材料和试剂

材料
电穿孔比色皿，4-mm 间隙（Bio-Rad，目录号：1652088）
24孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：142475）
96孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：167008）
0.2 ml PCR 管（Thermo Fisher Scientific，目录号：N8010580）
1.5 毫升管（康宁，目录号：MCT-150-C）
15毫升管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339650）
10厘米培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：150466）

细胞
Caco-2 细胞（ATCC，目录号：HTB-37）
293T 细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
Stbl3感受态细胞（AlpaLife，目录号：KTSM110L）
EPI300感受态细胞（Lucigen，目录号：C300C105）

试剂
Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM；Gibco，目录号：C11965500BT）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200072）
胎牛血清（BIOVISTECH，目录号：SE100-011）
青霉素/链霉素，10,000 U/ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
DNA转染试剂Vigofect（Vigorous，目录号：T001）
pMD2G（Addgene，目录号：12259）
psPAX2（Addgene，目录号：12260）
Opti-MEM TM （Gibco，目录号：31985070）
5 kb DNA 标记（Takara，目录号：3428A）
15 kb DNA 标记（Takara，目录号：3582A）
的PrimeSTAR ®最大DNA聚合酶（Takara，目录号：R045）
的PrimeSTAR ® GXL DNA聚合酶（Takara，目录号：R050）
限制酶 BsaI（NEB，目录号：R0535L）
T4 DNA连接酶（NEB，目录号：M0202L）
mMESSAGE mMACHINE TM T7转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM1344）
EZNA ®质粒DNA Mini试剂盒I（欧米茄，目录号：D6943-02）
EZNA ®凝胶提取试剂盒（Omega，目录号：D2500-02）
苯酚：氯仿：异戊醇 25：24：1（pH 7.8；Solarbio，目录号：P1012）
ReverTra Ace ® qPCR RT 试剂盒（Toyobo，FSQ-101）
TRIzol TM Reagent（Thermo Fisher Scientific，目录号：15596018）
Ç opyControl TM诱导解（Lucigen，目录号：CCIS125）
聚凝胺（Sigma，目录号：TR-1003-G）
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（PBS；Corning，目录号：21-031-CVR）

设备

水浴（zhybioresources，目录号：SYG-1210）
离心机（Eppendorf，目录号：5406000291）
蓝光凝胶成像仪（Sangon Biotech，目录号：G500312）
NanoDrop TM One/Onec（Thermo Fisher Scientific，目录号：701-058108）
Gene Pulser Xcell 总电穿孔系统（Bio-Rad，目录号：1652660）
培养箱摇床（常州华谊，目录号：THZ-D）

程序

时间线：
携带 SARS-CoV-2 cDNA 片段的质粒的繁殖
步骤 1-2，化学转化（2 小时）和菌落筛选（过夜）。
第三步，质粒制备：1小时。
Caco-2-N和Caco-2-N intein细胞系的构建
步骤 1-2，慢病毒包装 (3) 和转导 (3 d)。
通过 PCR 制备 DNA 片段
步骤 1-3，PCR 扩增片段 AB（6 小时）、C、D 和 E（2-3 小时）。
步骤4、苯酚-氯仿抽提纯化PCR产物：1-2小时。
通过限制酶消化和体外连接产生基因组长度的 cDNA
步骤 1-2，片段 C、D 和 E 消化（5 小时）和纯化（1-2 小时）。
步骤 3，片段 C、D 和 E体外结扎：24 小时。
步骤4，CDE的PCR扩增（6小时）和纯化（1-2小时）。
步骤 5，片段 AB 和 CDE 消化：5 小时。
步骤 6，通过体外连接进行全长 cDNA 组装：48 小时。
通过体外转录 (IVT)生成病毒基因组长度的 RNA
步骤一，N基因的PCR扩增（1 h）和纯化（1-2 h）。
步骤 2-8，体外转录：1 天。
电穿孔和 trVLP 回收
步骤 1-4，电穿孔：2 小时。
步骤 5-10，trVLP 恢复：3-4 天。
用于验证 trVLP 的 GFP 基因的 RT-PCR
步骤 1，trVLP 感染（24 小时）和病毒 RNA 提取：1-2 小时。
步骤 2，RT-PCR 扩增 GFP 基因（1-2 小时）和琼脂糖电泳分析（30 分钟）。
通过 TCID 50 进行trVLP 滴定
步骤 1-5，trVLP 感染（24 小时）和 TCID 50计算（1-2 小时）。

携带 SARS-CoV-2 cDNA 片段的质粒的繁殖
质粒
SARS-CoV-2 GFP/ΔN（来自武汉-Hu-1 菌株。基因库：MN908947 的基因组被分为四个片段，分别命名为 AB 、C、D 和 E，每个片段都使用化学合成的 SARS以-CoV-2基因组为模板，将片段克隆到pCCI、pMV或pLVX载体中，得到四个质粒：pCCI-AB、pMV-C、pLVX-D和pLVX-E。SARS-CoV-将N端带有Flag标签的2N基因克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry中，得到pLVX-N-Flag-IRES-mCherry，然后用于产生慢病毒。用此转导的Caco-2细胞慢病毒 (Caco-2-N) 作为生产 SARs-CoV-2 trVLPs 的包装细胞系，因为 Caco-2-N 细胞通过提供 N in trans补充了 SARS-CoV-2 GFP/ΔN 基因组。同时， N 基因也在 212 个氨基酸（G212C）处发生突变并分裂成两部分。这两部分分别与内含肽元件 Npu-N 和 Npu-C（Zettler et al. , 2009）融合，定义为 N N -Int N和Int C -N C和进一步克隆入慢病毒载体，导致pLVX-Ñ Ñ -Int Ñ -IRES-mCherry的和pLVX -诠释Ç -N Ç -IRES-嘌呤霉素分别。这两个编码 N 蛋白 N 端或 C 端的质粒被一起转导以连接Caco-2 细胞中的全长N，以产生另一个包装细胞系 Caco-2-N intein 。
转型
对于每个质粒，在冰上解冻 EPI 300 或 Stbl3 感受态细胞（参见下面的“注释”）并向感受态细胞中加入 2 μl（约 10 ng）相应的质粒。通过轻敲管子混合并在冰上孵育 30 分钟。
注意：对于pMV 和 pLVX 衍生的质粒 —— 包括PMV-C，pLVX-d，pLVX-E，pLVX-N-FLAG-IRES-mCherry的，pLVX-N Ñ -Int Ñ -IRES-mCherry的，和pLVX -诠释Ç -N Ç -IRES-嘌呤霉素-使用Stbl3用于转化的感受态细胞。对于 pCCI 衍生的质粒 pCCI-AB，用于转化的 EPI300 感受态细胞。
将含有细胞和质粒混合物的管在 42°C 水浴中加热 90 秒，然后立即放回冰上孵育 2 分钟。
向管中加入 1 ml LB 培养基，并使用培养摇床在 37°C 下以 220 rpm 摇动 45 分钟以回收细胞。
恢复后，将 100 μl 细胞培养物铺在补充有适当抗生素的 LB 平板上（参见下面的“注释”），并在 37°C 下孵育过夜。
笔记：
为了选择用 pMV 和 pLVX 衍生质粒转化的 Stbl3 细菌，请使用补充有 50 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板。
对于选择用 pCCI-AB 转化的 EPI300 细菌，请使用补充有 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板。
携带SARS-CoV-2基因的质粒的制备
过夜孵育后，对于每块平板，挑出 2-3 个细菌菌落并接种 4 ml LB 并添加适当的抗生素（抗生素浓度与平板上的相同）。在 37°C 下以 220 rpm 摇动孵育过夜（12-16 小时）。
对于 pMV 和 pLVX 衍生的质粒，过夜培养可直接用于质粒制备。对于 pCCI-AB，细菌培养应进一步诱导如下：
将 1.5 ml 过夜培养物加入含有 13.5 ml LB的50 ml 烧瓶或管中，并辅以 12.5 μg/ml 氯霉素和 15 μl CopyControl TM Induction Solution（Lucigen，目录号：CCIS125），并以 220 rpm 摇动 5 小时在 37°C。
通过以 4,000 × g旋转5 分钟来离心细胞培养物。
丢弃上清液并尽可能多地去除残留液体。
按照制造商的说明，通过 Plasmid Mini Kit I (Omega) 使用细胞进行质粒提取。
在质粒提取的最后一步，向小型制备柱中加入 50 μl 去离子水并在室温下孵育 3 分钟，然后以 13,000 × g离心1 分钟以洗脱质粒。
使用 NanoDrop 确定质粒制备的浓度和质量。质粒可立即使用或储存在 -20°C 直至使用。

Caco-2-N和Caco-2-N intein细胞系的构建
慢病毒包装
按照此已发布的协议 (Tiscornia等人, 2006)制备水泡性口炎病毒 G 蛋白 (VSV-G) 假型慢病毒。简而言之，使用 VigoFect DNA 转染试剂与第三代包装质粒 pMD2G（目录号 12259；Addgene）、psPAX2（目录号 12260；Addgene）和转移载体 pLVX-N-Flag 瞬时共转染 HEK293T 细胞-IRES-mCherry。转染后 12 小时更换培养基，并在转染后 36、60 和 84 小时收集上清液。汇集所有上清液，通过 0.45-μm 过滤器，等分，并储存在 -80℃ 直到需要。
转导
感染前一天在24 孔板中接种1 × 10 5 Caco-2 细胞，以确保第二天融合度为 70-80%。
准备好转导后，取出细胞培养基，向孔中加入 1 ml 补充有 10 μg/ml聚凝胺的慢病毒，轻轻摇动板子混合。在 37°C、5% CO 2下孵育48 小时。
笔记：
为了生成 Caco-2-N 细胞系，慢病毒包装 pLVX-N-Flag-IRES-mCherry 用于转导。为了产生的Caco-2-N内含肽的细胞系，慢病毒包装pLVX -N Ñ -Int Ñ -IRES-mCherry的和pLVX -诠释Ç -N Ç -IRES-嘌呤霉素是混合（1：1）和用于转导Caco-2 细胞。
添加聚凝胺可提高转导效率。
作为转导效率的衡量标准，每天使用荧光显微镜监测 mCherry 信号。通常，在感染后 48 小时可以很容易地检测到 mCherry 信号。
在转导后 48 小时，检查 mCherry 信号并将转导的细胞传递到 6 孔板中，并在 37°C、5% CO 2下孵育。
再过 24 小时，检查 mCherry 信号和细胞密度，确保至少 90% 的细胞为 mCherry 阳性，收获的细胞可用作生产 trVLP 的包装细胞系。
注意：由于这些细胞未被选择，这些 Caco-2 衍生细胞系中的 N 基因可能会在多次传代后丢失，这会降低 trVLP 的包装效率。因此，根据需要重新转导 Caco-2-N 细胞系，以维持 N 基因表达水平。或者，如果 N 表达水平不够（mCherry 阳性细胞低于 90%）用于 trVLP 包装，则使用细胞分选器从构建的 Caco-2-N 细胞系中收获前 30% 的 mCherry 阳性细胞。

通过 PCR 生成 SARS-CoV-2 trVLP cDNA
PCR热循环程序中的模板、引物和DNA聚合酶列于表1中。本协议中使用的引物序列列于表 2 。

表 1. 生成特定 DNA 片段的 PCR 反应组件

表 2. 本协议中使用的引物

片段 AB 的扩增
按照制造商的说明，使用 PrimeSTAR ® GXL设置 50 μl PCR 反应。准备 400 μl 反应预混液并将其等分到 8 个0.2-ml PCR 管中（50 μl/管）。PCR反应的组分列于表3中。

表 3. 用于扩增片段 AB 的 PCR 反应

根据表 4 中显示的程序在热循环仪中孵育反应。

表 4. PCR 反应扩增片段 AB 的热循环程序

注意：通常，400 μl PCR 反应液中可回收 30-40 μg AB 片段。
通过凝胶电泳检查 PCR 产物。将 2 μl PCR 产物与 6×DNA 上样缓冲液混合，并将混合物上样到 1% 琼脂凝胶上（图 2A ）。

图 2.用于 trLVP 生成的 DNA 和 RNA 片段的琼脂糖凝胶电泳验证。(A) trVLPs 的基因组序列被分成四个片段，每个片段 PCR 扩增。每个片段的纯化PCR产物通过琼脂糖凝胶测定。(B) CDE 的 PCR 产物和全长 DNA (FL DNA) 的纯化连接产物。(C) SARS-CoV-2 N 基因 PCR 产物的琼脂糖凝胶分析。(D) 分别使用 FL DNA 基因组和 N 基因 PCR 产物作为模板，通过体外转录产生的病毒全长 RNA (FL-RNA) 和 (E) N 基因 mRNA 的琼脂糖凝胶分析。黑色箭头分别表示 FL RNA 和 N RNA。

片段 C、D 和 E 的扩增
根据 PrimeSTAR ® Max (Takara) 说明设置 50 μl PCR 反应。为每个片段准备 200 μl PCR 反应并将其等分到四个 0.2 ml PCR 管中，50 μl/管。PCR反应的成分列于表5中。

表 5. 用于扩增片段 C、D 和 E 的 PCR 反应

根据表 6 中所示的程序在热循环仪中孵育反应。

表 6. 片段 C、D 和 E 的 PCR 反应的热循环程序

注意：通常，每个片段大约可以从 200 μl PCR 反应液中回收 20 μg。
通过凝胶电泳检查 PCR 产物的质量。将 2 μl PCR 产物与 6×DNA 上样缓冲液混合，并将混合物上样到 1% 琼脂凝胶上（图 2A ）。
苯酚-氯仿抽提纯化 PCR 产物
将每个片段的 PCR 产物汇集到1.5 ml 管中，加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)，充分混合并在 4°C 下以 13,000 × g离心1 分钟。
将上层水相转移到新的 1.5 ml 管中，加入与水相体积相等的氯仿，充分混匀，4°C 下以 13,000 × g离心1 分钟。
吸取顶层到一个新的无核酸酶的1.5毫升试管中，并添加1/10个的3M乙酸钠（pH 5.2）的体积。然后以1:1的体积比加入异丙醇，充分混合并在-20°C孵育至少30分钟。
在 4°C 下以13,000 × g离心15 分钟以沉淀 DNA。
去除上清液，加入 1 ml 75% 乙醇洗涤沉淀，并在 4°C 下以 13,000 × g离心5 分钟。
完全去除残留液体，注意不要去除任何颗粒。
风干沉淀物直至不再可见并重悬于 100 μl 无核酸酶水中。
使用 NanoDrop 测量回收 DNA 的产量和质量。
通过凝胶电泳检查纯化 DNA 的质量 (图 2A )。

通过限制酶消化和体外连接产生基因组长度的 cDNA
片段 C、D 和 E 首先用 Bsa I 消化，然后用 T4 连接酶连接以创建 CDE 连接产物，用作 PCR 扩增的模板。接下来，片段 AB 和 CDE 的 PCR 产物用 BsaI 消化并连接以生成全长 SARS-CoV-2 cDNA。
片段 C、D 和 E 消化
为片段 C、D 和 E 设置 80 μl 消化反应，如表 7所示。片段 C 和 E 用 Bsa I 消化。

表 7. 片段 C、D 和 E 消化反应

在 37°C 下孵育片段 C、D 和 E 消化反应 5 小时或孵育过夜。
从琼脂糖凝胶中纯化消化的 DNA 片段
消化后，在每个反应管中加入 16 μl 6× DNA 上样缓冲液，充分混合，将混合物上样到 1% 琼脂糖凝胶上，180 V 运行 15 分钟。
使用蓝光凝胶成像仪可视化 DNA 片段。避免使用紫外线进行可视化，因为它会导致 DNA 损伤，从而导致下游 RNA 转录失败。
切割目标带（预期的 C、D 和 E 带的大小分别为 6,133 bp、4,168 bp 和 1,636 bp），并按照制造商的说明使用凝胶提取试剂盒 (Omega) 从凝胶中提取 DNA 片段.
在最后一步，将 30 μl 去离子水（在 65°C 下预热）添加到柱上并在 37°C 下孵育 5 分钟。
以 13,000 × g离心1 分钟以洗脱 DNA。
将 DNA 洗脱液重新加载到色谱柱上并重复步骤 D2d 和 D2e 以提高回收效率。
使用 NanoDrop 测量回收 DNA 的数量和质量。
注：回收效率约为 30%。
片段 C、D 和 E 的体外连接
根据表 8 中列出的组件设置 10 μl 连接反应。在该协议中，使用 BsaI 消化的片段的等摩尔浓度。

表 8. 片段 C、D 和 E 连接反应

将反应系统在 4°C 下孵育 24 小时。连接产物（未经纯化）用作扩增片段 CDE 的模板。
片段CDE的PCR扩增和纯化
使用步骤 D3b 中的连接产物作为模板建立 50 μl PCR 反应。准备 400 μl 反应并将其分装到 8 个 0.2-ml PCR 管（50 μl/管）中。组件如表 9所示。

表 9. 用于扩增片段 CDE 的 PCR 反应

根据表 10中所示的程序在热循环仪中孵育反应。

表 10. 片段 CDE PCR 扩增的热循环程序

如步骤 C4 所述，通过苯酚-氯仿提取纯化 PCR 产物。
注：从 400 μl PCR 反应液中可回收约 40 μg CDE 片段。
将 2 μl 加载到 1% 琼脂糖凝胶电泳上，以检查纯化 PCR 产物的质量，如图 2B所示。
使用 BsaI 消化 AB 和 CDE 片段
为片段 AB 和 CDE 设置 120 μl 消化反应，如表 11所示。

表 11. AB 和 CDE 片段的消化反应

在 37°C 下孵育消化反应 5 小时。
消化后，消化产物通过琼脂糖电泳分离，并使用步骤 D2 中所述的试剂盒通过凝胶提取回收。
在提取的最后一步，使用 100 μl 无核酸酶水进行洗脱。
AB 和 CDE 片段的体外连接
设置 100 μl 连接反应，使用等摩尔浓度的片段组装全长 cDNA。反应组分列于表12中。

表 12. 片段 AB 和 CDE 连接反应

在4°C 下孵育反应24 小时。
在连接反应中加入 1 μl T4 连接酶，混合均匀，继续在 4°C 下再孵育 24 小时。
如 C 部分所述，通过苯酚-氯仿提取纯化全长 cDNA 连接产物。在纯化的最后一步，将 DNA 沉淀溶解在 10 μl 无核酸酶水中。纯化后的 DNA 可立即使用或储存于 -20°C。
通过凝胶电泳确认产品的质量和大小，将 2 μl 纯化的连接产物加载到 1% 琼脂糖凝胶上（图 2B ）。

病毒基因组RNA的长度的产生通过在体外转录（IVT）
N基因DNA的制备。
在该协议中，N 基因 mRNA 与基因组长度的病毒 RNA 一起被电穿孔到 Caco-2-N 细胞中，以增加 trVLP 的产生。
根据 PrimeSTAR ® MAX 说明设置 50 μl PCR 反应。PCR反应组分见表13 。

表 13. 用于扩增 N 基因的 PCR 系统

按照表 14 中的程序在热循环仪中孵育反应。

表 14. N 基因 PCR 扩增的热循环程序

通过凝胶电泳检查 PCR 产物的质量。将 2 μl PCR 产物与 6×DNA 上样缓冲液混合，并将混合物上样到 1% 琼脂糖凝胶上（图 2C ）。
如步骤 C4 所述，通过苯酚-氯仿提取回收 N 基因 PCR 产物。在纯化的最后一步，将 DNA 沉淀溶解在 30 μl 无核酸酶水中。
按照表15 中所示的反应设置，使用 Thermo mMESSAGE mMACHINE T7 转录试剂盒设置 30 μl IVT 反应以生成全长病毒 RNA 和 N 基因 mRNA 。

表 15. 产生全长病毒 RNA 和 N 基因 mRNA 的 IVT 反应

在 32°C 下孵育 IVT 反应 5 小时。
向反应中加入 1 μl DNase，37°C 孵育 15 分钟以消化 DNA 模板。
按照 mMESSAGE mMACHINE ® T7 转录试剂盒中的制造商说明，使用氯化锂沉淀法回收病毒 RNA 和 N 基因 mRNA 。在沉淀的最后一步，将 RNA 沉淀溶解在 30 μl 无核酸酶水中。
使用 NanoDrop 测量 RNA 的浓度。通常，可以获得大约 30 μg 的病毒 RNA。
将 1 μg RNA 加载到 1% 琼脂糖凝胶上，以确定基因组长度的 RNA 和 N mRNA 的质量，如图 2D和2E 所示。
将 RNA 储存在 -80°C 或立即使用。

将基因组长度的病毒 RNA 和 N 基因 mRNA 电穿孔到 Caco-2-N 细胞中以生产 trVLP
在电穿孔前 2 天在10 厘米的培养皿中接种3 × 10 6 Caco-2-N 细胞，以确保有足够的细胞用于电穿孔。
电穿孔前准备以下试剂和设备：
将离心机冷却至 4°C。
在冰上预冷 DPBS、Opti-MEM 和4 毫米比色皿。
在 37°C 细胞培养箱中预热含有 10 ml 细胞培养基的 10 cm 培养皿。
收获 Caco-2-N 细胞
将 2 ml 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 添加到 10 厘米培养皿中的 Caco-2-N 细胞中，并在 37°C 下孵育约 8 分钟以分离细胞。
将 2 ml 细胞培养基添加到板中以停止消化并移液以产生单细胞悬浮液。
细胞预处理和电穿孔
使用血细胞计数器确定细胞数。
将含有 8 × 10 6细胞的适当体积的细胞悬液转移到15 ml 管中，并通过在 4°C 下以 500 × g 离心 5 分钟来沉淀细胞。
将沉淀重悬在 10 ml 预冷 DPBS 中，弃去上清液并洗涤细胞。
通过在 4°C 下以 500 × g离心5 分钟来沉淀细胞。
去除上清液并在 400 μl Opti-MEM 中重悬沉淀。
将 20 μg 基因组长度的病毒 RNA 和 10 μg N 基因 mRNA 添加到细胞悬液中，上下移液以充分混合。
将整个细胞混合物转移到预冷的 4 毫米比色皿中，将比色皿放入电穿孔室，使用 GenePulser 装置 (Bio-Rad) 施加单个脉冲（270 V，950 μF）。
电穿孔后，立即将电穿孔细胞吸入含有 10 ml 细胞培养基的预热 10 cm 培养皿中。轻轻摇动平板并在 37°C、5% CO 2下孵育。
每天使用荧光显微镜监测 GFP 信号。通常，GFP 信号可以在电穿孔后 12 小时观察到，如图 3A所示。
准备 Caco-2-N 细胞进行从头感染
在用生成的 trLVP从头感染前 24 小时，将1 × 10 5 Caco-2-N 细胞接种到 24孔板中，在 37°C、5% CO 2下孵育。
新发感染
电穿孔后 24 小时检查电穿孔细胞的 GFP 信号
从电穿孔细胞中收集 1 ml 上清液（包含 trVLPs）（这将被视为 P0）。
将上清液以 500 × g离心5 分钟以沉淀细胞碎片。
确保上面步骤 F5 中播种的 24 孔板中 Caco-2-N 细胞的汇合度约为 70-80%。取出细胞培养基，将收集的含有 trVLPs 的上清液加入孔中，并在 37°C、5% CO 2下孵育。
每天监测从头感染细胞的 GFP 信号(图 3B )。通常，信号将在感染后 96 小时在整个孔中看到。
从从头感染的细胞，将含有trVLPs 4天后感染（定义为P1病毒），离心机在500收获上清液×克在5分钟，4℃，并存储为1ml的等分试样-80 ℃下.
为了扩增病毒，将 50 μl P1 病毒加入 10 厘米培养皿中的 Caco-2-N 细胞（汇合率为 70-80%），并在 37°C、5% CO 2下孵育。
每天监测 GFP 信号并在感染后 48 小时收获上清液。在 4°C 下以 500 × g离心5 分钟。收集的病毒定义为 P2，可以在 -80°C 下以 1 ml 等分试样储存直至使用。

图 3. 感染 SARS-CoV-2 GFP/ΔN 的 Caco-2-N 细胞的荧光显微镜分析。(A) Caco-2-N 细胞在电穿孔后 12 小时的 GFP 和明场图像。(B) 收集电穿孔后 24 小时 Caco-2-N 细胞的上清液，用于感染 24 孔板中的初始 Caco-2-N 细胞。显示了感染后 24 小时和 48 小时的 GFP 和明场图像。

SARS-CoV-2 GFP/ΔN trVLPs 中GFP 基因的 RT-PCR 验证
为了确保 SARS-CoV-2 GFP/ΔN trVLPs 中存在 GFP 基因，从被 trVLPs 感染的 Caco-2-N 细胞中提取病毒 RNA，并通过 RT-PCR 进行分析（图 4A ）。为此目的设计了位于 ORF8 的 N 区和 3'UTR 两侧的引物对。
trVLP RNA提取
在感染前一天在 24 孔板中制备 Caco-2-N 细胞，以便感染时的汇合度为 70-80%。
通过向孔中加入 50 μl trVLP 并在 37°C、5% CO 2下孵育来感染细胞。
感染后 48 小时，弃去 trLVP 感染细胞的上清液，向孔中加入 500 μl TRIzol 试剂，上下吹打制成单细胞悬液。
将得到的细胞裂解液转移到新的 1.5 ml 管中，加入 100 μl 氯仿，涡旋管或用手剧烈摇晃。在 4°C 下以 13,000 × g离心15 分钟。
小心地将 200 μl 上层水相（含 RNA）转移到新的 1.5 ml 管中，与 200 μl 异丙醇充分混合，在 -20°C 下孵育 30 分钟。
在 4°C 下以 13,000 × g离心15 分钟并去除上清液。
加入 600 μl 75% 乙醇轻轻洗涤沉淀，并在 4°C 下以 13,000 × g离心3 分钟。
去除上清液并在 4°C 下以 13,000 × g离心管1 分钟。
取出上清液并打开管盖，彻底干燥沉淀。
加入 20 μl RNase-free H 2 O 溶解 RNA 样品。
逆转录聚合酶链反应
根据制造商的说明，使用 Toyobo 逆转录试剂盒和提供的随机引物从提取的病毒 RNA 中生成 cDNA。总共获得 10 μl cDNA，然后可以立即使用或储存在 -20°C 直至使用。
将 40 μl H 2 O添加到 10 μl cDNA 中并充分混合。
按照表 16 中所示的设置，使用 cDNA 作为模板设置 50 μl PCR 反应。

表 16. 用于验证 GFP 基因的 PCR 反应

按照表 17 中所示的程序在热循环仪中孵育反应。

表 17. GFP 基因 PCR 验证的热循环程序

通过凝胶电泳检查 PCR 产物的大小。将 5 μl PCR 产物与 6×DNA 上样缓冲液混合，并将混合物上样到 1% 琼脂糖凝胶上（图 4B）。

图 4. trLVPs 中 GFP 基因的 RT-PCR 分析。在 Caco-2-N 细胞中产生的 SARS-CoV-2 GFP/ΔN trVLPs 中 GFP 基因的 RT-PCR 验证。显示了预期的 DNA 大小 (A) 和 PCR 产物 (B) 的琼脂糖电泳分析。

使用组织培养感染剂量 50% (TCID 50 ) 终点稀释测定法进行 trVLP 滴定
使用 TCID 50终点方法（Lindenbach，2009）量化 trVLP 感染性。
感染前一天，在 96 孔板中将1.5 × 10 4 Caco-2-N 细胞接种在 100 μl DMEM 中，每孔补充有 10% FBS。
解冻储存在 -80°C 下的 trVLP，并使用含有 10% FBS 的 DMEM（12 μl trVLP 样品到 108 μl DMEM 与 10% FBS）按 1:10 连续稀释。通过涡旋混合 5 秒并取出 12 μl 以添加到另一等分的 108 μl DMEM 和 10% FBS（1:100 稀释）。重复稀释系列到 108 倍稀释。
将 100 μl 稀释的病毒粒子添加到现有培养基顶部的 96 孔板中接种的 Caco-2-N 细胞的每个孔中（使每孔总共 200 μl），每个稀释度重复八次。轻轻摇动平板，使病毒粒子充分混合，并在 37°C、5% CO 2下孵育。
检查感染后 24 小时每口井的 GFP 信号，并计算每个浓度的 GFP 阳性井数。
按照 Reed & Muench 方法 (Reed and Muench, 1938) 使用下述方程计算 TCID 50 ：
TCID 50 /ml = (1 (ml)/原始 trVLPs 的体积 (ml)) × 10^ (成比例的距离 + 较低的稀释度)。
成比例的距离 =（下一个高于 50% 的百分比 - 50%）/（下一个高于 50% 的百分比 - 下一个低于 50% 的百分比）。
较低的稀释度 = 10^（在接下来的位置稀释度高于 50%）。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金 (32041005 to QD)、北京市自然科学基金 (M21001 to QD) 和清华大学创业基金 (53332101319 to QD) 的资助。XJ由中国博士后科学基金（2021TQ0182）和水木清华学者计划资助。
使用该协议的原始研究文章是 Ju等人。(2021)。

利益争夺

QD 和 XJ 已就 SARS-CoV-2 反式互补系统的使用及其在抗 SARS-CoV-2 药物筛选中的应用提交了专利申请。

参考

Almazan, F.、Sola, I.、Zuniga, S.、Marquez-Jurado, S.、Morales, L.、Becares, M. 和 Enjuanes, L.（2014 年）。冠状病毒反向遗传系统：传染性克隆和复制子。病毒研究189：262-270。
Hou, YJ, Okuda, K., Edwards, CE, Martinez, DR, Asakura, T., Dinnon, KH, 3rd, Kato, T., Lee, RE, Yount, BL, Mascenik, TM等。(2020)。SARS-CoV-2 反向遗传学揭示了呼吸道中的可变感染梯度。单元格182(2)：429-446 e414。
Ju, X., Zhu, Y., Wang, Y., Li, J., Zhang, J., Gong, M., Ren, W., Li, S., Zhong, J., Zhang, L., Zhang, QC、Zhang, R. 和 Ding, Q. (2021)。一种模拟 SARS-CoV-2 生命周期的新型细胞培养系统。PLoS 病原体17(3)：e1009439。
林登巴赫，BD (2009)。测量细胞培养和体内产生的 HCV 感染性。方法 Mol Biol 510：329-336。
Nie, J., Li, Q., Wu, J., Zhao, C., Hao, H., Liu, H., Zhang, L., Nie, L., Qin, H., Wang, M.,等。(2020)。通过基于假型病毒的测定法定量 SARS-CoV-2 中和抗体。Nat Protoc 15(11): 3699-3715。
Reed, L. 和 Muench, H. (1938)。一种估算 50% 终点的简单方法。Amer J Hyg 27：709-716。
罗马, BN 和 Avon, J. (2020)。Covid-19 大流行期间的药物评估。N Engl J Med 382(24): 2282-2284。
Stevens, AJ, Sekar, G., Shah, NH, Mostafavi, AZ, Cowburn, D. 和 Muir, TW (2017)。具有扩展蛋白质工程应用的混杂分裂内含肽。Proc Natl Acad Sci USA 114(32): 8538-8543。
Tiscornia, G.、Singer, O. 和 Verma, IM (2006)。慢病毒载体的生产和纯化。国家议定书 1(1): 241-245。
Wang, C.、Horby, PW、Hayden, FG 和 Gao, GF (2020)。一场引起全球健康关注的新型冠状病毒爆发。柳叶刀395（10223）：470-473。
Xie, X., Lokugamage, KG, Zhang, X., Vu, MN, Muruato, AE, Menachery, VD 和 Shi, PY (2021)。使用反向遗传系统设计 SARS-CoV-2。国家议定书 16：1761-1784。
Xie, X., Muruato, A., Lokugamage, KG, Narayanan, K., Zhang, X., Zou, J., Liu, J., Schindewolf, C., Bopp, NE, Aguilar, PV等。(2020)。SARS-CoV-2 的传染性 cDNA 克隆。细胞宿主微生物27(5)：841-848 e843。
Zettler, J.、Schutz, V. 和 Mootz, HD (2009)。自然分裂的 Npu DnaE intein 在蛋白质反式剪接反应中表现出异常高的速率。FEBS Lett 583(5): 909-914。
张，X.，刘，Y.，刘，J.，贝利，AL，普兰特，KS，普兰特，JA，邹，J.，夏，H.，BOPP，NE，阿吉拉尔，PV，等人。(2021a)。SARS-CoV-2 的反式互补系统在没有毒力的情况下重现了真实的病毒复制。单元格184(8)：2229-2238 e2213。
Zhang, Y.、Song, W.、Chen, S.、Yuan, Z. 和 Yi, Z. (2021b)。SARS-CoV-2 的细菌人工染色体 (BAC) 载体非传染性复制子。抗病毒研究185：104974。

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