材料和试剂

9孔玻璃板（默克，康宁，目录号：7220）
注射器过滤器 0.22 μm（默克，目录号：SLGV033R）
Parafilm（默克，Sigma-Aldrich，目录号：P7793）
150 mm 培养皿（Thermo Fisher，Nunc，目录号：150468）
微管（Sarstedt，目录号：72.706）
Vectashield（矢量，目录号：H-1000、H-1200）
载玻片（Superior Marienfeld，目录号：HSU-1000612）
22 × 22 mm 盖玻片（Superior Marienfeld，目录号：0102052）
盖玻片密封剂（Fisher Scientific，Biotium，目录号：NC0154994）
指甲油
飞股票：en-Gal4 （来自布卢明顿股票中心的#25752 或#30564）
苍蝇股票：UAS-X（X：感兴趣的基因。从股票中心获取或使用注射服务制作转基因苍蝇。）
飞行食品（小瓶/瓶）：来自布卢明顿库存中心的标准配方，所有成分和来自韩国 Hansol Tech 的塑料小瓶/瓶。
SiR-微管蛋白试剂盒（包含 SiR700 微管蛋白和维拉帕米。Spirochrome，目录号：SC002）
Demecolcine（Merch，Sigma-Aldrich，目录号：D7385）
Express Five SFM（Thermo Fisher，Gibco，目录号：10486025）
胰岛素（默克，Sigma-Aldrich，目录号：I6634）
EGS（Thermo Fisher，Thermo Scientific，目录号：21565）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
PBS 片剂（Thermo Fisher，Gibco，目录号：18912014）
Triton X-100（Samchun Chemical，目录号：00T0818）
正常山羊血清（Jackson Immunoresearch Laboratory，目录号：005-000-001）
乙醇（Merch，Sigma-Aldrich，目录号：1.00983）
乙酸（默克，目录号：695092）
解剖介质（见食谱）
0.5% PBT 溶液（见配方）
阻塞缓冲区（见食谱）
洗涤缓冲液（见配方）
飞行食物（见食谱）
库存解决方案（见配方）

设备

移液器（Thermo Fisher，Thermo Scientific，目录号：4641010N、4641050N、4641080N、4641100N）
LSM 710 共聚焦显微镜（蔡司，型号：LSM 710 ）
摇床（FinePCR，型号：SH30 ）
培养箱（JSR，型号：JSGI-150T）
镊子（FST，Dumont，目录号：11255-20）

软件

Zen 2009 精简版（蔡司，https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html）

程序

遗传杂交

从瓶子中收集en-Gal4处女雌性苍蝇。
从瓶子或小瓶中收集UAS-X雄性苍蝇。

使用二氧化碳垫在麻醉下收集处女和男性。

注意：不要将苍蝇放在二氧化碳垫上超过 5 分钟，因为这会降低苍蝇的生存能力和繁殖力。

将麻醉的苍蝇放在一个小瓶中（对于小规模实验，5 只处女 + 3-5 只雄性）或瓶子（对于大规模，30 只处女 + 10-20 只雄性）进行交配，如图 1 的步骤 1 所示。

图 1. 飞交叉方案。

在室温 (RT) 下孵育交配小瓶/瓶一天。
将小瓶/瓶子移至设定为 29°C 的培养箱（Gal4 活性随温度增加。温度为 29℃提供最大的 Gal4 活性和目标基因“X”的强烈过表达，但可能对生育力和生存力有害，具体取决于 Gal4 驱动程序和 UAS-X 菌株。因此，可以调节温度以实现基因 X 的最佳表达）。
等到3次龄幼虫后代携带烯-GAL4和UAS-X被发现（步骤2在图1）（它通常需要5到6天）。

地美可新原液制备

向 demecolcine 玻璃小瓶 (5 mg) 中加入 1.35 ml 纯乙醇制成 10 mM 原液。

注意：您还可以制作 1 mM 储备溶液以最大程度地减少移液错误。但是，如果您的目标细胞/组织对乙醇敏感，您可以使用更浓缩的形式（100 mM 原液）或使用 DMSO 作为溶剂。

将溶液分装并储存在 -20°C。

组织解剖

如果将等分的 Express Five SFM 培养基储存在冰箱中，请将其适应 RT。
将胰岛素补充剂添加到 Express Five SFM 培养基中，浓度为 6.2 μg/ml，制成解剖培养基。

注意：为防止污染，建议在实验室通风橱中添加胰岛素。

收集流浪3届龄幼虫用钳子。

注意：不要用镊子强力抓住幼虫。它可能会撕裂或压碎组织。

每个基因型至少收集 5-10 只幼虫。
将幼虫放入 9 孔玻璃盘中，用 200 μl PBS 清洗至少两次，以去除幼虫表面的任何残留物质。
彻底清洗后，将幼虫转移到 200 μl 在步骤 C2 中制备的解剖培养基中。

注意：不要将幼虫留在解剖介质中超过 30 分钟。

将单个幼虫放入含有 200 μl 解剖培养基的新 9 孔玻璃培养皿的每个孔中（不要将培养皿放在冰上）。
（关键步骤）用镊子解剖幼虫 [有关详细的视频协议，请参阅 Purves 和 Brachmann (2007)]。

用一把镊子轻轻抓住幼虫的嘴钩，并使用另一只镊子轻轻地将幼虫夹在距嘴钩 1/3 体长处（图 2B）。
握住身体轻轻拉动嘴钩（您也可以拉动身体而不是嘴钩）。
当幼虫被撕开时，去掉身体部分，并将成虫盘连接到嘴钩上。可以通过其透明的囊状形态识别成虫盘。眼天线盘附着在幼虫的大脑上。翼盘是成虫盘中最大的，具有特征性的形状，如图形摘要所示
使用两个镊子将剩余部分从里到外还原。

注意：此步骤需要谨慎进行。镊子的锋利尖端可能会撕裂或损坏成虫盘。

解剖速度应足够快，以尽量减少组织损伤或过度孵育，尤其是在标记未固定样品时。如果很难加快速度，请尽量保持所有样品的孵育时间相同。

图 2. 幼虫解剖图解。

(A) 幼虫器官示意图。(B) 成虫椎间盘解剖的图形解释。两个镊子用于抓取幼虫。通过拉动镊子将身体撕裂。成虫盘和大脑附着在幼虫前部的嘴钩上。可以通过将前部从里到外翻转来暴露成虫椎间盘。

解剖步骤完成后，将解剖的组织转移到含有 200 μl 新鲜解剖介质的新孔中。

活体未固定组织的样品制备和成像（方案 1）

将 SiR500-微管蛋白 (1:500) 和维拉帕米 (最终浓度: 10 μM) 添加到解剖组织中。

注意：SiR-微管蛋白和维拉帕米的稀释可能因组织而异。应针对不同的组织类型通过实验确定最佳稀释度。

在室温下搅拌 (100 rpm) 孵育组织 30 分钟。

注意：使用铝箔尽量减少孵化过程中的光照，如图 3 所示。

图 3. 带有 9 孔玻璃板的遮光室。

所述150毫米培养皿用铝箔和黑色的纸包装以使光屏蔽室。

用 200 μl 解剖介质简要清洗组织至少两次。
（关键步骤）在 200 μl 含有 50 μM demecolcine 的解剖培养基中，在室温下搅拌（100 rpm）进一步孵育组织 15 分钟。

注意：对于不含 demecolcine 的对照，解剖组织以相同的方式孵育，但不含 demecolcine。demecolcine 治疗的准确时机对于获得一致和有意义的结果至关重要。孵育时间可以根据目标基因或应用而变化，因此需要进行一些初步测试以确定最佳孵育时间。

孵化后，按如下方式安装翼盘。

将组织转移到 200 μl 含有 50 μM demecolcine 的解剖培养基中，无需任何洗涤步骤。

注意：以下解剖步骤应在 15 分钟内完成，以获得最佳效果。

将 10 μl 的解剖介质放在载玻片上。
(关键步骤) 使用镊子分离翼盘并将它们安装在载玻片上。
安装 3-5 个光盘后，使用盖玻片盖住样品。
用 Kimwipes 轻轻擦拭多余的介质，并用盖玻片密封剂密封。

注意：可以使用指甲油代替商业密封胶。

使用共聚焦显微镜进行实时成像。

在成像之前仔细选择翼盘。

应排除损坏或折叠的成虫盘以避免误解。

检查微管是否用 SiR-Tub 均匀标记，如图 4 所示。

使用 Cy5 滤波器组，因为 SiR-Tub 的光学特性如下：吸收波长 (λabs) - 652 nm，和荧光波长 (λfl) - 674 nm。
为了找到最佳成像条件（激光强度、成像速度、平均数），应避免慢速成像或高激光强度，以尽量减少光漂白。使用 LSM710，将激光设置为小于最大强度的 10%，成像速度为 1。
（可选）为了更详细的分析，可以使用时间序列图像采集。在这种情况下，每个翼盘的总成像时间不应超过 30 分钟。

图 4. SiR-Tub 翼成虫盘染色的最佳示例。

(A-A'') 未损坏和展开的翼盘，甚至带有 SiR-Tub 标签。答：前面。P：后面。比例尺：50 μm。GFP：绿色。SiR-Tub：白色。

固定组织的样品制备和成像（协议 2）

（关键步骤）在带有或不带有 50 μM demecolcine 的解剖介质中在室温下搅拌（100 rpm）孵育解剖组织（来自程序 C）75 分钟。

注意：对于没有 demecolcine 的对照，解剖的组织以相同的方式孵育，但没有 demecolcine。demecolcine 治疗的准确时机对于获得一致和有意义的结果至关重要。孵育时间可以根据目标基因或应用而变化，因此需要进行一些初步测试以确定最佳孵育时间。

孵育后，使用 200 μl 解剖介质轻轻移液至少两次，从组织中洗掉残留的 demecolcine。

注意：每次洗涤不应超过 1 分钟。

去除洗涤缓冲液后，用 100 μl 固定剂（PBS 中的 EGS 10 mM）在室温下搅拌 (100 rpm) 固定组织 10 分钟。

注意：强烈推荐使用 EGS 固定剂。其他固定剂，如 4% 多聚甲醛 (PFA) 或高碘酸-赖氨酸-多聚甲醛 (PLP) 在此应用中效果不佳。应在实验前优化固定时间和温度。

取出固定剂。

注意：室温下的 EGS 孵化可能会导致白色聚集体沉淀。然而，这种沉淀没有明显的负面影响，可以通过几个洗涤步骤清除。

用 200 μl PBS 短暂洗涤两次，总共 5 分钟，同时搅拌（100 rpm）。
去除 PBS 后，用 200 μl 0.5% PBT 溶液（参见配方）在室温下搅拌（100 rpm）孵育组织 30 分钟。

注意：此步骤用于组织透化。Triton X-100 的浓度可以针对不同的应用进行修改。

去除 0.5% PBT 溶液后，用 200 μl 封闭缓冲液（参见配方）在室温下搅拌（100 rpm）孵育组织 30 分钟。

注意：如果您不打算使用抗体进行免疫染色，请跳过 E8 到 E11 的步骤。

在封闭步骤中，在 100 μl 封闭缓冲液中制备所需浓度的一抗组。
封闭后，去除封闭缓冲液并将一抗添加到组织中。在 RT 搅拌下孵育 1 小时 (100 rpm)。

注意：您也可以在 4°C 下孵育过夜。

孵育后，去除一抗溶液并用 200 μl 洗涤缓冲液（参见配方）冲洗 1 分钟。然后，取出洗涤缓冲液。
在室温下搅拌 (100 rpm) 加入 200 μl 洗涤缓冲液 10 分钟。
取出洗涤缓冲液。重复此洗涤步骤至少 3 次。

在洗涤步骤中，在所需稀释度的 100 μl 封闭缓冲液中制备二抗组。
洗涤步骤后，去除洗涤缓冲液并将制备的二抗组添加到组织中。
将 SiR-Tub (1:500) 添加到组织中，并在室温下搅拌 (100 rpm) 孵育 1 小时。

注意：使用铝箔在孵化过程中尽量减少光照，如图 3 所示。

加入 200 μl 洗涤缓冲液，并在室温下搅拌孵育 10 分钟。
取出洗涤缓冲液。重复此洗涤步骤至少 3 次。
洗涤步骤后，用 200 μl PBS 替换洗涤缓冲液。
（关键步骤）孵化后，进行进一步的解剖和安装。

在载玻片上滴 10 μl 安装溶液 (Vectashield)。
使用镊子解剖翼盘并将它们安装在载玻片上。
安装 3-5 个光盘后，使用盖玻片盖住样品。
用 Kimwipes 轻轻擦拭多余的介质，并用盖玻片密封剂密封。

注意：可以使用指甲油代替商业密封胶。

使用共聚焦显微镜进行成像。

在共聚焦成像之前仔细选择成像盘。

应排除损坏或折叠的成虫盘以避免潜在的误解。
检查微管是否被 SiR-Tub 均匀染色，如图 4 所示。

根据 SiR-Tub 的光学特性使用 Cy5 过滤器集：λabs，652 nm 和 λfl，674 nm。
考虑到应避免慢速成像或高激光强度以尽量减少光漂白，找到最佳成像条件（激光强度、平均数和成像速度）。使用 LSM710，将激光设置为小于最大强度的 10%。
（可选）使用 Z 堆栈图像获取功能获取沿 z 轴的串行平面图像。

数据分析

微管调节剂在稳定微管方面可以发挥多种功能。一些关键因素的丢失或过度表达可能会导致微管模式的严重变化。相比之下，Mnat9 等一些调节因子的改变可能不会导致明显的缺陷，尽管它们在调节微管方面具有重要作用。因此，需要更灵敏的测定来识别这些因素。此处描述的测定使用敏化条件，并为识别参与微管稳定性的重要调控基因提供了强大的工具。

对于 SiR-Tub 标记的分析，基因 X 过表达的分析将作为一个简化的例子。该测定的目的是确定en-Gal4在后域中基因 X 的过度表达是否可以改变目标区域中 SiR-Tub 标记的模式, 在翼盘中不存在或存在 demecolcine 的情况下。下面，将讨论图形摘要和表 1 中概述的一些预期结果。

表 1. 实验组示例和可能的分析

控制：必须确认en> GFP控制翼盘后域中的 Sir-Tub 标记模式应与前域相似（图 4A'，图 4A）。然后，可以将后域中基因 X 过表达（en > 基因 X ）的影响与前控制域中的 SiR-Tub 模式进行比较。请注意，通过 demecolcine 处理显着减少了 SiR-Tub 标记（图 5B）。

图 5. 对照翼盘和 demecolcine 处理的翼盘中的 SiR-Tub 标记模式。(A-A''') 在没有 demecolcine 的情况下，用 SiR-Tub 标记的控制翼盘的连续 z 堆栈平面图像。(B-B''') SiR-Tub 标记在 demecolcine 处理的翼盘的连续图像中减弱。比例尺：100 μm。

SiR-Tub 标记无变化：(i) 无地美可辛的测定：如果后域中的 SiR-Tub 标记强度与前域相似，则基因 X 可能不足以促进微管形成或其稳定性（图 6）。然而，基因 X 在维持微管稳定性方面可能具有许可功能。因此，重要的是通过测试基因 X 功能丧失的影响来测试基因 X 是否是微管稳定性所必需的。 (ii) 用地美可辛测定：如果基因 X 没有促进微管稳定性的功能，则基因 X 过表达即使在 demecolcine 处理的致敏条件下，也不会改变后域中 SiR-Tub 标记的模式。

图 6. 未经 demecolcine 处理的翅膀成虫盘的 SiR-Tub 标记（固定样品）。

(A-A''') 使用en-Gal4的 Mnat9 在翼盘后部过表达的影响。(B-B''') 使用en-Gal4在翼盘后部击倒 Mnat9 的影响。前：A. 后：B. 比例尺：100 μm。DAPI：蓝色。GFP：绿色。SiR-管：白色。

通过基因 X 过表达增强的 SiR-Tub 标记：(i) 无地美可辛的测定：如果与前部对照区域相比，后部区域的 SiR-Tub 标记增强，则基因 X 可能是微管的正调节因子。(ii) 用地美可新测定。如果基因 X 过表达可以在没有 demecolcine 的情况下增强 SiR-Tub 标记，那么它也可能显示出对 demecolcine 处理的翼盘的 SiR-Tub 标记的强烈增强。然而，可能存在基因 X 过表达仅在致敏条件下才能增加 SiR-Tub 标记的情况。在这种情况下，当微管不稳定时，基因 X 过表达可能至关重要，尽管在正常微管条件下它可能不是必需的（图 7）。请注意，SiR-Tub 标记也可以通过击倒微管不稳定因素来增强。

图 7. Demecolcine 处理的翼成虫盘（固定样品）。

(A-A''') 控制。(B-B''') Mnat9 过表达抑制由 demecolcine 处理引起的微管解离。前：A，后：B。比例尺：100 μm。DAPI：蓝色。GFP：绿色。SiR-管：白色。

减少的 SiR-Tub 标记：(i) 不使用 demecolcine 的检测：如果基因 X 是破坏微管稳定的有效因素，其过度表达可能会导致后部区域的 SiR-Tub 标记减少。(ii) 用地美可新测定。这种微管去稳定剂可能会促进地美可辛的作用，导致 SiR-Tub 标记的进一步减少。当基因 X 过表达强烈减少 SiR-Tub 标记时，由于微管不稳定，翼盘的目标后部区域也可能显示形态异常。在后部细胞经历细胞死亡的严重情况下，可能难以解释减少的 SiR-Tub 标记的结果。在这种情况下，有必要在 p35 或 Diap1 等细胞死亡抑制剂存在的情况下检查 SiR-Tub 标记，以最大限度地减少细胞死亡的影响。虽然可以通过过度表达微管去稳定剂来减少 SiR-Tub 标记，但通过沉默微管稳定因子也可以发现类似的减少。因此，在分析基因功能时，最好同时测试功能获得和功能丧失的情况。

食谱

解剖介质

以 6.2 μg/ml 的浓度将胰岛素补充剂添加到 Express Five SFM 培养基中。
使用定轨振荡器充分混合并使用 0.22 μm 孔径注射器过滤器进行消毒（您不必调整培养基的 pH 值）。
以小体积 (~10 ml) 等分介质，并用封口膜密封管。
上述步骤应在实验室通风橱内进行，以避免污染。
将培养基储存在 4°C 并在一天内使用。
在解剖前将解剖介质放置在 RT 至少 15 分钟。

0.5% PBT溶液

将 1 ml Triton X-100 添加到 9 ml 无菌蒸馏水中，制成 10% Triton X-100 溶液。（由于 Triton X-100 非常粘稠，移液前用消毒剪刀将 1 毫升吸头底部 1 厘米剪掉。）
将 1 ml 10% Triton X-100 溶液添加到 19 ml 过滤的 1x PBS 溶液中并充分混合（溶液的工作 pH 值范围在 6.0 和 8.0 之间）。
使用前储存在室温下。该溶液可稳定数月。

阻塞缓冲区

在冰上解冻 1 ml 等分的冷冻正常山羊血清。
将 0.6 ml 10% Triton X-100 溶液和 1 ml 正常山羊血清添加到 18.4 ml 1× PBS 中。
将叠氮化钠添加到混合物中，最终浓度为 0.02%（溶液的工作 pH 值范围在 6.0 和 8.0 之间）。
充分混合并在 4°C 下储存（封闭缓冲液可以储存一个月而不会显着降低活性）。

飞行食品（BDSC 玉米粉食品，10 升）

水 9.2 升

酵母 160 克

豆粉 92 克

黄玉米面 670 克

琼脂 53 克

淡玉米糖浆 0.7 升

丙酸（> 99% 纯度，13.4 M）44.2 ml

布卢明顿果蝇股票中心网站 ( https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html ) 上描述了苍蝇食物的信息。

库存解决方案

Demecolcine：Demecolcine 粉末用纯乙醇溶解制成 1 mM 储备溶液。
胰岛素：由于胰岛素在中性 pH 值下显示出低溶解度，因此使用乙酸 (pH 2-3) 制备 2 mg/ml 储备溶液。将溶液等分、速冻并储存在-20°C。
叠氮化钠：为了制备 10% 的储备溶液，将 10 g 叠氮化钠溶解在 100 ml 蒸馏水中。

洗涤缓冲液

将 1.5 ml 10% Triton X-100 溶液添加到 48.5 ml 1× PBS 中。
充分混合并在室温下储存（您不必调整此缓冲液的 pH 值。洗涤缓冲液可以储存数月而不会显着损失活性）。

致谢

资金：这项研究得到了大韩民国教育、科学与技术部资助的韩国国家研究基金会的赠款 (NRF-2014K1A1A2042982 和 NRF-2017R1A2B3007516) 的支持。该协议改编自原始研究论文（Mok 和 Choi，2021）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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Bowne-Anderson, H.、Hibbel, A. 和 Howard, J.（2015 年）。微管生长和灾难的调节：统一理论和实验。趋势细胞生物学25(12): 769-779。
Brand, AH 和 Perrimon, N. (1993)。靶向基因表达作为改变细胞命运和产生显性表型的一种手段。发展118（2）：401-415。
Derivery, E., Seum, C., Daeden, A., Loubery, S., Holtzer, L., Julicher, F. 和 Gonzalez-Gaitan, M. (2015)。不对称细胞分裂期间纺锤体不对称导致的极化内体动力学。自然528（7581）：280-285。
Lukinavičius, G., Reymond, L., D'Este, E., Masharina, A., Gottfert, F., Ta, H., Guther, A., Fournier, M., Rizzo, S., Waldmann, H 。，等人。(2014)。用于细胞骨架活细胞成像的荧光探针。Nat 方法11(7): 731-733。
Lukinavičius, G., Mitronova, GY, Schnorrenberg, S., Butkevich, AN, Barthel, H., Belov, VN 和 Hell, SW (2018)。用于活细胞和组织中微管和气管的超分辨率显微镜的荧光染料和探针。化学科学9(13)：3324-3334。
Mok, JW 和 Choi, KW (2021)。N-乙酰转移酶在果蝇器官发育中对微管稳定性和 JNK 信号传导的新功能。 Proc Natl Acad Sci USA 118(4)。
Purves, DC 和 Brachmann, C. (2007)。解剖 3 龄果蝇幼虫的成虫盘。J Vis Exp (2): 140。