材料和试剂

材料

1. 100 mm × 15 mm 未经 TC 处理的细菌培养皿（Corning Falcon，目录号：351029）

2. 100 mm TC 处理的细胞培养皿（Corning Falcon，目录号：353003）

3. 6孔透明平底TC处理的多孔细胞培养板（Corning Falcon，目录号：353046）

4. T75 TC烧瓶（CytoOne，目录号：CC7682-4875）

5. T225 TC烧瓶（Corning，目录号：431081）

6. 50 mL离心管，锥形底部，无菌（Corning Falcon，目录号：352098）

7. 15 mL离心管，锥形底部，无菌（Corning Falcon，目录号：352099）

8. 低温小瓶，1.2 mL（Corning，目录号：430487）

9. 30μm monofil尼龙无菌过滤器（Sysmex，目录号：04-004-2326）

10. 真空过滤烧瓶，500 mL，0.22 μ m 膜（Cellpro，目录号：V50022）

11. 注射器过滤器，0.2 μ m（Fisherbrand，目录号：09-720-3）

12. 1.5 mL Eppendorf管（Sarstedt，目录号：72.690.301）

13. DBA/2J AC173/GrsrJ 小鼠胚胎干细胞（The Jackson Laboratory，目录号：000671C02）

14. 抗嘌呤霉素的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养细胞（Cell Biolabs，目录号：CBA-312）

15. L细胞，克隆929（ATCC，目录号：CCL-1）

16. 细胞提升器（Corning，目录号：3008）

17. 500 mL 无菌玻璃器皿瓶（克利夫兰诊所玻璃器皿芯）

试剂

1. 0.05% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA（Caisson Labs，目录号：T019-100GM）

2. A型明胶（MP，目录号：901771）

3. DMEM 基础粉末，由 Cleveland Clinic Media Preparation Core（Caisson Labs，目录号：DMP08）用无菌水重构

4. DMEM (1 × );高葡萄糖;无 L-过剩； w/丙酮酸钠；不含酚红（Cleveland Clinic 培养基制备核心，目录号：21-500CUST）

5. 无菌 PBS（Cleveland Clinic Media Preparation Core，目录号：121-500）

6. 胎牛血清（Millipore Sigma，目录号：F4135-500ML）

7. 青霉素-G（Sigma-Aldrich，目录号：P3032-100MU）

8. 链霉素（Gibco，目录号：11860-038）

9. MEM非必需氨基酸（Caisson Labs，目录号：NAL03-100ml）

10. 2-巯基乙醇，55 mM 在 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（Gibco，目录号：21985023）中

11. 二甲基亚砜（DMSO）（Alfa Aesar，目录号：42780）

12. 福尔马林，缓冲，10％（Fisher Chemical，目录号：SF100-4）

13. 重组小鼠 IL-3 蛋白（R&D Systems，目录号：403-ML-010）

14. 重组小鼠 LIF 蛋白（Millipore Sigma，目录号：ESG1107）

15. PD0325901，MEK抑制剂（Reprocell/Stemgent，目录号：04-0006-02）

16. CHIR99021，GSK-3β抑制剂（Reprocell/Stemgent，目录号：04-0004-02）

17. 丝裂霉素C（Tocris，目录号：3258）

18. APC-Cy7 抗小鼠 CD11c（BD Pharmingen，目录号：561241）

19. PE大鼠抗小鼠Ly-6C（BD Pharmingen，目录号：560592）

20. FITC 大鼠抗小鼠 Ly-6G（BD Pharmingen，目录号：561105）

21. PE-CF594 大鼠抗 CD11b（BD Horizon，目录号：562317）

22. 小鼠 FcR 阻滞剂（Stemcell Technologies，目录号：18720）

23. DiI（ThermoFisher，目录号：D3911）

24. DAPI 封固剂（Vectashield 目录号：H-1200）

解决方案和媒体

1. 0.1% 明胶涂层溶液（见配方）

2. 基础细胞培养基（见配方）

3. MEF 细胞冷冻培养基（见配方）

4. 小鼠 ES 细胞培养基础培养基（见配方）

5. 小鼠 ES 细胞培养基完全培养基（见配方）

6. 巨噬细胞分化培养基（见配方）

7. 巨噬细胞维持培养基（见配方）

设备

1. Forma 直接加热 CO ₂组织培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：310 系列）

2. 冷藏台式离心机（Kendro Sorvall Legend RT，目录号：75004377）

3. 超低温冰箱（Thermo Scientific，目录号：TSX60086D）

4. Mr. Frost 冷冻容器（Thermo Scientific，目录号：5100-0001）

5. 液氮储存（Taylor Wharton，型号：K 系列）

6. 冷冻微量离心机（Labnet Prism，目录号：C2500-R）

7. 可调速摇杆（Boekel Scientific，目录号：260350）

8. 细胞计数器（Beckman Coulter，Z2）

9. 流式细胞仪（BD LSR Fortessa）

10. 带有 CCD 相机（Q Imaging，型号：EXi Aqua Fast 1394b）的落射荧光显微镜（Olympus，型号：IX51）

软件

1. FlowJo（ BD 生物科学， FlowJo ^TMv10 .8）

2. Cell Sens Dimension 成像软件（Olympus，CS-DI）

程序

A. L 细胞条件培养基制备（M-CSF 来源）

1. 从液氮罐中取出一小瓶 L 细胞。将细胞置于 T75 TC 烧瓶中的 10 mL 基本细胞培养基中，并在 TC 培养箱中培养，直至约 80% 汇合。

2. 当培养物达到 80% 汇合时，用 10 mL 的 PBS 吸出上清液并冲洗细胞。如上所述对细胞进行胰蛋白酶处理。上下吸管混合物，悬浮成单个细胞。

3. 将分离的细胞转移到 15 mL 管中，并添加 8 mL 的基本细胞培养基。

4. 在五个 T-225 TC 烧瓶中加入 25 mL 的基本细胞培养基。然后在每个烧瓶中加入 1 mL 的分离细胞。在 TC 培养箱中培养直至约 80% 汇合（约 5 天）。

5. 在 50 mL 管中收集上清液并储存在 -80°C。用 25 mL 的新鲜基本细胞培养基补充 T-225 烧瓶，并在 2 天后收获培养基。重复此步骤，直到细胞开始从板上分离。

6. 累积 500 mL 后，解冻 L 细胞条件培养基，池化，过滤灭菌（0.2 μm）。直接使用，或在 45 mL 等分试样中重新冷冻，以用于巨噬细胞分化培养基 (MDM) 的制备。在一项特定研究中，我们通常会使用一大批 L 细胞条件培养基。但是，我们没有注意到显着的批次差异。

B. 饲养细胞制备（灭活小鼠胚胎成纤维细胞用于培养 ES 细胞以保持其多能性）

1. 用 4 mL 的 0.1% 明胶在溶液中涂上一个 T75 TC 烧瓶。摇动盘子以用明胶覆盖底面。使用前将烧瓶在 37°C 5% CO ₂培养箱（TC 培养箱）中培养至少 1 小时。使用前吸出 0.1% 明胶溶液（没有凝胶形成，明胶蛋白只是粘附在 TC 表面）。

2. 饲养细胞培养

a. 在 37°C 水浴中解冻一个 MEF 小瓶 (1 mL)。将解冻的细胞移入 15 mL 管中，并添加 2 mL 的基本细胞培养基。

b. 在室温下以 500 × g旋转细胞5 分钟。应在底部看到一个颗粒。

c. 弃去上清液，将颗粒均匀地重新悬浮在 10 mL 的基本细胞培养基中。

d. 将重新悬浮的 MEF 细胞添加到涂有明胶的烧瓶中。在 TC 培养箱中左右摇动盘子并培养。细胞在约 5 天内趋向于约 70% 的汇合。

3. 饲养细胞冷冻（当 MEF 细胞约 70% 汇合时）

a. 弃去上清液。用 10 mL 的无菌 PBS 冲洗细胞。

b. 在 TC 培养箱中用 4 mL 的胰蛋白酶-EDTA 分离细胞5 分钟。上下吸取混合物以悬浮成单个细胞。

c. 将分离的细胞转移到 15 mL 管中，加入 8 mL 基本细胞培养基以淬灭胰蛋白酶。在室温下以 500 × g旋转细胞5 分钟。应在底部看到一个颗粒。

d. 丢弃上清液并用 6 mL MEF 细胞冷冻培养基（用于在一个 T75 TC 烧瓶中培养）均匀地重新悬浮颗粒。将 1 mL 的细胞等分到每个 1.2 mL 冷冻小瓶中。将小瓶放入可控速率冷冻罐中，然后将罐转移到 -80°C 过夜。第二天将冷冻细胞转移到液氮罐中。

4. 饲养细胞失活（当 MEF 细胞约 70% 汇合时，大约 6 × 10 ^{6 个}细胞）

a. 将 1 mL 的 1 mg/mL 丝裂霉素 C 添加到 100 mL 的基本细胞培养基中，使最终浓度为 10 μ g/mL。

b. 在 T75 TC 烧瓶中检索 MEF 细胞。用 10 mL 的 PBS 吸出培养基并冲洗一次。将 20 mL 的 MEF 培养基与 10 μ g/mL 丝裂霉素 C 添加到烧瓶中。

c. TC 培养箱中孵育至少 2 小时。

d. 用 15 mL 的 PBS 吸出培养基并冲洗细胞 3 次，以去除丝裂霉素 C。在6 mL 的 MEF 细胞冷冻培养基中进行胰蛋白酶化、旋转和重新悬浮细胞。将 1 mL 的细胞等分到每个 1.2 mL 冷冻小瓶中。每个小瓶中应该有大约 1 × 10 ^{6 个}细胞。将小瓶标记为灭活的 MEF 细胞 (IMEF) 以避免错误。如上所述冻结细胞。

5. 灭活的饲养细胞电镀（分化开始前约 7 天）

a. 如上所述，用 0.5 mL 的 0.1% 明胶涂抹新 6 孔 TC 板的每个孔。使用前吸出 0.1% 的明胶溶液。

b. 在 37°C 水浴中解冻一个 IMEF 小瓶。将解冻的细胞转移到 15 mL 管中，并加入 2 mL 的基本细胞培养基。

c. 在室温下将细胞旋转 500 × g 5 分钟。应在底部看到一个颗粒。

d. 在 12 mL 的基本细胞培养基中吸出上清液并重新悬浮细胞，用于一个 6 孔 TC 板。

e. 将重新悬浮的 IMEF 细胞添加到涂有明胶的 6 孔板（每孔 2 mL）中。在 TC 培养箱中左右摇动板并培养。 IMEF 细胞应在第二天出现约 50% 至 70% 的汇合（图 2A）。

图 2. 分化前后细胞的外观。

A.灭活的饲养细胞。 B. ES 细胞铺在饲养细胞上。 C. ES 细胞镀在涂有明胶的 TC 上。 D.细胞在第 2 阶段从电镀 EB 生长。 E.重新电镀到明胶涂层 TC 板上一天后悬浮的巨噬细胞祖细胞。 10 ×物镜，比例尺 = 100 μm。

C. 用于分化的小鼠 ES 细胞培养

1. 在 37 °C水浴中解冻一小瓶 ES 细胞（约1.5 × 10 ^{6 个}细胞）。将解冻的细胞转移到 15 mL 管中，加入 3 mL 的小鼠 ES 细胞培养基础培养基。在室温下旋转 500 × g 5 分钟。

2. 吸出上清液。在 12 mL 小鼠 ES 细胞培养完全培养基中重新悬浮颗粒。

3. 从培养箱中取出涂有 6 孔板的 IMEF 细胞。吸出基础细胞培养基。

4. 在每口井中加入 2 mL 的重悬 ES 细胞。左右摇摆。 TC 培养箱中的培养。 3 天后，细胞应该是 ~70% 汇合（图 2B，每孔大约1.5 × 10 ^{6 个}细胞）。

D. 小鼠 ES 细胞分化为胚状体 (EB)（第 1 阶段，第 0 天）

1. 去除 IMEF 细胞（重要：少量 IMEF 细胞会破坏分化）

a. 将 ES 细胞/IMEF 细胞共培养的 6 孔板的一口胰蛋白酶化（每孔 0.5 mL），并重新悬浮到 12 mL 的小鼠 ES 细胞培养完全培养基中。将 2 mL 板放入涂有明胶的 6 孔 TC 板（无饲养细胞，6 倍稀释）的每个孔中。在没有 IMEF 饲养细胞的情况下，ES 在五天内达到约 60% 至 70% 的融合（图 2C）。

b. 当约 70% 汇合时，从培养箱中取出 6 孔板中的 ES 细胞。吸出培养基，用 PBS 冲洗一次（每孔 2 mL），然后在TC 培养箱中胰蛋白酶（0.5 mL/孔）5 分钟。旋转细胞并吸出上清液。

c. 将细胞颗粒重新悬浮在 12 mL 的小鼠 ES 细胞培养基础培养基中，并以 2 mL/孔的速度在另一个涂有明胶的 6 孔 TC 板上板。在 TC 培养箱中用残留的饲养细胞孵育 ES 细胞 30 分钟。

d. 收获上清液以获得纯 ES 细胞（残留的 IMEF 细胞粘附在底部）。在 5 mL 的 PBS 中旋转并重新悬浮颗粒。

2. 用细胞计数器计数细胞。计算每次分化获得 6 × 10 ^{5 个细胞所需的悬浮液体积。}

3. 将 6 × 10 ⁵ES 细胞添加到 15 mL 管中，将细胞颗粒化，然后在 10 mL 的 MDM 中重新悬浮。

4. 将细胞悬浮液转移到 100 mm 培养皿（无菌未经过 TC 处理的细菌学）中，该培养皿被指定为分化的第 0 天。将培养皿放在水平摇杆上，设置为每周期约 9 秒，位于TC 培养箱内。摇杆可防止可能的 EB 附着和合并。两天后应该可以看到漂浮在介质中的小 EB（图 3）。

5. 在第 4 天在培养皿中添加额外的 10 mL MDM，并将细胞保持在摇杆上。管理摇杆的倾斜角度以避免溢出。

图 3. ESDM 分化过程中的光学显微镜明场图像。

显示了不同日期的第 1-3 阶段（4 ×物镜，比例尺 = 200 μm）。阶段 1。多个单个 ES 细胞聚集为早期的 E B s。摇杆可防止 E B相互合并或附着在培养皿上，确保大球形 E B的独立发展。第 2 阶段。将 E B转移到涂有明胶的 TC 培养皿中，将细胞向外散开，直到汇合。第 3 阶段。由 EB 释放的巨噬细胞祖细胞被收获并铺在新的明胶涂层 TC 板上。附着的巨噬细胞祖细胞分裂和分化。

E. 在第 7 天（第 2 阶段）将大型 EB 与巨噬细胞祖细胞区分开来

1. 第 7 天，在TC 培养箱中用 4 mL 的 0.1% 明胶涂上 100 mm TC 盘 1 小时。使用前吸出明胶溶液。

2. 从摇杆中检索大型 EBbs 的第 1 阶段培养皿（图 3）。应该有 >100 个大球形 EB 漂浮在介质中。

3. 用 10 mL 移液器将所有浮动 EB 与原始介质一起轻轻转移到涂有明胶的 100 mm TC 盘中，以避免分离 EB。

4. 轻轻地左右摇晃盘子以均匀分布 EB。在不使用摇杆的情况下将第 2 阶段的培养皿放入TC 培养箱中，在任何后续步骤中都不会使用摇杆。第 7 天到第 14 天的培养。

5. EB 将在第 8 天附着在涂有明胶的盘子上。在第 8 天和第 12 天吸出培养基并用 10 mL 的 MDM 重新进料。在此阶段，贴壁细胞会从镀层 EB 中生长出来（图 2D 和 3）。

6. 第 14 天，培养皿底部应完全被生长的 EB 占据，没有空间让新释放的巨噬细胞祖细胞附着，促进巨噬细胞祖细胞漂浮在培养基中。

F. 在第 14 天和之后每三天收获巨噬细胞祖细胞，以分化为功能性 ESDM（第 3 阶段）

1. 从 TC 培养箱中检索第 2 阶段 TC 培养皿。应在培养基中看到漂浮的巨噬细胞祖细胞。

2. 在 15 mL 管的顶部放置一个 30 μm无菌过滤器。用 10 mL 移液器轻轻收集含有浮动巨噬细胞祖细胞的介质，然后将介质缓慢地应用到过滤器中进行重力过滤，以去除小 EB 和细胞簇。将过滤后的巨噬细胞祖细胞转移到新的明胶涂层 6 孔 TC 板中，每孔体积为 3 mL，以开始第 3 阶段培养。在第 2 阶段用 10 mL 的 MDM 重新进给 100 mm TC 盘，并将其返回 TC 培养箱。

3. 6 孔板中的第 3 阶段巨噬细胞祖细胞应在第二天附上（图 2E 和 3）。吸出培养基，用 PBS 轻轻清洗一次，然后用 2 mL 的 MDM 重新进料。附着的第 3 阶段巨噬细胞祖细胞在成熟的早期阶段不断分裂。每五天补充一次 MDM 介质。 ESDM 分化的成功可以在第 3 阶段电镀后 7 天简单筛选（通过乙酰化 LDL 摄取评估，如下所述），此时约 40% 的细胞显示巨噬细胞表型。

4. 如上所述，每三天继续收获第 2 阶段巨噬细胞祖细胞。收获可以持续长达七轮（第一次收获后约 21 天）。我们观察到不同收获之间的唯一区别是产量。前两次收获的产量较低，而后两次收获的巨噬细胞祖细胞数量较多。

5. 每五天每口井用 3 mL 的巨噬细胞维持培养基喂养成熟的 ESDM（第 3 阶段电镀 > 13 天）。成熟的 ESDM 在完全成熟后可保持健康长达 15 天。成熟的 ESDM 也可以使用胰蛋白酶和无菌细胞提升器分离以进行重新电镀。理想情况下，不同 ESDM 的比较应在同一收获中进行。然而，我们发现不同收获之间的比较结果没有显着差异。

数据分析

本节描述了对巨噬细胞功能和 ESDM 身份的评估。

A. DiI 染色乙酰化 LDL (Ac-LDL) 摄取（巨噬细胞功能测定）

1. 按照前面所述的 AcLDL 制备、透析和 DiI 标记程序（Robinet等人，2013 年）。简而言之，将 1 μ L 的 DiI 库存（DMSO 中的 10 mg/mL）添加到微量离心管中的 700 μ L 的 PBS 中并涡旋井。将 350 μL 的 DiI/PBS 添加到 350 μL的AcLDL （范围通常为 2-4 mg 蛋白质/mL）中，并上下移液以混合（不要涡旋）。在 37 °C培养箱中摇动 25-30 分钟并旋转 10,000 × g 在 4 ° C下 2 分钟。用 0.22 μm滤膜对上清液进行过滤灭菌，并将 Dil-AcLDL 稀释至 0.75 mg 蛋白/mL 的浓度。

2. 将 500 μ L 的 Dil-AcLDL 添加到 7.5 mL 的 MDM（最终浓度：50 μ g/mL DiI AcLDL）。通过移液轻轻混合（不要涡旋）。

3. 将 1.5 mL 的 Dil-AcLDL 溶液添加到 6 孔 TC 板中第 3 阶段 ESDM 的每个孔中，并在 TC 培养箱中孵育30 分钟。

4. 吸出培养基，用 PBS 冲洗细胞一次，然后加入 PBS 为流式细胞术准备细胞。用细胞升降器分离细胞并通过 30 μ m 细胞过滤器以去除细胞团块。我们之前在第 3 阶段电镀后的第 3、5、7、9、11 和 13 天通过流式细胞仪测定了 DiI AcLDL 摄取，DiI+ ESDM 占 1.3%、2.4%、41%、68%、87% 和 96%细胞的数量（图 4A 和 4B），分别如前所述（Hai等人，2018）。

5. 要通过显微镜观察 DiI，请在室温下将 Dil-AcLDL 加载的粘附 ESDM 固定在 10% 磷酸盐缓冲福尔马林中 10 分钟。在 PBS 中冲洗细胞，并用 DAPI 溶液（ 1 mL PBS 中的 50 μL DAPI 封固剂）处理 10 分钟以染色细胞核。在 PBS 中冲洗并通过荧光显微镜观察细胞，使用 DiI 的罗丹明通道和 DAPI 的 UV 通道。结果如图 4C 所示。

图 4。 第 3 阶段 ESDM 测试了 DiI AcLDL 摄取。

AB。收获巨噬细胞祖细胞后不同天 DiI-AcLDL 阳性 ESDM 的流式细胞术。 A中， Y轴为侧向散射，X轴为DiI荧光强度（绿点为DiI阴性，红色为DiI阳性ESDM）。 C.载有 DiI-AcLDL 的 ESDM（收获后 13 天）用 DAPI 染色，并使用罗丹明和紫外线滤光片组通过荧光显微镜（40 ×物镜，20 μ m 比例尺）观察。

B. 巨噬细胞标志物

1. 检索完全分化（第 3 阶段电镀后 > 13 天） ESDM，用 PBS 清洗一次，并使用细胞升降器从板上分离。在 DMEM 中重悬巨噬细胞并通过 30 μ m 无菌过滤器以去除细胞团块。

2. 通过移液器彻底混合，以 500 × g离心5 分钟，吸出上清液。用 600 μL 的无酚红 DMEM 重悬细胞颗粒。将 100 μ L 的细胞悬浮液分配到微量离心管中。每管加入 1 μL小鼠 FcR 阻滞剂，孵育 15 分钟。然后将 5 μL 抗体 CD11c-Apc-Cy7、 Ly6C -PE 和 CD11b-PE-CF594，或 2 μL Ly6G -FITC 分别添加到每个管中（最终浓度 = 每种抗体的 0.01 μg / μL ） .使用一管细胞作为未染色的阴性对照。

3. 在黑暗中孵育 30 分钟至 1 小时。以 500 × g旋转细胞5 分钟并吸出上清液。在 300 μ L 的 PBS中洗涤细胞，降速，将细胞重悬在 200 μ L 的含有 2% FBS 的 PBS 中，并在 Fortessa 仪器上运行流式细胞仪，使用适合四种标记抗体的通道。使用 FlowJo 软件分析数据。结果如图5所示。分化细胞为CD11b阳性，CD11c二态性，Ly6C低，Ly6G阴性。

图 5. 细胞标记蛋白的流式细胞术。

使用了以下标记：巨噬细胞特异性 CD11b ( A )、CD11c ( B )、单核细胞制造商 Ly6C ( C ) 和中性粒细胞特异性标记 Ly6G ( D )。首先通过前向和侧向散射对细胞进行门控以仅选择单个细胞。红色痕迹用于未染色的 ESDM，蓝色痕迹用于染色 ESDM。

C. 其他巨噬细胞功能测试

1. 如前所述(Hai et al. , 2018)， ESDM 能够通过生物化学方法测量 AcLDL 介导的细胞游离和酯化胆固醇的积累。

2. 如前所述（Ritchey等人，2021）， ESDM 能够通过 IL-1β ELISA 评估炎症小体激活和 IL-1β 释放到培养基中。

食谱

1. 0.1% 明胶涂层溶液（表 1）

a. 将明胶粉加入 500 mL 瓶中，然后按如下所示加入无菌水。不要将瓶子装得太满，因为在灭菌过程中内容物会溢出。

b. 明胶粉在灭菌前不会溶解。盖松散盖的高压灭菌器。灭菌后溶液应澄清。

c. 让溶液冷却。拧紧盖子并在室温下储存。 6个月内使用。

表 1. 0.1% 明胶涂层溶液

2. 基础细胞培养基（用于 MEF 细胞和 L 细胞培养）（表 2）

a. 在无菌环境中混合以下所有成分。

b. 充分混合并在 4°C 下储存长达 4 个月。

表 2. 基础细胞培养基

3. MEF 细胞冷冻培养基（表 3）

a. 在无菌环境中混合以下所有成分。

b. 充分混合并储存在 4°C。 1个月内使用。

表 3. MEF 细胞冷冻培养基

4. 小鼠 ES 细胞培养基础培养基（表 4）

a. 在无菌环境中混合以下所有成分。

b. 通过 0.22 μm 过滤器对混合物进行消毒。

c. 储存于 4°C 并在 3 个月内使用。

表 4. 小鼠 ES 细胞培养基础培养基

5. 小鼠 ES 细胞完全培养基（表 5）

a. 在无菌环境中混合以下所有成分。

b. 储存于 4°C 并在 1 个月内使用。

表 5. 小鼠 ES 细胞完全培养基

6. 巨噬细胞分化培养基 (MDM) (表 6)

a. 在无菌环境中混合以下所有成分。

b. 通过 0.22 μm 过滤器对混合物进行消毒。

c. 储存于 4°C 并在 3 个月内使用。

表 6. 巨噬细胞分化培养基

7. 巨噬细胞维持培养基（表 7）

a. 在无菌环境中混合以下所有成分。

b. 通过 0.22 μm 过滤器对混合物进行消毒。

c. 储存于 4°C 并在 3 个月内使用。

表 7. 巨噬细胞维持培养基

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院赠款 P01HL029582 和 R01HL156499 的支持。这些方法源自Hai等人。 (2018) 和 Ritchey等人。（2021 年）。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

参考

1. Hai, Q.、Ritchey, B.、Robinet, P.、Alzayed, AM、Brubaker, G.、Zhang, J. 和 Smith, JD (2018)。巨噬细胞胆固醇代谢和 CRISPR/Cas9 编辑的定量性状位点作图暗示 ACAT1 截断作为因果修饰变体。 动脉硬化血栓血管生物学38（1）：83-91。

2. Luo, M.、Opoku, E.、Traughber, CA、Hai, Q.、Robinet, P.、Berisha, S. 和 Smith, JD (2021)。 Soat1 介导小鼠品系对胆固醇负荷诱导的内质网应激和巨噬细胞 CHOP 表达的影响。 Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids 1866（1）：158825。

3. Moore, KJ, Fabunmi, RP, Andersson, LP 和 Freeman, MW (1998)。体外分化的胚胎干细胞巨噬细胞：研究动脉粥样硬化相关巨噬细胞功能的模型系统。 动脉硬化血栓血管生物学18（10）：1647-1654。

4. 摩尔，KJ 和弗里曼，MW（1999 年）。胚胎干 (ES) 细胞衍生的巨噬细胞：促进巨噬细胞功能遗传解剖的细胞系统。 方法 Mol Med 30：343-355。

5. Ritchey, B.、Hai, Q.、Han, J.、Barnard, J. 和 Smith, JD (2021)。小鼠 pycard 基因 3' 非翻译区的遗传变异调节炎性体活性。生命 10：e68203 。

6. Robinet, P.、Ritchey, B. 和 Smith, JD (2013)。来自 2 种小鼠品系的巨噬细胞中自噬通量的生理差异调节胆固醇酯代谢。 动脉硬化血栓血管生物学33（5）：903-910。

7. Rojo, R., Raper, A., Ozdemir, DD, Lefevre, L., Grabert, K., Wollscheid-Lengeling, E., Bradford, B., Caruso, M., Gazova, I., Sanchez, A.等。 _ （2019）。删除 Csf1r 增强子选择性地影响 CSF1R 表达和组织巨噬细胞群的发育。 国家通讯10（1）：3215。

8. 怀尔斯，M. V (1993)。胚胎干细胞体外分化。 方法 Enzymol 225：900-918。

9. Yeung，ATY，Hale，C.，Xia，J.，Tate，PH，Goulding，D.，Keane，JA，Mukhopadhyay，S.，Forrester，L.，Billker，O.，Skarnes，WC，等。（2015 年）。条件就绪的小鼠胚胎干细胞衍生巨噬细胞能够研究巨噬细胞功能中的必需基因。 科学代表5：8908。

10. Zhuang, L., Pound, JD, Willems, JJLP, Taylor, AH, Forrester, LM 和 Gregory, CD (2012)。来自培养的胚胎干细胞的纯小鼠巨噬细胞群。应用于趋化性和凋亡细胞清除的研究。 J 免疫方法385（1-2）：1-14。