bertram等人，2010）
注意：有关上述质粒的信息可以在 Temperton 等人中找到。(2005)和 Carnell 等人。(2015)。VPU 提供的质粒。
Dulbecco 改良的 Eagle 培养基（DMEM），含有 4.5 g/L 葡萄糖（Pan-Biotech，目录号：P04-04510），补充有 10% 胎牛血清（FBS）（Pan-Biotech，目录号：P40-37500）和 1%青霉素/链霉素（P/S）（Pan Biotech，目录号：P06-07100）
Gibco 减少血清培养基 Opti-MEM ® （Thermo Fisher Scientific，目录号：51985034）
FuGENE ® HD 转染试剂，1 ml（Promega，目录号：E2311）
不含钙和镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Pan-Biotech，目录号：P04-36500）
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红（Pan-Biotech，目录号：P10-040100）
可以中和SARS-CoV-2 PV的阳性对照抗体（Research Reagent for Anti-SARS-CoV-2 Ab）（NIBSC，代码：20/130，国际上有售）
COVID-19人类恢复期血浆板（NIBSC，目录号：20/118）
可以中和 SARS-CoV-2 PV 的单克隆抗体（天然抗原，目录号：MAB12443 和 MAB12444）
Bright Glo TM荧光素酶测定系统（Promega，目录号：E2650）
低表面张力聚丙烯 1.5 ml 微管（Simport，目录号：T330-7LST）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS；Pan Biotech，目录号：P04-361000）
尖峰质粒：pCAGGS-SARS-CoV 尖峰（CFAR，目录号：100976）
真核表达载体受体质粒：pcDNA3.1、pI.18、pCAGGS（Carnell等，2015）
Anza酶试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：IVGN3006）
无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0582）
QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen，目录号：28104）
QIAquick Gel Extraction kit（Qiagen，目录号：28704）
Tris Acetate EDTA（TAE）缓冲液（50×浓缩液；Thermo Fisher Scientific，目录号：B49）
超纯琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：16500100）
SYBR Safe DNA凝胶染料（Invitrogen，目录号：S33102）
GeneRuler 1 kb DNA Ladder（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM0313）
Luria Broth（LB）和LB琼脂粉（Sigma-Aldrich，目录号：L3022和L2897）
DreamTaq Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，目录号：K1081）
Monarch 质粒小量制备试剂盒（New England Biolabs，目录号：T1010S）或替代品

设备

II 类生物安全柜（Thermo Fisher Scientific、Thermo Scientific TM 、型号：MSC-Advantage TM ）
水浴或培养箱，通用
移液器（Gilson，型号：PIPETMAN ® Classic、P2、P20、P200 和 P1000 或同等产品）
多道移液器（Glison，型号：PIPETMAN L Multichannel P12 20-200 μl 或同等产品）
Fisherbrand TM无菌聚苯乙烯一次性血清移液管 5 ml 和 10 ml 1/10 ml，无菌，堵塞，单独包装（Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：1367610H 和 1367610J）
便携式吸取急救® XP吸器（德拉蒙德科学公司，目录号：4-000-101或同等学历）
涡流混合器，速度可调（SciQuip，型号：SP2260-VM）
Galaxy MiniStar 迷你离心机（VWR，型号：C1413V-230）
可选：BIO-RAD TC20 TM自动细胞计数器（Bio-Rad Laboratories，目录号：1450102EDU）或 FastRead 102 一次性 10 室计数网格，带有一体式丙烯酸、光学透明、盖玻片（Immune Systems，目录号：BVS100）
平板离心机（ELMI，型号：SkyLine CM-6MT）
GloMax ® Navigator 微孔板光度计（Promega，型号：GloMax ® Navigator）
FreeZone 2.5 L 冷冻干燥机（LabConCo，目录号：7670520）
样品干燥室（LabConCo，目录号：7318700）
旋转叶片真空泵 117（LabConCo，目录号：7739402）
塑料微管架（Thermo Fisher Scientific，目录号：8850）
热湿度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：11536973）
水浴或加热块，通用
微波炉，通用
电源组，通用
凝胶电泳槽，通用
微量离心机（Thermo Fisher Scientific、Sorvall TM Legend TM ）
UV透射仪（Uvitech/Sigma，目录号：Z363677）
凝胶成像系统，通用
Nanodrop 2000 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-2000）
干式 37°C 培养箱，通用
摇晃 37°C 培养箱，通用
Thermocycler（Techne，型号：Prime，目录号：5PRIMEG/02）

软件

PC或Mac Excel表格（Microsoft ® ）
的GraphPad Prism ® （格拉夫派得软件）

程序

通过质粒共转染 293T 细胞（4-5 天）生产 SARS-CoV-2 PV
注意：所有步骤都应在 II 类生物安全柜中进行，以避免污染。
第 1 天：293T/17 细胞应以在转染时（第 2 天）达到 70-90% 汇合率的比例传代培养到 6 孔板中。通常每孔接种 4 × 10 5 个细胞将达到这种融合水平。单元格外观的示例如图 2 所示。

图 2. 用质粒转染 HEK293T/17 细胞之前预期的汇合示例

第 2 天：应使用水浴或培养箱将DMEM/10% FBS/1% P/S 和 Opti-MEM ®预热至 37°C。
为将用于转染的 6 孔板的每个孔准备两个标记的无菌 1.5 ml 微量离心管（管 1 和管 2）。
添加以下质粒构建体（总体积为 15 µl）用于转染至管 1：
pCAGGS-SARS-CoV-2 或 pCAGGS-SARS-CoV-2 (D614G) 峰值：450 ng。
p8.91-慢病毒载体：500 ng。
pCSFLW：750 纳克。
注意：每个质粒的体积由其浓度决定。
将 100 µl Opti-MEM ®添加到质粒 DNA 混合物（管 1）中。
将 100 µl Opti-MEM ®和 FuGENEHD 添加到管 2。
孵育步骤：在室温 (RT) 下轻轻轻弹和孵育 5 分钟，将两个管混合。
孵育后，将管 2 中的 Opti-MEM ® /FuGeneHD 溶液移入管 1 中的 Opti-MEM ® /DNA 溶液中。
孵育步骤：将试管在室温下孵育 20 分钟，同时每 3-4 分钟轻轻轻弹试管混合。
在培养转染混合物时，应去除 293T/17 细胞上的培养基，并在每孔中加入 2 ml 新鲜预热的 DMEM/10% FBS/1% P/S。此时必须将培养基缓慢添加到孔的一侧，以避免分离贴壁细胞单层。
孵育 20 分钟后，将 DNA/Opti-MEM ® /FuGeneHD 溶液滴加到 293T/17 细胞上（在 6 孔板的一个孔中），方法是在孔的整个表面积中逐滴加入。轻轻旋转 6 孔板，以确保试剂混合物均匀分散。
孵育步骤：将板在 37°C、5% CO 2 中孵育44-52 小时。在我们手中，这个范围内的孵化时间导致等效的最终 PV 生产相对发光单位 (RLU) 滴度。
过夜孵育（第 3 天）后，应小心去除细胞上的培养基，并加入 2 ml 新鲜 DMEM/10% FBS/1% P/S。再次，将培养基缓慢添加到孔的一侧，以避免细胞脱离。
第 4 天：使用 3 ml 无菌注射器收集含有病毒假型颗粒的上清液，随后通过注射器驱动的 0.45 µm 过滤器过滤到微量离心机或 Falcon 管中。
将所有过滤的上清液储存在 -80°C 直至下游使用。建议将上清液分装储存，以避免可能影响病毒 RLU 滴度的多次冻融循环。
可选步骤（第 4 天）：可以将 2 ml 新鲜培养基添加到细胞中，以便在 18-24 小时后（第 5 天）通过进一步添加 DMEM/10% FBS/1% P/S 进行第二次收获。在这种情况下，在初始 PV 收集（上面的步骤 14）时必须格外小心，以避免通过用无菌注射器将细胞吸入孔的一侧而损坏细胞单层。我们观察到，第一次收获后健康状况不佳的细胞会导致第二次收获时 PV 生产 RLU 滴度显着降低。
注意：可以按照上述步骤创建对照假型病毒，但省略 pCAGGS-SARS-CoV 尖峰结构。这会产生不表达病毒表面糖蛋白的颗粒（Delta S PV 控制）。

用于滴定和中和试验的靶细胞的制备（1 天）
注：SARS-CoV-2 病毒宿主细胞进入取决于受体 ACE2 和丝氨酸蛋白酶 TMPRSS2 进行 S 蛋白启动（霍夫曼n等，2020）。HEK293T/17 用 ACE2 和 TMPRSS2 质粒转染，用作 SARS-CoV-2 PV 进入的最佳靶细胞。因此，无论是否计划进行 PV 滴定或中和试验，都必须预转染细胞。
HEK 293T/17 细胞应以在转染时达到 70-90% 汇合率的比例接种到 10 cm 细胞培养皿中。通常接种 2 × 10 6 个细胞/板并在 37°C 下孵育过夜将达到这种融合水平。
DMEM/10% FBS/1% P/S 和 Opti-MEM ®应使用水浴或培养箱预热至 37°C。
为每个用于转染的细胞培养皿准备一个无菌的 1.5 ml 微量离心管。
添加以下质粒构建体（在分子生物学级水中的总体积为 15 µl）用于转染（DNA 混合物）：
pCDNA3.1+-ACE2 细胞进入受体：2 µg
pCAGGS-TMPRSS2 丝氨酸蛋白酶：150 ng
注意：所需的质粒量由事先优化确定。
将 100 µl Opti-MEM ®添加到质粒 DNA 混合物中。
孵育步骤：通过轻轻轻弹混合管并在室温下孵育 5 分钟。
孵育后，将 9 µl FuGENE ® HD 直接加入 Opti-MEM ® /DNA 溶液管表面下方。
通过轻轻轻弹管混合。
孵育步骤：将试管在室温下孵育 20 分钟，同时每 3-4 分钟轻轻轻弹试管混合。
在培养转染混合物时，应去除 293T/17 细胞上的培养基，并在每道菜中加入 10 ml 新鲜 DMEM/10% FBS/1% P/S。此时必须将培养基缓慢添加到孔的一侧，以避免分离贴壁细胞单层。
孵育 20 分钟后，将 DNA/Opti-MEM ® / FuGENE ® HD 溶液滴加到 293T/17 细胞的整个培养皿的整个表面积上。轻轻旋转 10 cm 细胞培养皿，以确保试剂混合物均匀分散。
孵育步骤：在 37°C、5% CO 2下孵育板过夜（16-24 小时）。在我们手中，这个孵育时间导致细胞进入受体 (ACE2/TMPRSS2) 充分过度表达，用于 SARS-CoV-2 PV 进入。

用于计算相对光单位 (RLU)/ml 的 SARS-CoV-2 PV 滴定
笔记：
滴定包括将报告基因（在这种情况下是萤火虫荧光素酶，但可以使用 GFP）转导到由病毒假型（SARS-CoV-2 尖峰）上表达的病毒糖蛋白介导的靶细胞中。在滴定前 24 小时用 ACE2 和 TMPRSS2 转染靶细胞。ACE2/TMPRSS2 的转染效率在多个操作员和不同实验室之间始终可重现；在极少数转染不理想的情况下，PV 滴度急剧下降，导致结果无法使用。
通过包含“仅细胞”和“Delta S”（无 Spike 质粒）列来提供滴定控制。可以通过带有水疱性口炎病毒 G 蛋白 (VSV-G) 的 PV 提供转导的阳性对照，该蛋白利用无处不在的受体，在所有测试的细胞系中产生高 RLU 滴度。

在 96 孔白板中，将 50 µl DMEM/10% FBS/1% P/S 添加到“仅细胞”对照的整个列中（参见图 3，第 9-11 列）。
从 B 行到 H 行添加 50 µl DMEM/10% FBS/1% P/S，它们将包含 PV 或 Delta S 控制病毒。
将 100 µl SARS-CoV-2 假型病毒上清液添加到 A 行（不包括仅细胞控制列）的每个孔中，并将 100 µl Delta S 添加到第 12 列（见图 3）。

图 3. 用于假型滴定的 96 孔板设置。连续稀释步骤显示向 A 行的每个孔中添加 100 µl 假型病毒上清液，并从该孔中稀释 50 µl 到 B 行。该过程持续到板的末端（H 行），此时最后 50 µl 被丢弃。Delta S 控件以红色表示（第 12 列），仅单元格控件以蓝色表示（第 9-11 列）。每个稀释系列（板）可以使用一套移液器吸头。

在 12 通道移液器的帮助下，从 A 排含有病毒的孔中取出 50 µl，并在其下方的所有孔中进行两倍系列稀释。
在每个稀释步骤中，通过上下移液混合至少五次，注意不要产生气泡。
完成连续稀释后，应丢弃每列最后孔中的最后 50 µl。
注意：此时，每个孔应仅包含 50 µl PV 上清液（A 行）或与 DMEM 混合并稀释（B 行到 H 行）。
准备一盘易感靶细胞（表达 ACE2 和 TMPRSS2 的 HEK 293T/17 用于 SARS-CoV-2 PV）：
从板上取出培养基。
用 2 ml PBS 在培养皿的一侧清洗盘子两次，以避免细胞脱离并丢弃。
向板中加入 2 ml 胰蛋白酶，然后将板放入培养箱中直至细胞分离（约 5 分钟）。
细胞分离后，向板中加入 6 ml DMEM/10% FBS/1% P/S 以淬灭胰蛋白酶活性并轻轻重悬细胞。
使用 TC20 TM自动细胞计数器或计数室载玻片对细胞进行计数，并在每孔中加入 1 × 10 4细胞，总体积为 50 µl。
如果孔的侧面有可见的液滴，则将板以 500 rpm 的速度离心 1 分钟。
在 37°C 5% CO 2下孵育板 48 小时。
使用 Bright Glo TM荧光素酶检测系统在 GloMax ® Navigator 微孔板发光计（或等效物）上读取板，方法是从所有孔中取出培养基并加入 25 µl 1:1 混合的 PBS:Bright Glo TM荧光素酶检测试剂。
数据分析
来自光度计的 RLU 读数乘以每个孔的稀释系数（20×、40×、80×、160×、320×、640×、1,280×、2,560×）得到 RLU/ml。所有 8 个 RLU/ml 值的平均值用作滴定步骤中为该列报告的最终值。应观察到 RLU 值和 PV 稀释之间的线性关系，每 1:2 稀释后值下降 50%。在乘法之前应注意检查这种线性关系，因为这本身会导致计算错误的生产滴度（表 1）。

表 1. SARS-CoV-2 PV 滴定数据分析和 RLU/ml 计算。RLU 值（上图）相乘，得出每个稀释点（下图）的 RLU/ml 值。然后从所有八个稀释点计算平均值/平均值（表示为 RLU/ml）。必须注意观察稀释因子（X 因子）和 RLU 之间的线性关系，否则乘法会导致 RLU/ml 值膨胀。分析Excel软件（微软执行® ）。对于 SARS-CoV-2 PV ，当靶细胞中同时存在 ACE2 和 TMPRSS2 时（第 8 列），本实验中的最佳生产滴度（3.1 × 10 8 RLU/ml）就实现了。

结果（图 4）

图 4. SARS-CoV-2 PV（和 D614G 变体）的生产以及与 SARS-CoV（Temperton等，2005）和 MERS-CoV（Grehan等，2015）的比较。显示 MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2 和 SARS-CoV-2 (D614G) 的 RLU/ml 生产滴度。SARS-CoV、SARS-CoV-2 和 SARS-CoV-2 PV 在 293T/ACE2/TMPRSS2 细胞上滴定，MERS-CoV PV 在 Huh7 细胞上滴定（Grehan等，2015）。或者，可以在已用 DPP4 质粒预转染的 293T 细胞上滴定 MERS-CoV-2 PV。

基于假型的中和试验 (pMN)
注意：pMN 是通过针对 SARS-CoV-2 S 糖蛋白的抗体（或抑制剂）抑制 PV 介导的转导。
在多道移液器的帮助下，在 96 孔白板中，将 50 µl DMEM/10% FBS/1% P/S 添加到 B 行到 H 行，第 1-12 列。
将已知量的抗体（例如，5 µl 恢复期血清或 10 µg/ml 的 mAb）加入 A 行第 2-10 列的孔中，总体积为 100 µl DMEM/10% FBS/1% P/S。将已知量（例如5 µl）的阳性和阴性抗血清添加到 A11 和 A12 孔中作为对照。
从 A 排孔中取出 50 µl，并在其下方的所有孔中进行两倍系列稀释。
在每个稀释步骤中，使用多通道移液器上下移液混合 5-10 次，注意不要产生气泡。
完成连续稀释后，应丢弃每列最后孔中的最后 50 µl。
注意：此时，每孔应含有 50 µl 混合 DMEM 和抗体/抑制剂的系列稀释液。
将板以 500 rpm 的速度离心 1 分钟，以确保孔壁上没有抑制剂或液体。
使用从滴定中获得的数据（表 1），计算稀释 SARS-CoV-2 PV 以在 50 µl 中获得 1 × 10 6 RLU所需的 DMEM 量，总体积为 5 ml。例如，当 RLU/ml 为 1 × 10 8 时，1 ml PV 应与 4 ml DMEM 混合。
使用多通道移液器将这种稀释的 PV 溶液混合在移液器盆中，并将 50 µl 等分到板上的每个孔中，孔 A6-A12（仅细胞控制）除外。A1-A6 将用作仅 PV 控制。
以 500 rpm 的速度离心板 1 分钟，以确保孔壁上没有病毒。这对于避免下游数据中的病毒峰值至关重要。
在 37°C 5% CO 2下将平板孵育 1 小时，让抗体/抑制剂有时间结合 SARS-CoV-2 糖蛋白。
准备一盘易感靶细胞（用于 SARS-CoV-2 PV 的 HEK 293T/17），优先在 24 小时前用 ACE2 和 TMPRSS2 转染：
从板上取出培养基。
用 2 ml PBS 在培养皿的一侧清洗盘子两次，以避免细胞脱离并丢弃。
向板中加入 2 ml 胰蛋白酶，然后将板放入培养箱中直至细胞分离。
细胞分离后，向板中加入 6 ml DMEM/10% FBS/1% P/S 以淬灭胰蛋白酶活性并轻轻重悬细胞。
使用 TC20 TM自动细胞计数器或计数室载玻片对细胞进行计数，并在每孔中加入 1 × 10 4细胞，总体积为 50 µl。
在 37°C 5% CO 2下孵育板 48-72 小时。
使用 Bright Glo TM荧光素酶检测系统在 GloMax ® Navigator 微孔板发光计（或等效物）上读取板，方法是从所有孔中取出培养基并加入 25 µl 1:1 混合的 PBS:Bright Glo TM荧光素酶检测试剂。
根据光度计提供的原始数据，使用我们小组先前优化的协议计算半数最大抑制浓度 (IC50) 中和抗体滴度，该协议目前由 NIBSC 和其他利益相关者使用（Ferrara 和 Temperton，2018 年）。
结果如图 5 所示。

图 5.使用来自 NIBSC 的参考血浆面板或中和来自天然抗原的 mAb 中和进入靶细胞（表达 ACE2 和 TMPRSS2 的 HEK 293T/17）的 SARS-CoV-2 PV。顶部面板：条形图显示在三个不同实验室运行的恢复期血浆面板的 IC50。中间面板：三个不同实验室中运行的血浆面板的 IC50 数据。下图：SARS-CoV-2 假型（天然抗原 MAB12443 和 MAB12444）的 mAb 中和。

SARS-CoV-2 PV在不同温度下的储存
该协议允许模拟不同的温度条件和从实验室到实验室的运输持续时间以进行协作研究。英国到英国的发货时间通常<24小时，英国到欧盟的发货时间<72小时。对于可能超过 72小时的国际目的地货件，建议使用干冰运输或冻干。
滴定前将八份 100 µl SARS-CoV-2 PV（如上制备）在不同的储存温度下放置 24 小时或 72 小时（每份两份保存在室温、+4°C、-20°C 或 - 80°C）（结果见图 6）。
24小时后，在 96 孔白板的 A 排孔中加入四份（每个不同的储存温度各一份）进行滴定。有关如何进行滴定，请参见程序 C。
72小时后，将剩余的四等分在不同温度下添加到 96 孔白板的 A 行井中进行滴定。有关如何进行滴定，请参见程序 C。

图 6. SARS-CoV-2 PV 在不同实验室温度下的短期储存。PV在室温、+4°C、-20°C 和 -80°C 下储存24 或 72小时，然后滴定。保持在 -80°C 的 PV 等分试样作为滴定实验的阳性对照。-80°C 通常用于 PV 的长期储存。

SARS-CoV-2 PV 的冻干
我们之前已经表明，表面具有流感、丝状病毒或狂犬病病毒糖蛋白的慢病毒假型可以冻干以进行长期储存和运输（Mather等，2014）。这种方法同样适用于冠状病毒假型。
将蔗糖溶解在 DPBS 中，制成 1 M 冷冻保护剂溶液。注射器通过 0.45 µm 过滤器消毒。
使用无菌注射器针头（允许蒸汽在样品冷冻干燥过程中逸出）生产一批带有单孔穿孔的分离式标准微管盖。
在低保留微管中将 100 µl 高滴度 SARS-CoV-2 PV 添加到 100 µl 冷冻保护剂中。涡旋混合 5 秒。
将低滞留管盖打开，更换为穿孔盖。
将样品放在塑料架中，放入 -80°C 冰箱中至少 1 小时。
打开冷冻干燥机的电源，然后打开真空泵。
按下冷冻干燥机上的 MAN 按钮
当温度达到-50°C 时，将样品架放在上腔室并关闭阀门。
按下 VACUUM 按钮并等到一系列橙色灯亮起，直到最后的绿灯亮起（通常为 0.035 mBar/3.5 Pa）。离开过夜（16-20 小时）。
注意：样品在冻干过程中不应起泡或向上移动微管（见图 7）。
缓慢打开顶部阀门，使腔室压力与大气压力相等。
关闭 VACUUM，然后关闭 MAN 按钮，最后关闭真空泵和冷冻干燥机的电源。
取回样品，取下穿孔的盖子，并用原始盖子关闭微管
储存在冰箱中（-80°C 或 -20°C）。对于其他条件下的稳定性测试，可以使用温度/湿度计进行监控。

图 7. 样品干燥室内冻干的 SARS-CoV-2 PV 颗粒

冻干后立即滴定重建的 SARS-CoV-2 PV 并在中和试验中使用
如上所述（程序 F）冻干 SARS-CoV-2 PV。
通过添加 100 μl DPBS 或完全细胞培养基来立即重构冻干沉淀，以比较重构溶液在滴定中的影响。
推荐步骤：在涡旋混合器的帮助下充分混合，并在进一步应用之前在室温下孵育 10 分钟，以确保颗粒完全重新悬浮。
使用重组的等分试样按上述（程序 C）进行滴定。
使用冻干和重组的 SARS-CoV-2 颗粒（在这种情况下，选择 DMEM 作为重组溶液）执行上述 pMN（程序 D）。
结果（表 2、图 8、图 9）

表 2. 在 DPBS 或完全细胞培养基 (DMEM) 中重建的冻干 SARS-CoV-2 PV 的滴度比较。将病毒滴度与其非冻干对应物 (CTRL) 进行比较。SARS-CoV-2 PV滴定数据的分析和RLU/ml的计算如表1所示。
注意：考虑冷冻保护剂（蔗糖）的细胞毒性作用。因此，在计算平均值（最终 RLU/ml）时不考虑冻干样品的前 4 个稀释点。

图 8. 与非冻干对应物 (CTRL) 相比，在 DPBS 或 DMEM 中重建的冻干 SARS-CoV-2 PV 的 RLU/ml 生产滴度。

图 9. 使用来自 NIBSC 的参考血浆面板中和 SARS-CoV-2 病毒假型。顶部面板：等离子体面板的 IC50 数据。下图：SARS-CoV-2 PV 的血浆中和。通过使用冻干和重组的 SARS-CoV-2 PV 获得的这些结果与图 5（VPU Kent）相当，其中使用了非冻干 PV。注意：在将 PV 添加到假型病毒中和试验 (PVNA) 之前，将含有冷冻保护剂的重组颗粒稀释（作为正常程序）。因此，没有遇到细胞毒性。对六分之四的原始 NIBSC 等离子面板进行了中和测试。

替换 pCAGGS 中的 SARS-CoV-S 野生型盒或将 SARS-CoV-2-S 野生型盒亚克隆到替代骨架质粒中（适用于新的 Spike 变体或冠状病毒）
根据制造商的说明，使用适当的酶分别限制性消化供体 (2 µg) 和受体质粒 (1 µg)（切割 S 基因的任一侧，但不在内部）。对于前者，使用 Anza kit Red Buffer（带有凝胶加载染料）；对于后者，两者都使用标准缓冲液和无核酸酶水。
倒入 50 ml 1% TAE Ultrapure 琼脂糖凝胶，当微波凝胶混合物冷却至 ~50°C 时，加入 50 µl SYBR Safe。
将供体质粒消化（和 DNA 阶梯）加载到凝胶上，并在 80 V 下运行 1 小时。
将凝胶放在透射仪上（70% 强度设置）以可视化 DNA，并使用干净的手术刀仔细切除 Spike 基因凝胶片段。
根据制造商的说明，使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒纯化基因。在无核酸酶的水中洗脱。
根据制造商的说明，使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化受体质粒。在无核酸酶的水中洗脱。
通过 Nanodrop 测量纯化的受体质粒和 Spike 基因片段的浓度
根据制造商的说明，使用 50 ng 受体质粒和 1:3 摩尔比的 S 基因 DNA 进行 Anza 结扎反应。
根据制造商的说明，使用 LB 肉汤作为培养基，将结扎转化为亚克隆效率大肠杆菌细胞。
制备含有适当抗生素（即氨苄青霉素，Sigma-Aldrich 1,000×100 mg/ml 溶液目录号 A5354）的LB 琼脂平板。
将每 100 µl 转化细胞培养物铺在氨苄青霉素琼脂平板上。在 37°C 下孵育过夜。
将离散菌落（图 10）挑选到新氨苄青霉素板上的网格上。37°C 孵育过夜。

图 10. 离散细菌菌落图片

从每个菌落中挑选细胞到单独的 0.2 ml 微管中，放入 50 µl 无核酸酶水中。在热循环仪中在 94°C 下裂解细胞 3 分钟。
使用针对特定受体载体的臂的适当 PCR 引物筛选每个菌落裂解物中的质粒 DNA 是否存在 S 基因插入。使用 5 µl 裂解液、12.5 µl PCR Master Mix、7.5 µl 无核酸酶水。典型的热循环仪程序：94°C 3 分钟，然后 [94°C 1 分钟、50°C 1 分钟、72°C 2 分钟]、72°C 5 分钟的 25 个循环。
如上所述在琼脂糖凝胶上运行。使用凝胶成像系统拍摄凝胶并识别带有 S 基因插入片段 (~3.75 kbp) 的阳性克隆。
用来自网格的阳性克隆细胞接种 5 ml LB-Amp 肉汤培养物。在 37°C 振荡培养箱中孵育过夜。
使用小量制备试剂盒纯化 S 基因质粒克隆 DNA。
使用商业服务（例如 Eurofins）进行序列验证。
经验证后，新的 SARS-CoV-S 质粒可以纳入上述 PV 生产协议（程序 A）。

结论
概述的协议为生成高滴度病毒假型颗粒提供了一种快速且一致的方法，该颗粒表达 SARS-CoV-2 刺突蛋白，适用于进一步的下游研发应用。获得的生产滴度与 SARS-CoV 和 MERS-CoV 获得的滴度相同（图 4）。
使用人恢复期血浆和 mAb 有效敲低（中和）SARS-CoV-2 PV 进入靶细胞，证明了疫苗免疫原性和 mAb/抗病毒筛选的潜在效用。使用现成的试剂应有助于提高实验室内和实验室间的重现性，如图 6 所示。这些假型可以储存在实验室温度范围内（图 6），并且可以冻干以长期储存且易于使用全球分布（图7）。假型系统的即插即用特性使得将 Spike 盒式磁带更换为 SARS-CoV-2 的新变种 Spike 或实际上用于另一种冠状病毒变得简单。希望这套协议将促进假型技术的广泛采用，用于针对人类和动物关注的新兴冠状病毒的疫苗和治疗研发。

致谢

感谢我的校长 Susan Barker 教授以及位于 Medway 的肯特大学和格林威治大学允许 VPU 在英国第一次封锁期间保持运行。还要感谢 Philippe De Wilde 教授（前肯特大学研究与创新副校长）对 VPU 基础设施和物流的慷慨支持。这项研究由 MRC (MC_PC_19060) 和 MRC/NIHR (MC_PC_20016) HICC：COVID19 财团的体液免疫相关性资助。该协议源自我们的原始工作（Thompson等人，2020 年）。
作者贡献：概念化、NT、GC、AS 和 CT；方法论、CDG、AS、SS、DC、MM、MD、BA、BF、DH、MS、AS、ET、GC 和 NT；软件、CDG 和 MM；验证、GC、EB、GM 和 CT；形式分析，NT 和 CDG；调查、CDG、GC 和 NT；资源EB、GM、ET、GC；数据管理、NT 和 CDG；写作——原稿准备，NT；写作——审查和编辑、NT、CDG、DC、SS、GM、EB、EW；可视化、GC、CDG；监督、NT、SS、GC 和 CT；项目管理，北领地；资金收购，北领地。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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